四株胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种新菌株的分离鉴定

采用棋盘式取样法,从正茬、重茬、连作2年和连作3年的马铃薯播前、现蕾期、成熟期和收获期4个不同阶段采集马铃薯根围土样。以稀释平板法,用选择性培养基CVP分离软腐欧文氏杆菌,共得到42个菌株。在形态学观察和生理生化特性测定的过程中发现编号为GAUP-b410、GAUP-b492、GAUP-b416和GAUP-d34等4个菌株的主要性状一致,且与其他菌株的性状不同。致病性测定结果显示,这4个菌株均能引起马铃薯薯片腐烂。对其中的2个菌株进行了16S rDNA序列分析,其PCR产物的序列与GenBank上登记的18个分离自中国大白菜上的Erwinia carotovorasubsp.carotovora菌株的亲缘关系最近,同源性均达99%。利用DNAStar软件绘制系统发育树状图,菌株GAUP-b410亦与这18个E.carotovorasubsp.carotovora菌株位于系统发育树的同一分支,聚为一类;菌株GAUP-b492与其中的16个E.carotovorasubsp.carotovora菌株位于系统发育树的同一分支,聚为一类;结合生理生化特性和16S rDNA序列分析,确定这4个菌株为胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种(E.carotovorasubsp.carotovora)新菌株。

胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种Ecb菌株表达的一种Harpin蛋白

1986年,hrp基因被首次报道。由于Wei等（1992）从梨火疫病菌（Brwinia amylovora）中分离出了能激发过敏反应的HarpinEa蛋白,细菌所产生的Harpin分子受到了同行的重视。基于对Harpin蛋白的深入研究,国外已研制出了相关新型、高效、安全的生物农药。近年来,国内涉及Harpin蛋白结构与功能的研究课题组逐年增多,并在某些方面取得了较好的进展。

一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌的分离和鉴定

从大白菜软腐组织中分离出一株软腐病细菌BC1,经过形态观察、生理生化特性分析、致病性检测和 16SrDNA序列分析 ,该分离物被鉴定为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种 (Erwiniacarotovorasubsp .carotovora ,Ecc)的一个新菌株 ,编号为BC1。这是首次从 16SrDNA序列水平上对在我国分布的软腐欧文氏菌进行鉴定。EccBC1的 16SrDNA序列与其它软腐欧文氏菌株的 16SrDNA序列之间同源性达 98 7%～ 99 3% ,而且在系统发育树中独立于Ecc其它菌株。序列分析结果表明 ,EccBC1具有至少 2种不同的 16SrDNA序列 ,它们都在第 4 5 9位和 4 73位 (相对于大肠杆菌 16SrDNA序列 )发生碱基突变 ,同一基因中两个突变位点之间彼此互补 ,处于 16SrRNA螺旋H17颈部 ,而且这两处碱基变异只存在于BC1菌株中。通过与其它软腐欧文氏菌亚种和菌株 16SrDNA序列进行比对分析 ,还进一步鉴定出一些BC1菌株特异的 16SrDNA碱基突变位点。本文报道的EccBC1两个 16SrDNA序列在GenBank中的登录号分别为AY30 90 6 8和AY30 90 6 9。

胡萝卜软腐欧文氏菌分子检测技术的研究

胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种Erwinia carotovorasub sp.carotovora(Ecc)是引起魔芋和马蹄莲软腐病的主要病原细菌.本研究根据细菌L-氨基酸渗透酶同源基因设计URP核苷酸序列特异性引物进行普通PCR、巢式PCR,同时采用细菌16S-23S rDNA间的ITS序列设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR,对样品中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌进行检测,并比较了3种检测方法的特异性和灵敏度.结果表明,应用实时荧光PCR方法检测样品,其中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌的最低菌悬液浓度可达10 cfu/mL;巢式PCR灵敏度也可检测到10 cfu/mL;而用普通PCR最低可检测到103cfu/mL.用实时荧光PCR和巢式PCR方法检测病菌,其灵敏度都比常规PCR提高了100倍,且实时荧光PCR方法更快速、简便、安全、准确,不需PCR的后续处理.实时荧光PCR方法适用于种苗、种球等检测领域.

