胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense)引起的黄瓜细菌性软腐病在中国发生

2014—2015年,在中国山东、山西、河北、河南、辽宁等省的黄瓜茎叶上发生了毁灭性的细菌性软腐病,造成了黄瓜产业严重的经济损失。黄瓜叶片、茎、叶柄和果实表面出现流胶;茎基部呈深褐色进而出现湿腐。受侵染的黄瓜叶边缘出现黄斑和湿腐症状,并逐渐扩散至叶片中心。从受侵染组织中分离出45个细菌菌株,在形态学特性鉴定、生理学、生物化学和16Sr RNA基因序列分析的基础上,将病原体鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)。多位点序列分析(MLSA)证实,分离菌株是胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种[Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliensis(Pcb)],病原菌归入进化枝II。重新分离获得与原始菌株相同的菌株,证实了分离菌株的致病力。寄主范围测试表明,该菌株具有广泛的寄主范围。目前为止,这是对Pcb引起的黄瓜软腐病——这一对黄瓜生产具有重要经济影响的病害在中国乃至全球范围内的首次报道。

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种mreB基因的功能分析

为了阐明细菌杆状决定蛋白mreB基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,Pcc)生物学特性及致病性的影响,采用同源重组的方法成功构建了该基因的缺失突变株、互补菌株及过表达菌株,并进行了相关表型测定。结果表明:与野生型菌株PccS1相比,缺失突变株ΔmreB菌体形态由杆状变为球形;对黄花马蹄莲和大白菜的致病性显著下降;生长能力也受到一定限制;尽管分泌胞外纤维素酶的能力、抗氧化压力和菌体沉降速率无明显变化,但蛋白酶活性、果胶酶活性、生物膜形成能力、游动性及产生碳青霉烯抗生素的能力均有不同程度的下降。互补菌株的表型得到了部分或全部恢复。qRT-PCR结果也显示:ΔmreB中几种相关致病因子的相对表达量均下调。表明:mreB与胡萝卜软腐果胶杆菌的菌体形态、生长能力和致病能力密切相关。这是首次报道mreB与植物病原菌的致病性相关。

与黄花马蹄莲互作过程中胡萝卜软腐果胶杆菌的差异表达蛋白分析

通过病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种与黄花马蹄莲组织的离体互作,运用双向电泳技术、质谱技术及Im-ageMaster 2D platinum 5.0(GE)软件对互作过程中蛋白质差异表达进行分析。结果表明:70个蛋白点在互作中存在表达差异,占蛋白点总数的18.13%。通过质谱分析发现:2个特异表达蛋白分子伴侣DnaK和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)均为代谢类蛋白;3个显著上调表达蛋白中ATP合酶α亚基和半胱氨酸合酶为代谢类蛋白,而β-内酰胺酶为抗生素类蛋白。

白花马蹄莲诱导胡萝卜软腐果胶杆菌ubiG基因的克隆与功能分析

利用含有无启动子的Km抗性基因的转座子mariner对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterterium carotovorum subsp.carotovorum,Pcc)菌株PccS1进行转座诱变,建立突变体文库,以白花马蹄莲组织提取液为诱导物,诱导突变菌株,鉴定突变、并验证。筛选获得1株受白花马蹄莲组织提取液诱导的突变株PM5,经亚克隆鉴定,转座子插入位点为辅酶Q氧甲基转移合成酶ubiG基因(Ubiquinone biosynthesis O-methyltransferase)。利用同源重组获得该基因的缺失突变体△ubiG。与野生型相比,△ubiG对不同寄主的致病性均减弱(黄花马蹄莲和白花马蹄莲上的病斑面积减半,大白菜的病斑面积仅为1/5);突变菌株菌体沉降速率明显加快,生物膜产量降低约50%,无胞外蛋白酶产生。此外,△ubiG对链霉素和新霉素抗性分别比野生型增强了2.0倍和26.5倍,突变菌株的相关功能经互补可以部分恢复。以上结果说明,ubiG基因可被白花马蹄莲诱导并参与胡萝卜软腐杆菌的致病作用。

