胰凝乳蛋白酶抑制剂在蓖麻蚕主要组织中的分布及血液中的含量和活性

【目的】蓖麻蚕Samia cynthia ricini属于鳞翅目昆虫,其体内存在的胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)对蓖麻蚕的正常生长发育和自身防御能力有重要的作用。获得蓖麻蚕的CI种类分布信息,以及研究各种CI的功能,可以为鳞翅目害虫的生物防治提供理论依据。【方法】本实验通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)和CI活性染色技术,对18个蓖麻蚕品系的主要组织器官中胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分布进行了调查,并对各品系血液中的蛋白含量和CI活性进行了测定。【结果】在p H 8.6电泳下,各品系血液中共检测到7条CI活性带,在p H4.0电泳下,各品系血液中可检测到3条CI活性带;血液中的CI含量从5龄第3天幼虫期到化蛹当天一直维持着很高的含量;头、体壁和脂肪体中的CI都不如血液中的CI含量高,而丝腺中未检测到任何CI。【结论】与家蚕Bombyx mori血液中的含量相比,蓖麻蚕血液中的CI含量更高,CI种类多态性分布不仅体现在不同品系的同一组织,还体现在同一品系的不同组织。

胰凝乳蛋白酶短肽抑制剂的筛选和活性分析

报道了一种从噬菌体肽库中筛选胰凝乳蛋白酶短肽抑制剂的新方法．在通常的亲和富集筛选的基础上，利用胰凝乳蛋白酶自身的水解活力切割掉结合的底物噬菌体，再经抑制活力分析得到抑制性噬菌体克隆．这样筛得的噬菌体克隆具有明显的胰凝乳蛋白酶结合活力和抑制活力，ＤＮＡ序列分析发现其保守序列为（Ｓ／Ｔ）ＲＶＰＲ（Ｒ／Ｈ）．按此序列化学合成的短肽Ａｃ－ＡＳＲＶＰＲＲＧ－ＮＨ２、Ａｃ－ＡＳＲＶＰＲＨＧ－ＮＨ２同样表现出对胰凝乳蛋白酶的抑制作用．

家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂基因SCI-SB的原核表达、纯化及活性检测

为进一步研究家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂基因SCI-SB的功能和作用机理,利用RT-PCR技术,从家蚕总RNA中扩增到家蚕SCI-SB基因片段,构建了含有GST标签的融合表达质粒pGEX4T-1-SCI-SB。采用pGEX融合蛋白表达系统,在大肠杆菌BL21中得到以包涵体形式存在的重组GST融合蛋白质,表达量可占菌体蛋白的15%。将包涵体变性、复性处理以后,进一步利用GSTTrapFF亲合层析一步获得了重组蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰纯种大白兔,获得效价高的多克隆抗体。胰凝乳蛋白酶活性抑制实验结果表明该重组蛋白具有一定的酶活抑制作用。

介孔分子筛SBA-15中α-胰凝乳蛋白酶组装及催化活性研究

The hexagonal silica mesoporous material SBA-15 with ordered 2-dimensional channel structure was used as a suppport to the immobilization of emzyme. α-Chymotrypsin, an enzyme, was assembled in the channel of SBA-15 by immersion method. The absorbed amount of enzyme in SBA-15 and the activity of the immobilized enzyme were studied. It was found that there was more absorbed enzyme in SBA-15 than in other carrier and the activity of the immobilized α-chymotrypsin was increased compared with the free enzyme. It suggests that silica mesoporous material SBA-15 is a good support for immobilization of enzyme.

家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分布

家蚕Bombyxmori的胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsininhibitor,CI)在家蚕发育过程中发挥着重要作用,具有丰富的多态性。为了进一步研究家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂在群体水平上的多态性分布,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,调查了425个家蚕品系的血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的分布情况。结果表明,基因IctA、IctD和IctE在所有家蚕品系中存在,暗示它们是家蚕正常生长发育必需的基因;相反,至少在9个家蚕品系中发现基因IctB和IctH都没有表达,而这些品系没有明显的生理缺陷。在中国品系和日本品系家蚕之间,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布规律基本一致。对52个纯品系家蚕的胰凝乳蛋白酶抑制剂分布进行的聚类分析结果表明,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布与其系统、眠性和化性都没有明显的相关性。所以家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂广泛存在于不同家蚕品系中,同时多态性的分布特征也表明其生理功能在进化过程中发生了明显的分化。

