灵芝多糖对小鼠T细胞胞浆游离Ca^(2+)浓度和胞内pH的影响

目的通过考察灵芝多糖（ＧＬＰ）对免疫细胞信号转导过程的影响，探讨ＧＬＰ免疫调节作用机制。方法采用激光扫描共聚焦显微镜（ＬＳＣＭ）技术，动态监测ＧＬＰ均一体组分ＧＬＢ７对小鼠Ｔ细胞胞浆游离Ｃａ２＋浓度（［Ｃａ２＋）和胞内 ｐＨ（［ｐＨ］ｉ）的影响。结果 ＧＬＢ７（２０ｍｇ·Ｌ－１）引起小鼠 Ｔ细胞中［Ｃａ２＋］；和［ｐＨ］；明显升高，１ｍｉｎ即分别升高至３３４．７０％±１６，４％（ｎ＝３）、１７１．６％ ± １０．４％（ｎ＝３），之后一直分别维持在该平台期，至 １０ ｍｉｎ仍维持高峰水平。加入ＥＣＴＡ和 ｖｅｒａｐａｍｉｌ处理后， １０ ｍｉｎ ＧＬＢ７ 引起 Ｔ细胞［Ｃａ２＋］；和［ｐＨ］；分别升高为 ２０２．４％± １３．６％（ｎ＝３）。１４０．２％±７．８％（ｎ＝３），与正常对照组比较差异有显著性（Ｐ＜０．０1）。以 ＥＧＴＡ和 ｖｅｒａｐａｍｉｌ处理后，再分别以 ｈｅｐ－ｅｒｉｎ和 ｐrocaine处理细胞 １０ ｍｉｎ，之后以 ＧＬＢ７刺激Ｔ细胞，１０ｍｉｎ［Ｃａ２＋］ｉ值分别为１５１．５％±９．４％（ｎ＝３）、１４３．２％± ８．１ ％（ ｎ＝ ３），与 ＥＧＴＡ和 ｖｅｒａｐａｍｉｌ处理组相比差异有显著性（ Ｐ＜ ０．０１）。

胞浆Ca^(2+)和某些激酶对NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用

为澄清中性粒细胞胞浆 Ca2 +和某些 O-·2 产生相关激酶对 NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用 ,利用分化为中性粒细胞样的 HL- 60细胞研究了胞浆 Ca2 +螯合剂 BAPTA- AM和激酶抑制剂对这些激酶激活、NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的影响 .使用 1 0 μmol/L的 Ca2 +螯合剂 BAPTA- AM去除胞浆 Ca2 +后 ,趋化肽 f MLP诱导的 O-·2 产生明显减少 ,但不影响 f MLP诱导的肌动蛋白聚合 ;8μmol/L的 PKC激酶抑制物 GF1 0 92 0 3x几乎完全抑制 O-·2 产生 ;50 μmol/L的p38激酶抑制物 SB2 0 3580、50 μmol/L的 ERK激酶抑制物 PD0 980 59和 0 .1 μmol/L的 PI3激酶抑制物渥曼青霉素 (Wortmannin)使 f MLP诱导的 O-·2 产生大约减少一半 ;其中 Wortmannin还抑制 f MLP诱导的肌动蛋白聚合 ;f MLP刺激细胞后 ,PI3- K、p38和 ERK激酶迅速激活 ,但这些激酶的激活对 Ca2 +是非必需的 .这些结果说明 Ca2 +依赖途径 (PKC)和 Ca2 +非依赖途径 (PI3- K、p38和ERK)对 NADPH氧化酶激活都起着重要作用 ,而 Ca2 +非依赖途径中的 PI3- K激酶还参与中性粒细胞样 HL- 60细胞的肌动蛋白聚合 .

内毒素所致DIC时血小板胞浆Ca^(2+)浓度变化的研究

本实验观察内毒素在体外对兔血小板胞浆游离钙浓度[Ca^(2+)]i的作用以及用二次注射内毒素法复制DIC模型时对[Ca^(2+)]i的影响。结果表明静息血小板[Ca^(2+)]i为112±24 nM,内毒素可直接作用于血小板,使[Ca^(2+)]i呈剂量依赖性升高。内毒素致DIG时(Ca^(2+)]i可升高三倍。结果提示内毒素可能是通过升高血小板[Ca^(2+)]i而激活血小板。血小板的激活可能是导致DIC的重要发病机制之一。

