拮抗胡萝卜软腐欧文氏杆菌的放线菌的分离和筛选

采用平板稀释法进行了土壤中放线菌的分离,以胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora var. carotovora)为拮抗对象,筛选拮抗放线菌。根据抑菌圈的大小,初步筛选出F10、F4、F5、F11等有较强的拮抗作用的12株放线菌。分别对这12个菌株进行发酵,根据发酵液和菌丝破碎稀释液的拮抗活性复筛。复筛结果表明,12个菌株中,发酵液的拮抗活性F11最强,F1、F9次之;菌丝体破碎稀释液的拮抗活性F12最强,F3、F11、F1、F10次之。不同菌株产生的拮抗物质在细胞内外的分布不同。

四株胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种新菌株的分离鉴定

采用棋盘式取样法,从正茬、重茬、连作2年和连作3年的马铃薯播前、现蕾期、成熟期和收获期4个不同阶段采集马铃薯根围土样。以稀释平板法,用选择性培养基CVP分离软腐欧文氏杆菌,共得到42个菌株。在形态学观察和生理生化特性测定的过程中发现编号为GAUP-b410、GAUP-b492、GAUP-b416和GAUP-d34等4个菌株的主要性状一致,且与其他菌株的性状不同。致病性测定结果显示,这4个菌株均能引起马铃薯薯片腐烂。对其中的2个菌株进行了16S rDNA序列分析,其PCR产物的序列与GenBank上登记的18个分离自中国大白菜上的Erwinia carotovorasubsp.carotovora菌株的亲缘关系最近,同源性均达99%。利用DNAStar软件绘制系统发育树状图,菌株GAUP-b410亦与这18个E.carotovorasubsp.carotovora菌株位于系统发育树的同一分支,聚为一类;菌株GAUP-b492与其中的16个E.carotovorasubsp.carotovora菌株位于系统发育树的同一分支,聚为一类;结合生理生化特性和16S rDNA序列分析,确定这4个菌株为胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种(E.carotovorasubsp.carotovora)新菌株。

胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种游动性突变体的筛选

用转座子 Tn5对胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种 ( Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)进行诱变 ,获得 9个游动性改变了的突变体。 M4 32游动性变大 ;M143、M4 51和 M574游动性完全丧失 ;M4 3、M4 9、M330、M72 5和 M72 6游动性较野生型变小。这 9个突变体在大白菜叶柄上的致病力均减弱。游动性变小或丧失的突变体鞭毛数目减少或未发现有鞭毛。

一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌的分离和鉴定

从大白菜软腐组织中分离出一株软腐病细菌BC1,经过形态观察、生理生化特性分析、致病性检测和 16SrDNA序列分析 ,该分离物被鉴定为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种 (Erwiniacarotovorasubsp .carotovora ,Ecc)的一个新菌株 ,编号为BC1。这是首次从 16SrDNA序列水平上对在我国分布的软腐欧文氏菌进行鉴定。EccBC1的 16SrDNA序列与其它软腐欧文氏菌株的 16SrDNA序列之间同源性达 98 7%～ 99 3% ,而且在系统发育树中独立于Ecc其它菌株。序列分析结果表明 ,EccBC1具有至少 2种不同的 16SrDNA序列 ,它们都在第 4 5 9位和 4 73位 (相对于大肠杆菌 16SrDNA序列 )发生碱基突变 ,同一基因中两个突变位点之间彼此互补 ,处于 16SrRNA螺旋H17颈部 ,而且这两处碱基变异只存在于BC1菌株中。通过与其它软腐欧文氏菌亚种和菌株 16SrDNA序列进行比对分析 ,还进一步鉴定出一些BC1菌株特异的 16SrDNA碱基突变位点。本文报道的EccBC1两个 16SrDNA序列在GenBank中的登录号分别为AY30 90 6 8和AY30 90 6 9。