家蚕不同品种与个体的血液胰凝乳蛋白酶抑制剂差异研究

胰凝乳蛋白酶抑制剂 (Chymotrypsininhibitor,CI)是家蚕血液中主要的蛋白酶抑制因子 ,为其正常生长发育所不可缺少 ,研究CI对阐明家蚕正常生理以及害虫防治等都具有重要意义。采用pH 8 3、4 0聚丙烯酰胺凝胶电泳和CI活性染色法 ,对 6个家蚕品种血液中的蛋白质含量和CI活性进行了测定 ,并对各品种CI活性的个体差异性进行了分析。结果表明 :结合pH 8 3和pH 4 0的电泳条件 ,可检测出Ict D ,Ict E ,Ict A ,Ict B ,Ict H基因所支配的 15种CI;6个品种中有 3个具有CI个体差异性 ,而且Ict E和Ict B在有的品种或个体无活性 。

含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A突变体的构建、表达、纯化以及杀虫活性分析

【目的】构建含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A的突变体Cry3Am,以期提高Cry3A的活化效率,增强杀虫活性。【方法】利用重叠PCR技术,构建Cry3A杀虫蛋白的突变体Cry3Am,使之在原核细胞中表达纯化突变体蛋白;将Cry3Am与饲料混合后饲喂黄粉虫,用以评价Cry3Am的杀虫活性。【结果】成功地在Cry3A杀虫蛋白结构域I的α3和α4之间加上1个α-胰凝乳蛋白酶的作用位点,并提取Cry3Am到杀虫蛋白。体外酶切试验结果表明,Cry3Am很容易地被降解为55 kD的杀虫蛋白。生测分析结果表明,Cry3Am对黄粉虫的毒力是Cry3A的2倍以上。【结论】向Cry3A中插入α-胰凝乳蛋白酶作用位点可以使突变体Cry3Am很容易地被α-胰凝乳蛋白酶降解成55 kD的片段,并能提高Cry3A的杀虫活性。

竞争性抑制剂对反胶团萃取过程中α胰凝乳蛋白酶活力的稳定作用

研究了竞争性抑制剂苯基硼酸对α胰凝乳蛋白酶反胶团萃取过程的影响及对酶活力的稳定作用.研究发现,向AOT/isooctane反胶团中添加一定量的苯基硼酸,萃取率会略有增加,反萃取率则无显著变化.酶活力的回收率显著提高,酶活力对萃取和反萃时间的耐受性显著增强.苯基硼酸和α胰凝乳蛋白酶之间的特异性亲和作用是产生这种影响的原因.

家蚕血液中胰凝乳蛋白酶抑制剂研究——品种间的多态型

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和胰凝乳蛋白酶抑制剂 (CI)活性染色 ,对 9个家蚕品种血液中CI种类的分布进行了调查。结果 :在碱性电泳条件下可检测出 12种以上的CI,品种间CI分布存在多态型 ,根据结果筛选出作为分离纯化家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的理想品种材料。

蓖麻蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调查

胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)为昆虫体内重要的调控因子,是昆虫体内免疫系统的重要组成部分。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色方法,对20个蓖麻蚕品种血液CI的种类进行了调查。在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测到7种CI,定名为E-CI1、E-CI2、E-CI3、E-CI4、E-CI5、E-CI6、E-CI7;在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测到2种CI,定名为E-CIa、E-CIb。对同一蓖麻蚕品种不同发育时期血液CI的调查显示,CI 5的活性有随5龄期经过而递增的趋势。