胡萝卜软腐欧文氏菌CXJZU-120的选育及其脱胶性能研究

为寻求更适宜于生产应用的麻类生物脱胶高效菌株,对苎麻脱胶菌株CXJZ95-198进行紫外诱变,存活菌株的生理特性研究和脱胶功能实验发现:紫外线处理120 s获得的变异菌株CXJZU-120性状稳定;在5.5～6.0 h完成苎麻脱胶,总胶质脱除率达87.22%;该菌经10.0 h培养,发酵液中的果胶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶活分别为211.2 U/mL、374.8 U/mL和96.6 U/mL;该菌株在固态培养基中培养16.0～17.0 h开始显棕褐色,液态发酵培养基中培养5.0～5.5 h开始显蓝绿色,接种到苎麻上发酵5.0～5.5 h开始显蓝色。该结果表明,变异菌株CXJZU-120与出发菌比较,不仅在脱胶功能和产酶性能上有所提高,而且繁殖速度快,发酵时具有特别的显色现象,对于该菌在生产中的应用具有重要意义。

无机盐和碳氮源对噬夏孢欧文氏菌积累类胡萝卜素的影响

供试的8种无机盐中,MgSO_4的单因子效应最好,可促进噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的生长和类胡萝卜素合成。在供试的4种碳源中,葡萄糖是最适碳源。噬夏孢欧文氏菌不能利用无机氮源,在供试的有机氮源中以酵母膏最有利于类胡萝卜素合成。培养基中的含碳量保持在2．45～4．90g/L,含氮量保持在1．60～2．40g/L时,对噬夏孢欧文氏菌生长和类胡萝卜素合成均为有利,培养基的最适C:N为2．5:1。类胡萝卜素稳定性的初步实验证明,所得到的类胡萝卜素丙酮溶液在常温下稳定性较差,容易分解。高效液相色谱法(HPLC)测定结果表明,从噬夏孢欧文氏菌细胞得到的天然色素成分比较复杂,在菌体中共检测到11种色素成分。

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI)。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8 kD,与预期分子量相符。经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致。

几种杀细菌剂对胡萝卜软腐欧文氏菌的毒力测定

采用室内抑菌圈法测定了6种杀细菌剂对胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫病亚种(Erwiniacaroto-vorasu sp.atroseptica)的毒力,筛选出2种有明显抑菌作用的药剂72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂和90%链霉素.土可溶性粉剂,抑菌效果显著,EC50分别为0.0921mg.mL-1和0.0972mg.mL-1。

胡萝卜软腐欧文氏菌CSSY002菌株hrpN基因的克隆、鉴定及其表达产物Harpin蛋白的活性分析

从感染软腐病的胡萝b组织中分离出胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝b亚种（ Erwinia carotovora subsp, carotovora）CSSY002菌株．用该菌株接种非寄主植物烟草不能引起过敏反应．构建CSSY002菌株的基因组文库，应用α-P^32标记的hrpN基因作探针，通过菌落原位杂交技术从该文库中筛选到1．5～2．0 kb的hrpN-like阳性克隆，进一步将该片段亚克隆到pBluescript—II SK（＋）载体中，进行核苷酸序列测定．结果表明，hrpN-like基因（即hrpNCSSY002基因）的开放阅读框（ORF）为1071bp，其核苷酸序列已在Genbank注册，登录号为bankit AY999002．hrpN-like基因的编码产物Harpin—like蛋白（即HarpinCSSY002蛋白）由356个氨基酸残基组成，分子量为36．64×10^3，等电点pI5．9．将hrpN—like基因构建到表达质粒pET-28a（＋）的17强启动子下，并转化到大肠杆菌工程菌JM109（DE3）细胞中，经WTG（异丙基硫代-β-D半乳糖苷）诱导获得Harpin-like蛋白的高效表达，并通过接种烟草叶片的过敏反应检测Harpin—like蛋白的生物学活性．

