胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin通过激活PI3K/Akt通路抑制HBV转基因小鼠特异性CTL凋亡

目的探讨胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白通过激活PI3K/Akt信号通路抑制HBV转基因小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)凋亡。方法 HBV转基因小鼠随机分组,100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin、50μg CTPHBcAg18-27-Tapasin、50μg CTP-HBcAg18-27及生理盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次。流式细胞仪检测脾细胞中胞内细胞因子水平及细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR表达的变化。结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.74±0.20)%,高于对照组50μg CTP-HBcAg-18-27-Tapasin(2.42±0.53)%及50μg CTP-HBcAg18-27(1.70±0.56)%和空白组(0.66±0.71)%(F=741.45,P=0.000);同时,100μg CTPHBcAg18-27-Tapasin融合蛋白有效抑制特异性CTL凋亡(6.29±0.02)%,低于对照组50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin(7.72±0.15)%及50μg CTP-HBcAg18-27(26.30±1.13)%和空白组(58.26±0.23)%(F=5313,P=0.000),并伴随凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR上调(F=52.61、18.32和94.18,P<0.05)。结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin能有效诱导HBV转基因小鼠特异性CTL的表达,抑制其凋亡,机制与PI3K/Akt通路的激活有关。

胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用

目的观察融合蛋白胞质转导肽（CTP）-HBcAg18-27-Tapasin诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞（Dc）成熟和对T淋巴细胞增殖的作用。方法体外分离、培养近交系BALB／c小鼠髓源性DC，加入重组粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和IL-4培养5d，再加入脂多糖诱导成熟。10,ug／LCTP—HBcAg18-27-Tapasin、50,ag／LCTP—HBcAg18-27-Tapasin、10p．g／LCTP-HBcAg18-27及RPMI-1640培养液加入培养介质。流式细胞术测定DC表面分子表达，EusA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平，细胞计数试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应，流式细胞术检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子。多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。结果成功体外诱导小鼠髓源性DC；CTP—HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD86及主要组织相容性复合体-1分子的表达；509g／LCTP—HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平为（61．12±10．25）pg／mL，依次高于10／xg／LCTP-HBcAg18-27-Tapasin组的（50．43±10．42）pg／mL、10〉g／LCTP-HBcAgl8m组的（40．17±8．54）pg／mL和空白组的（30．51±8．03）pg／mL（F=15．85，P=0．030和P=0．037）；CTP—HBcAg18-27-Tapasin诱导DC刺激T淋巴细胞增值能力明显高于对照组；流式细胞仪检测融合蛋白诱导的CTL水平50μg／LCTP-HBcAg18-27-Tapasin组为（2．05±0．41）％、10μg／LCTP-HBcAg18-27-Tapasin组为（1．06±0．10）％，高于10〉g／LCTP-HBcAg18-27组的（O．45±0．11）％和空白组的（O．09±0．02）％（F=60．22，P=0．003）。结论CTP-HBcAg18-27-Tapasin可以促进DC的分化、成熟，增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力并能增加CTL的表达。

胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞抑制转基因小鼠HBV复制

目的 探讨经分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg18-27经CTP转导体内诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HBV转基因小鼠病毒的抑制作用. 方法 20只HBV转基因小鼠随机分组,100 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin,50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasi,50 μg CTP-HBcAg18-27及等渗盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次.流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平,微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测血清中HBsAg水平,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBVDNA水平,肝脏HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg表达.数据用均数±标准差((x-)±s)表示,用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法. 结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.70％±0.20％),其水平高于对照组50 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin (1.66％±0.53％)及50μg CTP-HBcAg18-27 (1.26％±0.56％)和空白组(0.75％±0.71％),F=741.45,P=0.000.肝脏HE染色及免疫组织化学结果显示实验组肝组织中炎性细胞的数量明显增多及HBsAg的表达显著减少,同时对小鼠血清中HBsAg及HBV DNA有明显的抑制作用. 结论 分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg 18-27经CTP转导免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量,显著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg的表达.

胞质转导肽-HBcAg_(18-27)-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用

目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法:体外分离、培养HBV转基因小鼠及近交系C57BL/6小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(interleukin,IL)-4培养5d,再加入实验组10μg/mL CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组10μg/mL CTP-HBcAg18-27、10μg/mL HBcAg18-27-Tapasin及空白组RPMI1640完全培养液.流式细胞术测定DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞仪检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.结果:体外成功诱导小鼠髓源性DC;CTP-HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达;并且CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平及诱导DC增殖T淋巴细胞增殖能力明显高于对照组及空白组[IL-12p70转基因小鼠(F=205.85,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=406.20,P=0.000)];流式细胞仪检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平也高于对照组[转基因小鼠(F=155.45,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=392.90,P=0.000)],同时HBV转基因小鼠DC表面分子及在T淋巴细胞增殖中的作用要比C57BL/6小鼠低.结论:分子伴侣Tapasin修饰胞内化抗原肽能促进HBV转基因小鼠髓源性DC的分化、成熟,并能增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及诱导CTL的产生.