胡萝卜软腐欧文氏菌分子检测技术的研究

胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种Erwinia carotovorasub sp.carotovora(Ecc)是引起魔芋和马蹄莲软腐病的主要病原细菌.本研究根据细菌L-氨基酸渗透酶同源基因设计URP核苷酸序列特异性引物进行普通PCR、巢式PCR,同时采用细菌16S-23S rDNA间的ITS序列设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR,对样品中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌进行检测,并比较了3种检测方法的特异性和灵敏度.结果表明,应用实时荧光PCR方法检测样品,其中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌的最低菌悬液浓度可达10 cfu/mL;巢式PCR灵敏度也可检测到10 cfu/mL;而用普通PCR最低可检测到103cfu/mL.用实时荧光PCR和巢式PCR方法检测病菌,其灵敏度都比常规PCR提高了100倍,且实时荧光PCR方法更快速、简便、安全、准确,不需PCR的后续处理.实时荧光PCR方法适用于种苗、种球等检测领域.

胡萝卜软腐欧文氏菌CXJZU-120的选育及其脱胶性能研究

为寻求更适宜于生产应用的麻类生物脱胶高效菌株,对苎麻脱胶菌株CXJZ95-198进行紫外诱变,存活菌株的生理特性研究和脱胶功能实验发现:紫外线处理120 s获得的变异菌株CXJZU-120性状稳定;在5.5～6.0 h完成苎麻脱胶,总胶质脱除率达87.22%;该菌经10.0 h培养,发酵液中的果胶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶活分别为211.2 U/mL、374.8 U/mL和96.6 U/mL;该菌株在固态培养基中培养16.0～17.0 h开始显棕褐色,液态发酵培养基中培养5.0～5.5 h开始显蓝绿色,接种到苎麻上发酵5.0～5.5 h开始显蓝色。该结果表明,变异菌株CXJZU-120与出发菌比较,不仅在脱胶功能和产酶性能上有所提高,而且繁殖速度快,发酵时具有特别的显色现象,对于该菌在生产中的应用具有重要意义。

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI)。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8 kD,与预期分子量相符。经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致。

几种杀细菌剂对胡萝卜软腐欧文氏菌的毒力测定

采用室内抑菌圈法测定了6种杀细菌剂对胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫病亚种(Erwiniacaroto-vorasu sp.atroseptica)的毒力,筛选出2种有明显抑菌作用的药剂72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂和90%链霉素.土可溶性粉剂,抑菌效果显著,EC50分别为0.0921mg.mL-1和0.0972mg.mL-1。

胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种Ecb菌株表达的一种Harpin蛋白

1986年,hrp基因被首次报道。由于Wei等（1992）从梨火疫病菌（Brwinia amylovora）中分离出了能激发过敏反应的HarpinEa蛋白,细菌所产生的Harpin分子受到了同行的重视。基于对Harpin蛋白的深入研究,国外已研制出了相关新型、高效、安全的生物农药。近年来,国内涉及Harpin蛋白结构与功能的研究课题组逐年增多,并在某些方面取得了较好的进展。

胡萝卜软腐欧文氏菌CSSY002菌株hrpN基因的克隆、鉴定及其表达产物Harpin蛋白的活性分析

从感染软腐病的胡萝b组织中分离出胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝b亚种（ Erwinia carotovora subsp, carotovora）CSSY002菌株．用该菌株接种非寄主植物烟草不能引起过敏反应．构建CSSY002菌株的基因组文库，应用α-P^32标记的hrpN基因作探针，通过菌落原位杂交技术从该文库中筛选到1．5～2．0 kb的hrpN-like阳性克隆，进一步将该片段亚克隆到pBluescript—II SK（＋）载体中，进行核苷酸序列测定．结果表明，hrpN-like基因（即hrpNCSSY002基因）的开放阅读框（ORF）为1071bp，其核苷酸序列已在Genbank注册，登录号为bankit AY999002．hrpN-like基因的编码产物Harpin—like蛋白（即HarpinCSSY002蛋白）由356个氨基酸残基组成，分子量为36．64×10^3，等电点pI5．9．将hrpN—like基因构建到表达质粒pET-28a（＋）的17强启动子下，并转化到大肠杆菌工程菌JM109（DE3）细胞中，经WTG（异丙基硫代-β-D半乳糖苷）诱导获得Harpin-like蛋白的高效表达，并通过接种烟草叶片的过敏反应检测Harpin—like蛋白的生物学活性．