胡萝卜软腐果胶杆菌clpP基因的功能研究

为探索clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,P.c.c)生物学特性及致病性等方面的影响,采用同源重组法构建clpP基因缺失突变体ΔclpP和互补菌株ΔclpP(clpP),测定突变体及互补菌株的运动性、生物膜、抗氧化压力,以及在不同培养基和不同温度下的生长能力、部分致病因子活性及致病性等表型,并采用RT-PCR分析了果胶酸裂解酶(Pel)、纤维素酶(Cel)、蛋白酶(Prt)和坏死诱导蛋白(necrosis-inducing protein,Nip)等相关致病因子的编码基因转录水平变化。结果表明:ΔclpP的运动性无变化,生物膜形成、高温和营养饥渴耐受力及抗氧化压力等均下降;果胶酶、纤维素酶与蛋白酶活性有不同程度降低,酶活性检测平板上水解圈的直径分别比野生株下降19.35%、34.38%和35.00%;ΔclpP的致病性显著下降,离体接种‘黄花马蹄莲’叶片和大白菜叶柄,病斑面积分别比野生株的减小99.00%和99.60%;在4个毒力因子中,qRT-PCR显示:ΔclpP果胶酸裂解酶与纤维素酶mRNA相对表达量为野生菌株的40.00%左右。由此可见,clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌的生长和致病性具有多方面的决定作用。

胡萝卜软腐果胶杆菌lux发光菌株的构建和应用

胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)是世界十大植物细菌性病原之一。为了便于观察该病原菌侵染过程以及进行早期活体定量检测,本研究构建了表达luxCDABE基因的胡萝卜软腐果胶杆菌发光菌株。首先构建了含有luxCDABE基因操纵子的重组质粒,然后转入胡萝卜软腐果胶杆菌LMG2404中,命名为LMG2404-LUX。与LMG2404相比,LMG2404-LUX的生长速率、生物膜形成和游动性无明显差异;光信号强度与菌液浓度呈线性相关;在菌适宜生长条件下,光信号不受温度和pH的影响;经过10次继代培养后,光信号强度无明显减弱。LMG2404-LUX接种植物后,其致病性与LMG2404无明显差异,侵染初期的光信号强度与该菌侵染增殖呈线性相关。综上所述,LMG2404-LUX可以用于胡萝卜软腐果胶杆菌的快速定量以及植物体内的活体检测,为该菌的相关研究提供了新的工具。

魔芋软腐病病原菌果胶杆菌ZX67菌株全基因组测序及分析

菌株ZX67是魔芋软腐病病原菌胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum),为进一步了解该病原菌的特性,便于更好地研究防治软腐病的方法,对该菌株进行了全基因组测序和分析。该菌株基因组总长度为4,909,724 bp,GC含量为51.27%,包含4,977个编码基因,其序列长度占总基因组的85.25%,预测的非编码RNA主要包括74个tRNA、22个rRNA及100个sRNA,有10个基因岛,6个转座子,预测存在2个前噬菌体,每个前噬菌体的平均长度为26,258 bp,有5个CRISPR序列,每个序列的平均长度为621 bp,并分析了与降解寄主细胞壁相关的裂解酶、与侵染植物相关的5种蛋白分泌系统。以上结果,为进一步了解软腐病病原菌的特性提供了机会,也为研究新的防治方法提供了新的出发点和思路。