白茶对弹性蛋白酶活性的抑制研究

为了解白茶对弹性蛋白酶活性的作用,测定了6个白茶样品对猪胰弹性蛋白酶(PPE)活性的抑制作用。结果表明,6个白茶样品中CB4对PPE抑制活性最强,为69.73%;且随体积分数增加,酶抑制活性增强,呈剂量依赖性抑制。白茶水提液的4个萃取层中乙酸乙酯层(WEA)的抑制活性最强,达到82.58%。CB4的多酚总量(TPs)较高,且表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和咖啡碱(CAF)含量最高。WEA萃取层中TPs、EGCG、ECG和ECG含量均最高,CAF含量极低。PPE活性抑制率与TPs、EGCG和CAF含量呈极显著正相关,相关系数均大于0.90。0.1~1.0 mg/mL EGCG和0.05~2.0 mg/mL CAF对PPE无抑制活性,0.05~2.0 mg/mL没食子酸(GA)对PPE活性具有促进作用,且GA的促进作用与其浓度呈正相关。可见,白茶具有潜在抗衰老活性,但对PPE起抑制作用的活性成分不是EGCG、GA和CAF。

马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂的制备和性质

天然蛋白酶抑制剂与相应的蛋白酶往往共存于生物体的某些体系之中,它们相互制约处于动态的平衡,发挥重要的生物调控作用。人体的某些病理状态如炎症、烧伤感染、变态反应等均与蛋白酶和它的抑制剂平衡的失调密切相关。近年来报道,一些外源性蛋白酶抑制剂能抑制癌细胞分泌的蛋白酶,遏阻恶性肿瘤的生长。还可用于外科手术,保护血小板,减少手术的输血量。因此天然蛋白酶抑制剂的研究越来越受到重视。马铃薯中含有多种蛋白酶抑制剂。1962年,Ryan和Balls首次分离出胰凝乳蛋白酶抑制剂I。后来Kiyohara等得到了与抑制剂I相类似的马铃薯蛋白酶抑制剂。

应用胰凝乳蛋白酶消化法比较冬季和夏季鲢鱼肉肌球蛋白的构造特性

以夏季和冬季鲢为研究对象,利用胰凝乳蛋白酶能水解羧基端含芳香族氨基酸残基肽键的特性,根据其特异性酶切部位,结合电泳手段来分析肌球蛋白的内部构造差异性。结果表明,与夏季样品相比,冬季鲢的肌原纤维蛋白经酶切生成的肌球蛋白头部S-1较长,在高温下分子量为165 ku的重酶解肌球蛋白HMM容易被再降解成小片段的135 ku HMM,呈现出冬季肌球蛋白的结构不稳定性。在不同温度下加热夏季和冬季肌球蛋白,其ATPase失活速度和酶解肌球蛋白生成S-1的产生量的减少速度呈现一致性,说明酶解生成的S-1只来源于有活性的肌球蛋白。同时,冬季肌球蛋白热变性温度较夏季肌球蛋白要低6℃,表明冬季肌球蛋白的不稳定性。

菜青虫胰凝乳蛋白酶基因PrCT1的克隆及表达分析

胰凝乳蛋白酶是昆虫的主要消化酶,可能参与多种消化以外的生理过程。为了解该蛋白质基因表达特性,基于菜青虫(Pieris rapae)转录组数据,克隆了1个菜青虫胰凝乳蛋白酶基因PrCT1并进行相关分析。该基因编码区全长861 bp,编码286个氨基酸,含有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体(H57、D102、S195),经丝氨酸蛋白酶底物特异性口袋分析,显示其属于胰凝乳蛋白酶。PrCT1与黑脉金斑蝶胰凝乳蛋白酶(GenBank登录号:OWR53227)同源性最高,达到49%,且亲缘关系最近。构建pET28a-PrCT1原核表达重组载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株进行原核诱导表达。结果发现,重组PrCT1蛋白以包涵体形式存在,分子质量为33.26 ku。利用实时荧光定量PCR检测菜青虫不同组织中PrCT1 mRNA表达及饥饿、决明胰蛋白酶抑制剂喂食处理后PrCT1 mRNA的表达情况显示,PrCT1基因主要在菜青虫的中肠中表达,且在饥饿、决明胰蛋白酶抑制剂喂食处理后表达水平均下调,推测PrCT1可能是菜青虫中肠中发挥食物消化作用的重要蛋白酶,且可能是重要的抗虫靶点。