异源Harpin对软腐欧氏杆菌与植物互作关系的影响

本文通过三亲交配将带有梨火疫欧文氏杆菌功能完整的 hrp基因簇的重组粘粒 p CPP4 30转移到了胡萝卜软腐欧氏杆菌 (Erwinia carotovora) Se9R中。从接合子中提纯的质粒与 p CPP4 30的大小、酶切图谱相同 ;以该质粒为模板 ,用针对 hrp N序列的引物经 PCR扩增得到与 hrp N大小相同的片段 ;用地高辛标记的 hrp N作为探针进行 Southern blotting分析 ,在接合子中的质粒上得到预期的杂交带。接合子可以在烟草叶片上稳定地引起过敏反应。另外 ,接合子可以在寄主马铃薯叶片上引起过敏反应样枯斑 ,表明异源 harpin的表达及功能不受软腐菌的抑制。该接合子在体外产生的果胶酸裂解酶活性与受体菌 Se9R无明显差别。低浓度的接合子在马铃薯块茎上的软腐症状明显低于受体菌 Se9R。外源harpin表达可能不改变软腐欧氏杆菌的致病力、而是通过诱导马铃薯抗性达到减轻发病的作用。

含苏云金芽孢杆菌aiiA基因的重组荧光假单胞菌的构建及对软腐病的抗病活性

aiiA基因编码的AiiA蛋白能降解细菌群体感应系统中的信号分子N_酰基高丝氨酸内酯AHLs,从而减弱致病菌对植物的危害。本文将aiiA基因转入到植物根际促生细菌荧光假单胞菌P303中,构建成防治植物细菌和真菌病害的工程菌P303-ss10。通过PCR和RT-PCR鉴定,均获得0.8 kb的目的片断,表明aiiA基因已经导入P303中。室内平板抑菌试验表明,该工程菌保留了出发菌株对多种植物病原真菌的抑制作用;室内离体试验表明该工程菌对马铃薯软腐病和大白菜软腐病都有一定的抑制作用。

巨大芽孢杆菌L2发酵产物对魔芋软腐病菌的抑菌机制

目的:探究巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L2发酵产物对贮藏期魔芋软腐病菌--胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora)EC-1的抑菌机制。方法:以巨大芽孢杆菌菌粉为原料提取发酵产物,用常压硅胶柱层析分离得到发酵产物流分LE4-1~LE4-7,经抑菌实验筛选得到对胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1有良好抑菌作用的流分,再使用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法对其进行成分分析;并通过测定其半数抑制质量浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)、菌液电导率、核酸蛋白泄漏、可溶性总糖质量浓度、菌体总蛋白、菌体磷代谢及胞内活性氧水平对其抑菌机制进行研究。结果:巨大芽孢杆菌L2流分LE4-3对胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1有良好抑菌作用,经GC-MS检测其主要成分为苯乙酸乙酯(32.190%(相对含量,后同))、亚油酸乙酯(15.819%)、苯乙酸甲酯(13.793%)等;LE4-3对胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1的IC50为(1.06±0.01)mg/m L,并初步推测其作用机制是通过影响细胞膜完整性、损伤细胞结构、抑制细胞蛋白质合成及能量代谢等对胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1发挥抑菌作用,因此巨大芽孢杆菌L2流分LE4-3在魔芋抗软腐病贮藏中具有良好的应用前景。

软腐欧文氏菌代谢网络重构及其在靶标筛选中的应用

欧文氏杆菌(Erwinia)是一类重要的农作物致病细菌,侵染宿主范围广,在世界范围内造成了严重的经济损失,其中Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 (Eca SCRI1043) 可导致马铃薯感染黑胫软腐病,危害极大。本文构建了Eca SCRI1043基因组的代谢网络,并进行拓扑结构和流平衡分析,以此筛选出网络的中心节点。若中心节点所代表的酶收录在TTD数据库中,则此酶可作为农用杀菌剂的候选靶标。随后选取靶标十一异戊二烯焦磷酸酶(Upps),采用specs公司的商品化合物数据库作为小分子数据库,对靶标进行高通量虚拟筛选,对综合打分结果最好的前400个化合物进行目筛后得到73种先导化合物,这73种先导化合物可以进一步进行后续生测实验以确定其杀菌活性。