软腐欧文氏菌代谢网络重构及其在靶标筛选中的应用

欧文氏杆菌(Erwinia)是一类重要的农作物致病细菌,侵染宿主范围广,在世界范围内造成了严重的经济损失,其中Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 (Eca SCRI1043) 可导致马铃薯感染黑胫软腐病,危害极大。本文构建了Eca SCRI1043基因组的代谢网络,并进行拓扑结构和流平衡分析,以此筛选出网络的中心节点。若中心节点所代表的酶收录在TTD数据库中,则此酶可作为农用杀菌剂的候选靶标。随后选取靶标十一异戊二烯焦磷酸酶(Upps),采用specs公司的商品化合物数据库作为小分子数据库,对靶标进行高通量虚拟筛选,对综合打分结果最好的前400个化合物进行目筛后得到73种先导化合物,这73种先导化合物可以进一步进行后续生测实验以确定其杀菌活性。

两种细菌对十二个洋葱品种的致病性测定

以嘉峪关市当地12个洋葱品种为试材,将分离自洋葱的胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumsub sp.carotovorum)和格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)2种病原细菌接种,在室内进行品种离体鳞茎的致病性测定。结果表明:2个菌株对不同品种洋葱鳞茎均有致病性,其中胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的致病性最强,且2个菌株均对洋葱基部的致病力强于顶部。同时不同的细菌对不同品种的洋葱在不同部位的致病力表现不同,其中格式沙雷氏菌对"丰收2号"、"金美"和"红色经典"3个品种在顶部的致病性最弱,病情指数最低分别达到2.78、8.33和11.11,同时对"太阳格林"、"金美"2个品种在基部的致病性弱,病情指数均为27.78。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种对"雄狮"在顶部的致病性最弱,病情指数最低为8.33,对"雄狮"和"红色经典"2个品种在基部的致病性最弱,病情指数分别为36.11和38.89。

芋头软腐病拮抗菌的筛选及生防效果研究

分别从蔬菜田土壤和采后芋头表面黏附土壤中分离纯化到267和244株菌株,通过平板拮抗实验,发现其中6个菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)产生了清晰且明显的拮抗圈(直径>10 mm)。利用芋头对它们的生物防控效果进行复筛,结果发现BGP14菌株发酵液处理芋头的发病率仅为6.7%,显著低于其他5个菌株(P<0.05)。根据BGP14的形态学特征、芽孢产生及16S rRNA和gyrB基因的部分核酸序列,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌BGP14(Bacillus amyloliquefaciens)。BGP14在芋头伤口上具有较强的定殖能力,并将病原菌Ecc的群体数量压制在一个较低水平。BGP14与病原菌Ecc联合处理芋头的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性显著高于其他处理。以上结果表明,解淀粉芽孢杆菌BGP14对病原菌E.carotovora具有强大的拮抗活性,能够有效防治贮藏期芋头软腐病,具有潜在的应用开发前景。

解淀粉芽孢杆菌BGP20-γ的诱变选育及生防效果

胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)引起的细菌性软腐病是导致采后蔬菜腐败的主要原因之一,前期研究发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BGP20对该病害具有较好的生防效果。为了进一步提高BGP20对采后蔬菜细菌性软腐病的生防效果,本研究利用60Co辐照诱变技术,对该菌株进行诱变选育。结果表明,在200-800 Gy剂量范围内,60Co对BGP20的致死率随着辐照剂量的增加而迅速上升。600 Gy剂量的60Co辐照致死率为78.3%,选用该剂量进行诱变选育。利用辣椒对409株突变菌株的生防效果进行活体评价,获得1株生防效果显著提高的突变菌株BGP20-γ(P<0.05)。与野生型菌株BGP20相比,利用突变株BGP20-γ处理的辣椒伤口腐烂面积下降64.4%,其在辣椒伤口上的定殖能力显著提高,将病原菌Ecc的群体数量限制在一个更低的水平。

风信子软腐病病原的鉴定和杀菌剂试验

在上海生长的风信子发生软腐病的球茎中分离了菌株EP,对纯化的菌株EP进行传统方法鉴定;并进行16SrDNA序列同源性分析,结果表明EP与Erwinia carotovorasubsp.carotovora同源性达到97%,确定风信子软腐病病原为Erwinia carotovora subsp.carotovora。风信子软腐病病菌在不同杀菌剂浓度下的生长试验表明,杀毒矾抑菌效果最好,有效浓度0.64×10-6g/mL时细菌停止生长,其次为吗啉胍乙铜和农用链霉素可溶性粉剂,有效浓度分别为2×10-4g/mL和5.76×10-4g/mL时,细菌停止生长。

