草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花>红果>粉红果>白果>青果>叶。

小麦ζ-胡萝卜素脱氢酶cDNA全序列的克隆

目的:从普通小麦品种EM12中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)基因的cDNA全长序列。方法:根据已报道的EST序列,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,对EST两端未知序列进行扩增、克隆和测序。结果:克隆得到cDNA全长序列2150bp,其ORF序列为1707bp,预测编码568个氨基酸残基,推测蛋白质分子量62.5kDa,带有一段19aa的信号肽序列。结论:根据同源序列分析,该序列与水稻ZDS蛋白的同源性为97%,与玉米ZDS蛋白的同源性为91%,而且与其他高等植物的ZDS都具有较高的同源性。该基因序列的分离与克隆为进一步开展小麦β-胡萝卜素生物合成机制的研究和利用转基因技术提高小麦β-胡萝卜素含量的研究奠定了基础。

细菌类胡萝卜素裂解酶酶解虾青素工艺优化

目的:从巴氏葡萄球菌发酵液中分离纯化可降解类胡萝卜素产香的酶,优化其降解虾青素的反应,为后续鉴定产物提供依据。方法:利用高效液相色谱分析产物产量变化,应用正交试验设计,采用DPS软件进行二次多项式逐步回归分析,优化虾青素酶解反应条件。结果:类胡萝卜素裂解酶具有催化虾青素降解的活性。反应pH值、反应时间、反应温度及其交互作用对产物产量均有极显著影响(P<0.01),反应pH值和反应时间的交互作用对产物产量影响最大,其通径系数为12.726 9。利用二次多项式逐步回归得到虾青素酶解的最佳反应条件:反应pH 4.5、反应时间7 min、反应温度50℃,在此条件下虾青素产物的产量总和可达到定义条件下的1.75倍。结论:该类胡萝卜素裂解酶对虾青素降解具有很强的催化活性,得到了产物达到最大产量时的最优条件。

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了Nt ZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析Nt ZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析Nt ZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:Nt ZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。Nt ZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。

柿ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与序列分析

通过对柿ζ-胡萝卜素脱氢酶(-ζCarotene desaturase,ZDS)基因的克隆及序列分析,旨在为改良柿果实品质奠定基础。根据GenBank中其他植物ZDS基因的保守序列设计了两条PCR扩增引物,以柿果实中所提取的RNA为模板,采用RACE技术扩增出一条约为500bp的条带。经过序列分析,其长578bp,不含内含子,具有部分开放阅读框(177bp)、终止密码子(TGA)和poly(A)尾巴(11bp),共编码58个氨基酸。该序列及其所编码的氨基酸与其他植物ζ-胡萝卜素脱氢酶基因均具有较高的同源性。该基因已提交GenBank数据库,登录号为GU075728。

观赏向日葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因HaZDS的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank No.KF263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸序列分析表明,Ha ZDS蛋白在N-末端区域含有一个叶绿体转运肽序列,含有一个典型的氨基氧化酶结构域和NAD(P)结合结构域,存在一个特征序列。系统发育分析表明,观赏向日葵Ha ZDS与万寿菊、菊花蛋白的同源性分别达96.4%、90.1%,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,Ha ZDS基因在盛花期表达量最高,不同组织中的表达量舌状花瓣>绿色管状花>苞片>叶片>黑色管状花,随着花瓣黄色的加深,基因表达量逐渐增加。推测Ha ZDS基因在转录水平上参与观赏向日葵花色形成的调控。

番木瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因时空表达的荧光定量PCR分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)是类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶之一,它催化ζ-胡萝卜素转化成链孢红素,并催化链孢红素向番茄红素的转化。ZDS是限速酶,在植物果实颜色和花色发育过程中起着重要作用。本研究以番木瓜黄果品种Dwarf solo和红果品种Sunrise solo为材料,采用实时荧光定量PCR SYBR GreenI荧光染料法,对2个番木瓜品种的不同组织器官及果实发育成熟过程中的ZDS基因在转录水平上的表达进行了相对定量分析。结果表明,2个番木瓜品种的果实、花、叶片中均可检测到ZDS基因在转录水平上的表达,但表达量存在组织和部位上的差异。ZDS基因在成熟果实中的表达量比花中的高,花中的比叶中的高。ZDS基因在Sunrisesolo(红果肉)番木瓜果实发育成熟过程中的表达逐渐增强,且变化显著,而在Dwarf solo(黄果肉)番木瓜果实早期表达增强,成熟后期则表达趋为稳定。2个番木瓜品种成熟果肉中ZDS基因表达量存在差异,红果肉中的表达量高于黄果肉。