生防菌ZF510的分离鉴定及其对白菜细菌性软腐病的防治效果研究

白菜软腐病是由巴西果胶杆菌Pectobacterium brasiliense引起的一种危害严重的细菌性病害。目前,针对蔬菜细菌性软腐病高效防治的产品较少。为了筛选对白菜细菌性软腐病具有良好拮抗效果的生防细菌,本研究从白菜根际土壤中分离到一株对细菌性软腐病菌具有显著拮抗效果的生防细菌ZF510。经过形态学特征观察、生理生化特征和多基因系统发育树分析,并通过盆栽试验验证拮抗菌株对白菜细菌性软腐病的防治效果。结果表明,菌株ZF510为东湖假单胞菌Pseudomonas donghuensis,在代谢过程中产生蛋白酶,有合成IAA能力、嗜铁能力、溶磷能力。通过抑菌谱分析,证明菌株ZF510对巴西果胶杆菌、野油菜黄单胞野油菜致病变种等7种病原细菌具有显著的拮抗效果。采用二分皿法测定其挥发性物质对立枯丝核菌、黄瓜蔓枯病菌、茄匍柄霉3种病原真菌均有抑制效果。盆栽试验结果显示,接种菌株ZF510的白菜细菌性软腐病症状明显减轻,防治效果达到44.56%。综上所述,菌株ZF510具有良好的生防潜力和应用前景。

一种由胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种引起的大花蕙兰细菌性软腐病

大花蕙兰Cymbidiumg randiflorium是一种具有很高观赏价值的名贵花卉。细菌性软腐病是严重影响兰花品质的主要病害，有关兰花病原在国内有3种报道，认为该病分别由胡萝卜软腐欧氏杆菌马铃薯黑胫致病变种Erwinia carotovora pv. atroseptica、菊欧氏杆菌玉米致病变种E. chrysanthemi pv. zeae和胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜致病变种E. carotovora pv. carotovora引起。

胡萝卜软腐果胶杆菌鞭毛钩基因flgK的功能

【目的】为了研究鞭毛钩基因flgK在胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,P.c.c)的功能。【方法】本研究采用两亲同源交换法构建了基因缺失突变体ΔflgKpcc并构建了互补菌株ΔflgKpcc-KH,测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病因子、致病性等表型。【结果】与野生菌株PccS1相比,ΔflgKpcc鞭毛缺失,菌体易沉降,在0.3%半固体培养基上运动能力明显降低,生长速率无明显变化,但是纤维素酶和蛋白酶的活性、生物膜形成能力明显下降,对感病寄主的致病力显著减弱。基因互补可以使上述突变表型恢复。【结论】实验表明,鞭毛基因flgK突变导致了菌体的运动性降低、病原菌毒性相关的酶活力下降,从而导致致病力下降。

胡萝卜软腐果胶杆菌CpxP蛋白纯化及抑菌功能鉴定

胡萝卜软腐果胶杆菌是世界十大植物病原菌之一,主要侵染十字花科的经济作物和观赏花卉。文中从胡萝卜软腐果胶杆菌的基因组中克隆1个抗菌基因cpxP(GeneID:29704421),将其构建在原核表达质粒pET-15b上,并转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)进行表达,经纯化后进行稳定性和抑菌实验。结果显示,IPTG的诱导终浓度为1mmol/L,实现了蛋白的高效外源表达,纯化后电泳无杂蛋白残留,且该蛋白具有良好的热稳定性和pH稳定性。CpxP蛋白抑菌试验结果显示其对胡萝卜切片的抑菌率可达到44.89%,对马铃薯切片的抑菌率可达到59.41%。为进一步解释其抑菌机理,研究该蛋白的空间结构可为软腐病的防治和新型蛋白农药靶点研究提供新思路。