6个山黧豆品种的β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性及其关系分析

山黧豆(Lathyrus spp.)种质资源评价与筛选长期聚焦于获得低β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionicacid,β-ODAP)含量或低蛋白酶抑制剂活性的品种。为了研究β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性之间的潜在关系,该研究利用SDS-PAGE、酶活检测和相关性分析等方法对家山黧豆(L.sativus)、扁荚山黧豆(L.cicera)等6个山黧豆品种的蛋白酶抑制剂活性、β-ODAP含量及二者之间的关系进行了分析。结果表明:(1)不同山黧豆品种的醇溶蛋白和可溶蛋白电泳图谱呈现出显著的差异。(2)不同山黧豆种子的胰蛋白酶抑制剂活性介于100~190 TIU之间,胰凝乳蛋白酶抑制剂活性介于5~9 CIU之间。(3)β-ODAP含量与丝氨酸乙酰基转移酶活性的皮尔逊相关系数可达0.76,呈显著正相关关系。(4)山黧豆转录组数据(SRP145030)中的β-ODAP生物合成关键基因与Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(Bowman-Birk inhibitor, BBi)基因表达水平呈显著负相关关系。该研究结果为进一步探讨分析山黧豆β-ODAP和BBi生物合成的调控与平衡,改善山黧豆的含硫氨基酸水平等奠定了基础。

大豆蛋白酶抑制剂活性的测定

在测定胰蛋白酶活性和胰凝乳蛋白酶活性的基础上建立了蛋白酶抑制剂活性测定的方法。并用此方法测定了３种蛋白酶抑制剂的活性，即ＣＭ－ＢＢＩ、粗ＢＢＩ和豆浆晶粗ＢＢＩ，其活性（每ｍｇ抑制剂蛋白抑制酶的μｇ数）分别为１６６０９、１４４１和２２０．６。为了衡量该法的可靠性，我们还测定了Ｓｉｇｍａ厂出产的胰蛋白酶抑制剂的活性，所得结果与该厂测定的结果一致。故可利用该法选择抗癌食物。

韩发现养麦种子蛋白酶抑制剂具有抗人T-急性成淋巴细胞白血病细胞系的抑制活性

Applied Biochemistry and Biotechnology2004年117卷2期65～74页报道：已知马铃薯抑制剂Ⅰ族成员荞麦蛋白酶抑制剂BWT1可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，而与豌豆球蛋白族同源的新的蛋白酶抑制剂荞麦蛋白酶抑制剂BWI-2a，则只能抑制胰蛋白酶。

剪叶及昆虫取食对兴安落叶松蛋白酶抑制剂的影响

植物蛋白酶抑制剂是植物重要的防御物质之一。为了研究不同程度剪叶及昆虫取食诱导与兴安落叶松Larixgmelinii针叶内蛋白酶抑制剂活性变化的关系,分别以剪叶及落叶松毛虫Dendrolimus superans取食处理兴安落叶松幼苗,用紫外分光光度法测定不同处理后针叶内胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)活性变化。结果表明:落叶松毛虫取食及剪叶可诱导兴安落叶松产生系统性防御反应,处理后的1～20天,苗木针叶内TI和CI两种抑制剂活性产生显著变化,诱导产生的TI和CI的活性与损伤程度无显著相关性。相同损伤程度下,虫害诱导的TI活性高于剪叶损伤诱导的活性,但二者差异不显著;3种取食程度诱导的CI活性,只在第5天同时显著高于剪叶损伤诱导的抑制剂的活性。由此可见,可以通过适当的损伤处理取得与昆虫取食相似的植物抗性反应,这为林木病虫防治提供了新的思路。

机械损伤和茉莉酸甲酯对烟株蛋白酶抑制剂的诱导作用研究

为了进一步研究蛋白酶抑制剂对昆虫生长发育的影响,选取机械损伤和茉莉酸甲酯作为信号路径的激发子,研究了它们在不同条件下诱导烟株局部和系统性的胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂的表达。结果显示:机械损伤或茉莉酸甲酯处理后,烟株处理叶和系统叶中胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂含量都有不同程度升高;施用2.4mmol/L茉莉酸甲酯时两者的增加量最为显著;机械损伤能明显抑制2.4mmol/L茉莉酸甲酯的诱导作用,对1.2mmol/L茉莉酸甲酯具有协同作用。