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质>虾青素>β-胡萝卜素>角黄质>β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al^(3+)和Fe^(3+)是该酶的强效催化剂,Fe^(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。

类胡萝卜素裂解酶催化不同底物生成非香气物质的条件及优化

利用高效液相色谱研究类胡萝卜素裂解酶催化不同底物生成的非香气物质随酶解时间、p H、温度的变化规律,结果表明非香气物质生成量会随着酶解时间的增加、p H的降低和温度的升高出现先增加后减少的趋势。另外发现β-胡萝卜素在不同反应p H下可生成不同的裂解产物。利用二次多项式逐步回归得到酶解的最佳工艺条件,β-胡萝卜素、玉米黄质、β-阿朴-8'-胡萝卜醛、角黄质和虾青素的酶解条件分别为p H4.5、温度30℃、时间15 min,p H4.5、温度30℃、时间13 min,p H4.5、温度33℃、时间45 min,p H4.0、温度30℃、时间41 min,p H4.5、温度50℃、时间7 min。按上述条件进行酶解反应,得到产物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2的生成量分别为定义条件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍。该方法有效提高了非香气物质的生成量,并节约了时间。

黄瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

以西双版纳黄瓜为试材，从黄瓜果肉中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）基因的cDNA序列，命名为CsZds。获得目的片段长度为1805bp，该序列具有完整的开放阅读框，位于31～1761bp，编码576个氨基酸。序列比对分析结果显示，该蛋白在氨基端变化十分明显，中部较为保守，存在一个特征序列。系统进化分析表明，推测的CsZDS蛋白与南瓜中ZDS蛋白同源性最高，达到91．84％。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示，随着果实成熟期的延长，西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量呈明显上升的趋势，在转色期达到最大。在果实发育过程中，西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量高于普通黄瓜。

西红花β-胡萝卜素羟化酶CsBCH1-z基因的分离与生物信息学分析

为更好地理解西红花类胡萝卜素合成代谢途径,从西红花中分离和克隆了1个新的β-胡萝卜素羟化酶基因CsBCH1-z,并从柱头cDNA中克隆了该基因的全长编码序列为906 bp,编码301个氨基酸残基,对应的基因组序列为1261 bp,5个外显子由4个内含子子间隔开。与已知的CsBCH1基因的氨基酸序列比较,发现在N端由于6个碱基的缺失,造成了2个氨基酸的缺失和1个氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸,另外还有一处单碱基的变异造成苏氨酸突变为丙氨酸。通过预测其蛋白含有3个明显的跨膜结构域,C端包含了2组'HXXXXH'和'HXXHH'结构域,是典型的脂肪酸羟化酶。β-胡萝卜素羟化酶是西红花苷合成的重要前体物质,CsBCH1-z柱头中的表达量>叶片>花瓣;雄蕊中表达很低;球茎中表达不可见。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶是虾青素生物合成途径中关键酶之一,本研究通过基因枪法将克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt),转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中,经过含100mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析,证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT-PCR和RT-PCR Southern杂交分析,表明bkt在衣藻转化子中得到表达。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因的cDNA和基因组DNA克隆及序列分析

根据已知的β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase,BKT)的cDNA序列设计引物,利用长距离PCR扩增获得了bkt基因的cDNA完整编码片段及基因组DNA片段,并对这些片断进行了序列测定。cDNA和基因组DNA比对结果表明该基因至少包括5个内含子,它们的剪切位点皆符合GU-AG规律。在比对结果中同时还发现一个19bp的短序列重复,该重复序列在bkt的cDNA和基因组DNA上都发生了多次重复,推测在BKT的表达调控中可能具有一定功能。另外,在序列比对过程中还发现本实验所获得的cDNA和基因组DNA序列与前人报道的cDNA序列之间都存在多处单碱基差异和19bp的短序列差异。