广东炭步芋头软腐病病原菌的分离鉴定与生物防治

为明确为害广东炭步槟榔香芋软腐病的病原菌种类,研究配套生物防治技术,为其防治提供参考。采用组织研磨法进行病原菌分离,基于科赫氏法则进行致病性测定,根据形态学观察、16S rDNA序列与系统进化树分析及生物学特性测定明确致病菌种类,并将芋脱毒种苗与微生物菌剂及生物炭相结合进行芋软腐病的防治研究。结果表明,经组织研磨法分离到3株分离物,柯赫氏法则验证和菌落形态特征、16S rDNA序列与系统进化树的分析结果表明,菌株T2202为广东炭步芋头软腐病致病菌,属胡萝卜软腐果胶杆菌;菌株S1905和S1910属假单胞菌,可导致芋头内部空洞、干燥发黑。胡萝卜软腐果胶杆菌菌株T2202最佳生长的pH皆为7.0,可在5.0%的NaCl培养液和37℃下生长,氧化酶反应和吲哚反应呈阳性,明胶液化呈阴性,可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖产酸,可产H2S。使用脱毒种苗进行栽培,在栽培基质中适量添加生物炭,并在定植前就开始施用微生物菌剂,定植后再定期施用,对芋软腐病可以起到很好的防治作用。

滇重楼茎秆软腐病病原鉴定

【目的】明确滇重楼茎秆软腐病的病原,以期为该病的防治提供依据。【方法】通过田间调查采样,初步掌握滇重楼茎秆软腐病的发生规律,通过稀释分离、柯赫氏法则验证获得病原菌,基于形态特征和16S r DNA、gyr B、rpo B基因序列特征对病原菌进行鉴定。【结果】从发病植株上分离出1株细菌,经柯赫氏法则验证为滇重楼茎秆软腐病病原菌,基于形态和分子生物学特征将其鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum。【结论】胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种P.carotovorum subsp.carotovorum是滇重楼茎秆软腐病的病原菌。

陕南地区魔芋软腐病病原菌的鉴定及生长特性研究

为了对陕南魔芋软腐病进行更有效的病害检测和防控,采集秦巴山区的软腐病发病魔芋进行病原菌分离,并进行魔芋组织和植株的致病性检测,确定了其中6株菌是病原菌,并进行形态特征、Biolog、16S r DNA鉴定。结果表明,这6株菌形态相似,均为乳黄色圆形菌落,短杆状菌体,大小(0.4-0.6)μm×(0.8-1.0)μm,G-,16S r DNA和Biolog鉴定均为胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carolovorum ss carotovorum。6株病原菌生长特性相似,生长温度为4~37℃,最适温度为30℃,pH范围6.0~10.0,最佳pH为7.0。

福建省七叶一枝花细菌性软腐病病原鉴定

【目的】调查七叶一枝花软腐病的发病特点及危害,分离和鉴定七叶一枝花软腐病的病原菌,以期明确七叶一枝花软腐病的病原菌,为该病的大田防治提供依据。【方法】通过对七叶一枝花软腐病进行田间病害调查和采样,以及对采集来的七叶一枝花样品进行病原菌分离纯化、形态特征鉴定、16S rDNA基因序列特征及致病性测定,综合分析鉴定七叶一枝花软腐病的病原菌。【结果】七叶一枝花软腐病的田间病害调查结果表明从每年2月植株出苗开始,七叶一枝花叶片、茎秆和块茎均有软腐病发生,常发于通气不良、田里积水环境。叶片发病由初期受害部位的水浸状的坏死有刺激性气味产生,而后感病部位内部组织被分解为液体状态,直至软腐。对发病植株上分离出的菌株进行形态学、分子生物学特征和致病性测定,将七叶一枝花软腐病病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carowvorum。【结论】七叶一枝花在通气不良、排水不畅的环境中易感软腐病,胡萝卜软腐果胶杆菌P.carowvorum是七叶一枝花软腐病的病原菌。

西葫芦细菌性茎基软腐病病原的分离与鉴定

[目的]为分离鉴定山西温室蔬菜西葫芦根茎部软腐病害。[方法]对分离物进行致病性测定、形态学观察、生理生化特性测定及16SrDNA系列分析。[结果]结果表明,40个菌株经人工接种后,CY39导致西葫芦茎基部软腐,经柯赫氏法则验证为致病病原。在电镜下菌体呈短杆状,两端钝圆,具鞭毛,革兰氏阴性。CY39菌株通过测序和序列比对分析,其与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)AB680280报告的序列相似度为100%。[结论]西葫芦茎基软腐病原菌应归属于胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种。