食品酸味剂抑制采后大白菜的胡萝卜软腐欧氏杆菌研究

为寻找安全的食品添加剂以减少采后大白菜腐烂,对大白菜腐烂细菌进行了分离、鉴定,并采用酸味剂抑制其生长。通过对细菌形态、染色特征、鞭毛、运动的观察,结合葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验、V.P试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、产吲哚试验、产硫化氢试验、硝酸盐还原试验,鉴定出该细菌为胡萝卜软腐欧氏杆菌。将该菌回接到新鲜白菜上,在25℃放置5d后,出现相同的腐烂症状,并从中分离、鉴定得到胡萝卜软腐欧氏杆菌(柯赫氏法则)。通过在培养基中添加多种食品酸味剂(冰醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、磷酸、富马酸)的抑菌试验,筛选抑菌效果好的酸味剂,并在大白菜叶片上做浸渍试验。结果显示:食品酸味剂能够有效地抑制胡萝卜软腐欧氏杆菌生长,其中,冰醋酸是酸味剂中抑制胡萝卜软腐欧氏杆菌生长最好的酸味剂。0.01%冰醋酸即有良好的抑制效果。

一种由胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种引起的大花蕙兰细菌性软腐病

大花蕙兰Cymbidiumg randiflorium是一种具有很高观赏价值的名贵花卉。细菌性软腐病是严重影响兰花品质的主要病害，有关兰花病原在国内有3种报道，认为该病分别由胡萝卜软腐欧氏杆菌马铃薯黑胫致病变种Erwinia carotovora pv. atroseptica、菊欧氏杆菌玉米致病变种E. chrysanthemi pv. zeae和胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜致病变种E. carotovora pv. carotovora引起。

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。

芋头软腐病拮抗菌的筛选及生防效果研究

分别从蔬菜田土壤和采后芋头表面黏附土壤中分离纯化到267和244株菌株,通过平板拮抗实验,发现其中6个菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)产生了清晰且明显的拮抗圈(直径>10 mm)。利用芋头对它们的生物防控效果进行复筛,结果发现BGP14菌株发酵液处理芋头的发病率仅为6.7%,显著低于其他5个菌株(P<0.05)。根据BGP14的形态学特征、芽孢产生及16S rRNA和gyrB基因的部分核酸序列,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌BGP14(Bacillus amyloliquefaciens)。BGP14在芋头伤口上具有较强的定殖能力,并将病原菌Ecc的群体数量压制在一个较低水平。BGP14与病原菌Ecc联合处理芋头的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性显著高于其他处理。以上结果表明,解淀粉芽孢杆菌BGP14对病原菌E.carotovora具有强大的拮抗活性,能够有效防治贮藏期芋头软腐病,具有潜在的应用开发前景。

西葫芦软腐病病原的初步研究

2004～2006年,在山东省的临淄、聊城、寿光、临沂等12个县市保护地栽培的西葫芦中发现一种严重危害茎基部的细菌性病害。从22批次55株西葫芦病株标本中,经分离纯化获得135个菌株,从中选出部分菌株按柯赫法则对其进行致病性测定,均产生与田间相同症状。对病原菌形态、染色反应、培养性状和生理生化等几项试验结果表明,病原菌为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwinia carotovora subsp.carotovora。

香蕉品种对香蕉细菌性软腐病的抗性鉴定

由菊欧文氏杆菌香蕉致病变种[Dickeyaparadisiaca(原名Pectobacterium chrysanthemi pv.paradisiaca)]引起的香蕉细菌性软腐病是我国新入侵的毁灭性香蕉病害,应用抗病品种将是防治该病害的有效方法。采用离体叶片法和盆栽法相结合的筛选方法对39个香蕉品种进行抗性鉴定,结果表明,供试品种对香蕉细菌性软腐病菌的抗性存在明显差异,其中表现高抗(HR)的品种为‘皇帝蕉’,抗病(R)品种为‘红河矮’,中抗(MR)品种为‘矮脚遁地蕾’和‘龙州中把’。离体和盆栽鉴定结果与品种田间抗病性一致,可有效、快速、准确地筛选出抗病品种。