三氧化二砷、地塞米松和沙利度胺对骨髓瘤细胞U266凋亡及胞浆内Ca^(2+)浓度的影响

为了探讨三氧化二砷(As2O3)、地塞米松(dexamethasone,Dex)和沙利度胺(thalidomide,Thal)诱导骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡时对胞浆内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响,用含15%FBS的RPMI1640培养液培养U266细胞并按5×105/(ml.well)接种于24孔板中,分别用不同浓度的As2O3、Dex和Thal干预8小时后收集U266细胞,用荧光显微镜观察细胞凋亡,以AnnexinV-FITC/PI双参数流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,负载Fluo-3/AM荧光素FCM检测[Ca2+]i。结果显示:①随As2O3、Dex和Thal浓度增加,荧光显微镜下带有荧光信号的凋亡细胞逐渐增多;②As2O3、Dex和Thal作用U266细胞后FCM测得凋亡细胞比例从对照组的0.56%分别升至31.54%、28.35%、21.97%;③As2O3、Dex诱导U266细胞凋亡时[Ca2+]i升高,升高的程度与药物浓度成正比关系;④Thal诱导细胞凋亡时未观察到[Ca2+]i有明显改变。结论:[Ca2+]i的升高是As2O3、Dex诱导U266细胞凋亡的机制之一,Thal诱导U266细胞凋亡与[Ca2+]i的变化无明显关系。

蛋白酶体抑制剂PS-341诱导U266细胞凋亡与胞浆内[Ca^(2+)]变化的关系

目的探讨蛋白酶体抑制剂PS-341(Bortezomib)诱导骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡时对其胞浆内[Ca2+]([Ca2+]i)的影响。方法以浓度梯度的PS-341干预U266细胞4h后收集,荧光显微镜观察细胞凋亡,AnnexinV-FITC/PI双参数流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,Fluo-3/AM荧光素标记FCM检测[Ca2+]i。结果(1)PS-341作用U266细胞4h后荧光显微镜观察到凋亡细胞数随浓度增加而增多;(2)FCM检测凋亡细胞的比例分别为0.56%、7.71%、19.84%、31.10%、40.72%,与PS-341浓度成正比;(3)PS-341作用后U266细胞[Ca2+]i均值分别为403.65nmol/L、418.20nmol/L、378.65nmol/L、356.36nmol/L、349.21nmol/L;(4)PS-341诱导U266细胞凋亡时伴随[Ca2+]i的改变,浓度>50nmol/L时诱导的细胞凋亡伴随[Ca2+]i下降。结论蛋白酶体抑制剂PS-341诱导骨髓瘤细胞凋亡呈浓度依赖性;PS-341浓度>50nmol/L时下调[Ca2+]i,并由此发挥抗骨髓瘤细胞作用。

雌激素对大鼠主动脉组织细胞色素C、线粒体Ca^(2+)、胞浆游离Ca^(2+)水平的影响

目的:研究雌激素对大鼠主动脉组织细胞色素C、线粒体C a2+、胞浆游离C a2+水平的影响,以探讨雌激素对心血管系统的保护作用。方法:将30只雌性大鼠随机分为三个组,假手术组(A组)、去卵巢组(B组)及去卵巢+雌二醇治疗组(C组),每组各10只。正常饮食后处死大鼠,对主动脉组织细胞色素C、线粒体C a2+、胞浆游离C a2+的水平进行测定。结果:去卵巢模型组同去卵巢+雌二醇治疗组相比,线粒体C a2+、细胞色素C含量明显降低(P<0.05;P<0.01),而胞浆内细胞色素C含量则明显升高(P<0.05)。结论:雌激素可能是通过调节细胞色素C、线粒体C a2+、胞浆游离C a2+水平,清除自由基、从而减少氧化应激对心血管系统的损伤作用。

模拟失重增强大鼠脑动脉血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道功能

本工作旨在探讨短期模拟失重大鼠脑动脉血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)大电导钙激活钾通道(largeconductancecalcium-activatedpotassiumchannels,BKCachannels)功能的改变。以尾部悬吊大鼠模型模拟失重对脑血管的影响。应用激光扫描共聚焦显微镜测定VSMCs胞内游离钙浓度([Ca2+]i);采用细胞贴附模式,记录BKCa通道的单通道活动。结果表明,模拟失重1周后,大鼠脑动脉VSMCs的[Ca2+]i比对照组显著升高(P<0.05);BKCa通道的开放概率(Po)与平均开放时间(To)显著增加(P<0.05),而单通道电导与平均关闭时间(Tc)则无显著变化。总之,1周模拟失重可引起脑动脉VSMCs的BKCa通道功能显著增强,且与细胞[Ca2+]i的升高同步出现。结果提示,脑动脉VSMCs的离子通道机制可能参与介导模拟失重引起的脑血管适应性变化。