胆酸盐、游离脂肪酸、黄体素对β-胡萝卜素-15,15′-加双氧酶活性的影响

用体外实验研究了胆酸盐、游离脂肪酸、黄体素对 β 胡萝卜素 15 ,15′ 加双氧酶 ( βCDIOX)活性的影响。结果表明 ,4和 8mmol·L -1的牛磺胆酸钠显著 (P <0 0 5 )或极显著 (P <0 0 1)促进 βCDIOX的活性 ,而且牛磺胆酸钠和胆酸对 βCDIOX活性的促进作用相近 ,脱氧胆酸钠的作用高于前两者 ,但差异不显著 (P >0 0 5 ) ;5mmol·L-1油酸对βCDIOX活性的促进作用显著高于对照 (P <0 0 5 ) ;软脂酸、硬脂酸对 βCDIOX活性无促进作用 ,亚油酸、亚麻酸能促进 βCDIOX活性 ,但差异不显著 (P >0 0 5 ) ;随着黄体素浓度的增加 ,βCDIOX活性逐步降低 ,黄体素生成的维生素A很少。

影响β-胡萝卜素-15,15’-加双氧酶活性的因素

类胡萝卜素具有抗氧化、提高动物繁殖机能、提高免疫应答、防癌、抗肿瘤、沉积于畜禽体内改善畜产品品质等作用。影响类胡萝卜素在体内转化的因素有很多 ,它们或者影响类胡萝卜素的吸收 ,进而影响类胡萝卜素的转化 ,或者直接影响β-胡萝卜素 -1 5 ,1 5’-加双氧酶 (β-Carotene dioxygenase,β CDIOX)的活性。关于对类胡萝卜素吸收的影响 ,前人已做过很多研究 ,而对影响类胡萝卜素转化的研究较少 ,所以作者主要对影响β-胡萝卜素的转化的因素进行综述。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。

虾青素法夫酵母β-胡萝卜素转化酶的生物信息学分析

以虾青素中法夫酵母酶氨基酸序列为研究对象,利用ProtParam、SignalP、PSORT、ProtScale、SOMPA、PredictProtein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在线预测工具,对其理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行分析。结果表明,该转化酶由557个氨基酸残基构成,是一种无信号肽,具有跨膜结构,定位于细胞色素氧化酶中的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规卷曲为主要的二级结构元件。三级结构以PDB ID 5vcc.1的B链为模板,功能预测为细胞色素P450。生物信息学手段分析预测结果可靠性较高,为进一步研究虾青素的生物合成调控机制提供了理论依据。

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶cDNA的克隆与序列分析

参照Kajiwara等人获得的β-胡萝卜素酮化酶cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶cDNA的完整编码片段并进行了序列测定与分析.结果表明,所获得cDNA序列与Kaji-wara等人报道序列具有96.4%的相似性,蛋白序列具有98.3%的相似性,说明所获得的cDNA序列确为β-胡萝卜素酮化酶的cDNA序列.

桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

【目的】克隆桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(Pp ZDS)的全长序列,并对其进行生物信息学及表达分析,为研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理提供参考。【方法】从黄肉品种桃果实中克隆Pp ZDS基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测其在桃果实不同成熟期的表达情况。【结果】克隆获得的Pp ZDS基因全长2014 bp,具有完整的编码区,长度为1716 bp,编码571个氨基酸。Pp ZDS蛋白含有ZDS特征序列(KVAIIGAGLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR),属于NAD_binding_8超级家族保守结构域。Pp ZDS蛋白与同为蔷薇目的苹果(gi|33313474)和草莓(gi|256041892)的ZDS蛋白亲缘关系较近,物种间分化程度较小。整个桃果实成熟期Pp ZDS基因在果肉和果皮中均有表达,从软核期至硬熟期均呈逐渐升高趋势,硬熟期达最高,完熟期降低;不同桃果实发育期果肉中的Pp ZDS基因表达量均大于果皮中表达量,其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果实中Pp ZDS基因在果肉中的表达量显著高于果皮中的表达量(P<0.05)。【结论】Pp ZDS基因表达对桃果实类胡萝卜素生物合成及呈色发挥正向调控作用。