拮抗软腐病菌的魔芋内生细菌多样性研究

生活在魔芋组织中的内生细菌具有拮抗魔芋软腐病病菌的潜力。通过组织分离法从魔芋块茎中分离得到内生细菌,用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用,使用肠杆菌重复居间序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction,ERIC-PCR)方法研究其遗传多样性。结果表明,从魔芋块茎中分离得到35株内生细菌,35株内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性,ERIC-PCR指纹图谱显示35株内生细菌在Watson距离为0.60时可分为4个ERIC群和4株独立成群菌株,表明35株拮抗性内生细菌的遗传多样性明显。

荆州魔芋软腐病及其病原菌初步研究

荆州魔芋软腐病发生始期在6月上旬,随后发病速度加快,7月中下旬至8月中下旬为盛发期,9月上旬终止,病株死亡率达68.82%。经鉴定病原菌为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜致病变种(Erwiniacarotovorapv carotovora),该菌10～40℃内均能生长,适温范围20～35℃。

Ecc36菌株hrpN基因的克隆、表达及HrpN_(EccPR)蛋白的生物学活性

为了揭示hrp基因表达的Harpins蛋白能够广泛地诱导植物对植物病虫害防卫反应的分子机制,通过琼脂固体平板法,发现胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株具有很高的胞外酶分泌活性,该菌接种非寄主植物烟草,能够引起过敏反应(HR),结果表明,Ecc36携带hrp基因。用地高辛标记的hrp N基因作探针,通过Southern杂交证明了Ecc36菌株中含有hrp N基因,命名为hrp NEcc PR基因;核苷酸序列分析表明,hrp NEcc PR基因的开放阅读框ORF为1 254 bp,编码的Harpin蛋白(命名为HrpN_(EccPR)蛋白)由417个氨基酸残基组成,其分子量为45.27 ku,等电点为5.73,与其他几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性。此外,将hrp NEcc PR基因克隆到表达载体p ET28a(+)上,将构建的hrp NEcc PR基因表达载体(p ET30a-Ecc PR)转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导HrpN_(EccPR)蛋白表达,纯化后的HrpN_(EccPR)能诱导烟草发生过敏反应,表明HrpN_(EccPR)蛋白具有激发植物免疫反应的生物活性,可为进一步研究HrpN_(EccPR)蛋白诱导植物防卫反应的机制奠定基础。

EcbCSL101菌株hrpN基因的克隆、表达及HarpinEcbCSL101蛋白的生物学活性

胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种(Erwinia carotovora subsp.betavasculorum)EcbCSL101菌株具有很强胞外酶分泌活性,接种非寄主植物烟草引起过敏反应。Southern blotting结果表明EcbCSL101菌株中含有hrpN基因。PCR扩增含EcbCSL101完整开放阅读框的DNA片段并克隆到表达载体pET28a(+)中。核苷酸序列分析表明,EcbCSL101菌株的hrpN基因的ORF为1113bp,编码36.65 kD HarpinEcbCSL101蛋白(GenBank,DQ355519),与其它几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性。将含有hrpNEcbCSL101基因的重组质粒转化到大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达,纯化后的HarpinEcbCSL101能诱导烟草发生过敏反应。

魔芋内生细菌抗软腐病菌株筛选

通过组织分离法从魔芋块茎中分离得到内生细菌,用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用,以筛选拮抗软腐病菌能力强的菌株。结果显示从魔芋块茎中分离得到35株内生细菌,35株内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性,不同菌株间拮抗活性存在显著差异。初筛中,对软腐病菌相对抑制率(RIR)达到50%以上的内生细菌有17株,100%的有11株。复筛中RIR为100%的内生细菌有8株,其中7株胞外产物的RIR超过了150%。

两种天南星内生细菌抗魔芋软腐病菌株筛选

魔芋软腐病严重影响着魔芋的生产,利用内生细菌来抑制魔芋软腐病菌有很多优点。选择23株从药用植物一把伞南星、异叶天南星中分离得到的内生细菌,用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用,以筛选拮抗软腐病菌能力强的菌株。研究结果表明,23株供试内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性,8株抑菌效果非常显著,YC06和YC09两株内生细菌抑菌能力极强,其发酵产物对魔芋软腐菌也有极强的抑菌能力。