FMLP刺激HL-60细胞NADPH氧化酶激活的信号转导途径

目的澄清中性粒细胞中 [Ca2 + ]i 及某些激酶在 NADPH氧化酶激活中的作用和 NADPH氧化酶激活的信号转导途径。方法利用中性粒细胞样 HL- 60细胞 ,研究 [Ca2 + ]i 和某些激酶对 f ML P刺激 NADPH氧化酶激活的影响。结果用 10μm ol/ L BAPTA- AM去除 [Ca2 + ]i 后使 O- 2 生成明显减少 ;8μm ol/ L的 PKC抑制物 GF10 92 0 3 x显著地抑制了 O- 2 产生 ;5 0 μmol/ L 的 p3 8抑制物 SB2 0 3 5 80、5 0 μm ol/ L 的 ERK抑制物 PD0 980 5 9和 0 .1μm ol/ L 的 PI3K抑制物 Wortm annin使O- 2 产生受到不同程度抑制 ;PKC、PI3K、p3 8和 ERK激活对 [Ca2 + ]i 升高没有影响 ;[Ca2 + ]i、PKC和 PI3 K对 p3 8激活有一定作用 ,而 ERK和 Akt激活主要受 PI3- K的调控。结论试验说明 [Ca2 + ]i 依赖途径 ( PKC)和 [Ca2 + ]i 非依赖途径 ( PI3K、p3 8和ERK)对

酸性刺激对大鼠骨骼肌细胞胞浆Ca^(2+)的影响

研究表明,运动引起胞浆Ca2+聚积是骨骼肌疲劳的重要原因。从研究酸性刺激时胞浆Ca2+的变化入手,从细胞水平分析急性运动可能对骨骼肌胞浆钙稳态的影响,试图为全面了解运动性疲劳的产生机制提供理论依据。实验中以Fluo-3-AM为Ca2+荧光指示剂,通过激光扫描共聚焦显微镜系统对用体外组织分离和培养的方法获得的单个的骨骼肌细胞胞浆Ca2+的荧光强度及其动态变化进行观察。结果发现:骨骼肌细胞受到酸性刺激时,胞浆Ca2+稳态被破坏。其总体变化趋势是先略有增加后迅速减少,直至在比正常低的水平上形成新的动态平衡。钙波的变化既有振幅的变化,也有频率的变化。这可能提示:运动后,由于内环境酸性代谢产物的堆积,致使胞浆Ca2+稳态破坏,最终引起骨骼肌疲劳。

胞浆内Ca^(2+)浓度的变化在顺铂诱导的肝癌HepG2细胞凋亡中的作用

目的探讨胞浆内的Ca^(2+)在顺铂诱导的肝癌HepG2细胞凋亡过程中的作用及其可能机制。方法体外培养人肝癌HepG2细胞,分组并按实验目的加药,检测胞浆内Ca^(2+)浓度的变化和Grp78蛋白的表达;MTT法检测细胞的活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果顺铂诱导了肝癌HepG2细胞内胞浆Ca^(2+)表达增加,促进细胞凋亡,同时也上调了Grp78蛋白的表达。与顺铂组相比,顺铂联合BAPTA/AM或2-APB降低了顺铂诱导的胞浆Ca^(2+)浓度,减弱了顺铂对细胞的增殖抑制作用和Grp78蛋白的表达。结论顺铂诱导HepG2细胞发生内质网应激,导致Ca^(2+)从内质网释放,使胞浆内Ca^(2+)上调,并进一步诱导内质网应激介导的凋亡。

小鼠脑细胞游离钙在电针及药物镇痛过程中的转运机理探讨

目的:进一步探讨针刺及给药过程中细胞内钙转运的机制。方法:向小鼠脑室注射CaCl2和钙通道阻断剂异博定,用离子探针Fura-2-AM配合高敏度双波长荧光分光光度计分别测定异博定和氯化钙对电针及药物镇痛效果及小鼠下丘脑和导水管周围灰质区细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i的变化。结果:向小鼠脑室或腹腔注射CaCl2和异博定均可以抑制电针的镇痛效果。结论:电针镇痛时细胞内的游离钙可能通过细胞膜钙通道排到细胞外。