福鼎槟榔芋软腐病病原菌的分离和鉴定

从福建省福鼎市田间患软腐病的槟榔芋球茎分离到菌株141108,经Koch′s法则验证及形态观察和分子测序对其进行鉴定,并测定了其药物敏感性和生物学特性.结果发现:菌株141108为福鼎槟榔芋软腐病的病原菌,其与胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)相似度达99%;菌落为圆形、光滑湿润、乳白色、有臭味,革兰氏阴性杆状,有鞭毛,兼性好氧.该菌对四环素、氯霉素等10种抗生素高度敏感.在pH为5.0~10.0时均能生长,最适pH为7.0;在温度为4~45℃时均能生长,最适温度为28℃.

京郊快菜细菌性软腐病病原鉴定

为明确京郊快菜软腐病的病原,对取自北京不同区县的发病快菜植株进行组织病原菌分离、培养和回接试验,在形态学观察的基础上,对病原菌株进行了生理生化测定、分子生物学鉴定和致病力分析。结果表明,在分离纯化得到的29株菌株中,17株被鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种,其余12株被鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种;同时也识别到9株非典型Pcc菌株,表现为不能分解柠檬酸盐或不具备在37℃和7%Na Cl条件下生长的能力,可微弱利用D-阿拉伯糖醇、异麦芽酮糖醇和D-麦芽糖。致病力测试结果显示,仅2株Pcb菌株和1株Pcc菌株表现为中等致病力,其余菌株均表现为高等致病力。明确了引发北京地区快菜软腐病致病菌的种类为Pcb和Pcc,且致病力普遍较强,可为其防控提供理论依据。

复配抑菌剂对青椒细菌性软腐病防治及保鲜效果研究

为研发适用于青椒细菌性软腐病防治及青椒保鲜的复配抑菌剂,分别研究了ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、曲酸对细菌性软腐病的抑制效果,基于单因素抑菌试验结果,运用响应面试验优化复配抑菌剂配方,并将所得最佳复配抑菌剂用于青椒保鲜试验。结果表明,复配抑菌剂的最佳配方为:ε-聚赖氨酸161.50 mg/L,曲酸13.34 g/L,乳酸链球菌素181.00 mg/L,其对胡萝卜软腐果胶杆菌的实际抑菌率可达95.33%,与预测值95.50%相近。青椒保鲜试验发现,复配抑菌剂能有效维持青椒叶绿素、VC及可溶性固形物含量,降低失重率和抑制相对电导率的上升,有助于维持青椒感官品质。

两种半夏根部致病菌的比较研究

2018年春夏,贵州省遵义市发生三叶半夏(Pinellia ternata)根部病害,叶柄以上部位倒伏,且连片快速发生。为明确其病原菌,对自然发病的半夏病株进行了病原菌的分离,并对获得的主要病原菌进行形态学观察、16S rDNA序列鉴定和致病性测定。结果表明,当地发生的半夏病害主要由2种病原菌引起:(1)胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)引起半夏叶柄以上部位水渍状快速软烂倒伏,伴随发臭;(2)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起半夏叶柄基部折断,植株干枯黄化,连片倒伏,但单株发病进程相对较慢。这是首次有关铜绿假单胞菌引起半夏根部病害的报道,建议将其引起的病害称之为“半夏黄化猝倒病”。在人工接种条件下,铜绿假单胞菌YD-01寄主范围较窄,但能侵染番茄果实;而胡萝卜果胶杆菌RD-02可以侵染莴苣、青椒、茄子、土豆、番茄和梨等果实,并产生明显软腐症状。利用BioF型间歇浸没植物生物反应器建立植物-微生物共培养模型,结合盆栽试验分析2种病原菌导致的病情指数和病程指标变化,进一步确定了其差异。本研究结果为半夏根部病害防控提供了新的直接依据。