电针对失血性低血压家兔心肌细胞游离钙镁浓度的影响

用ＡＲ－ＣＭ－ＣＯＭ阳离子测定系统和离子探针Ｆｕｒａ－２－ＡＭ及Ｆｕｒａｐｔｒａ－ＡＭ，观察了电针在治疗家兔实验性低血压时心肌细胞内游离钙离子浓度（［Ｃａ^（２＋）］ｉ）和游离镁离子浓度（［Ｍｇ^（２＋）］ｉ）的变化情况。股动脉放血造成家免失血性低血压，心肌细胞［Ｃａ^（２＋）］ｉ随血压降低而降低，［Ｍｇ^（２＋）］ｉ则升高，［ Ｃａ^（２＋）］ ｉ／［ Ｍｇ^（２＋）］ ｉ比值减小；电针拟“人中”、“承浆”穴位后，治疗组家兔血压及［ Ｃａ^（２＋）］ ｉ均明显高于低血压对照组，［Ｃａ^（２＋）］ｉ／［ Ｍｇ^（２＋）］ ｉ比值相应增大；电针对正常家兔心肌细胞［Ｃａ^（２＋）］ｉ和［Ｍｇ^（２＋）］ｉ均无明显影响。结果提示心肌细胞内游离Ｃａ^（２＋）、Ｍｇ^（２＋）在针刺调整血压的过程中起着一定的作用。

大鼠肺动脉平滑肌细胞培养及对不同类型激动剂刺激产生的反应

目的分离和培养SD大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCc），并检测其功能状态。方法显微分离肺内小动脉，并在含胶原酶（1750 U·mL^-1）和木瓜蛋白酶（9．5U·mL^-1）的低钙HBSS溶液中酶解和培养PASMCs，采用动态细胞荧光成像技术检测PASMCs胞浆游离Ca^2＋浓度（[Ca^2＋]i）的变化。结果在18～24h内可获得PASMCs，并可观察到环匹阿尼酸和5-HT可引起PASMCs[Ca^2＋]i的升高效应。结论大鼠PASMCs一步酶消化法，方法简便实用。所分离的PASMCs细胞形态和功能正常，适用于动态细胞荧光成像技术检测实验及PASMCs信号转导功能的研究。

局部麻醉药对人类神经元的细胞毒性

背景局部麻醉药（LAs）除了能抑制外周神经兴奋性传递作用，对中枢神经系统、心血管系统、神经肌肉接头及细胞代谢还具有毒性作用。手术后多种神经并发症都可归因于LAs的细胞毒性作用，但其作用机制尚不清楚。临床上使用的局部麻醉药浓度远远大于其抑制离子通道作用的EC50，离子通道阻滞这一单一因素不足以解释LAs诱导细胞死亡的所有原因，因为其他因素也可能参与其中。本研究比较了6种常用局部麻醉药的细胞毒性，并探讨其毒性作用的可能机制。方法将人类SH—SY5Y神经母细胞分别浸泡在6种局部麻醉药中（布比卡因、罗哌卡因、甲哌卡因、利多卡因、普鲁卡因和氯普鲁卡因），通过MTT[3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑澳盐]光度计法定量，LIVE／DEAD（钙黄绿素／AM和溴乙啶二聚体-1）荧光成像检测方法定性测量它们的差异。此外采用荧光半胱天冬酶抑制剂（FLICA^TM）测定半胱天冬酶-3／-7的活性测定凋亡活性，同时还研究了局部麻醉药对极化和碳酰胆碱诱导细胞内钙反应的作用。结果（1）用局部麻醉药处理细胞10分钟后，6种局部麻醉药均呈浓度依赖地降低了细胞活性。杀伤力为普鲁卡因≤甲哌卡因〈利多卡因〈氯普鲁卡因〈罗哌卡因〈布比卡因（根据所得LD50，即致50％细胞死亡的浓度）。在所有局部麻醉药中，只有布比卡因和利多卡因随着浓度的增加而能够杀灭所有细胞。（2）布比卡因和利多卡因均激活了半胱天冬酶-3／-7，所需浓度利多卡因高于布比卡因，但布比卡因激活半胱天冬酶的速度较利多卡因迟缓。高浓度利多卡因能立即诱发半胱天冬酶活化，但浓度低于10mM时不产生该作用。（3）普鲁卡因和氯普鲁卡因浓度依赖性地抑制去极化或受体激活诱发的胞浆Ca^2＋反应，并与以往研究中发现的布比卡因、罗哌卡因、甲哌卡因和利多卡因的作用方式相类似。没有一种局部麻醉药能够显著增加基础状态和Ca^2＋诱发的胞浆Ca^2＋浓度变化。结论局部麻醉药导致细胞迅速死亡，主要原因是细胞坏死。利多卡因和布比卡因可以通过延长作用时间或增加浓度来触发细胞凋亡，这些作用可能与手术后神经损伤有关。虽然利多卡因不是本研究模型中毒性最强的局部麻醉药，但是它诱发一过性神经性症状的概率最高，而毒性最高的布比卡因却极少造成一过性神经性症状。这提示不同的局部麻醉药可能通过不同机制，以及作用于神经元以外的其他靶点而产生细胞毒性神经损伤。