胰十二指肠同源框基因-1在骨髓来源nestin阳性细胞的转染及表达

目的将真核表达载体pEGFP-C1-PDX-1转染大鼠骨髓来源nestin阳性细胞,并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法将已构建好的重组载体转染骨髓来源nestin阳性细胞,改变DNA的量、转染后培养基中的血清浓度,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率;转染后48h用RT-PCR检测目的基因的表达情况。结果质粒2～10μg获得最佳的转染效率,提高转染后培养基的血清浓度可提高转染后细胞存活率及转染效率。RT-PCR检测转染后骨髓来源nestin阳性细胞有PDX-1表达。结论通过优化转染条件提高了pEGFP-C1-PDX-1转染大鼠骨髓来源nestin阳性细胞的效率,为其成为组织工程的种子细胞提供了实验依据。

胰十二指肠同源盒基因-1启动子在肝干细胞分化研究中的应用

背景与目的利用报告基因监测肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。材料与方法通过PCR从小鼠基因组中克隆胰十二指肠同源盒基因-1(Pancreaticduodenalhomeobox-1,PDX-1)启动子片段,构建PDX-1启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体(pPDX-1EGFP),并利用报告载体标记的肝原始细胞系(Liverepithelialprogenitorcells,LEPCs)观察肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。结果获得PDX-1启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体及报告载体标记的LEPCs。结论pPDX-1EGFP报告载体的成功构建为研究LEPCs向胰腺细胞的转分化提供了简捷的分子工具。

内脂素通过激活胰岛素受体底物1/胰岛素受体底物2信号调节胰岛βTc6细胞功能、胰十二指肠同源框因子1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的研究

目的研究内脂素(Visfatin)对胰岛βTc6细胞胰岛素分泌能、胰十二指肠同源框因子1(PDX-1)及PPAR-γ表达的调节作用及与IRS-1/IRS-2、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的关系。方法体外培养βTc6细胞,不同浓度Visfatin(50、100、200 ng/ml)干预细胞不同时限(24、48 h),检测胰岛βTc6细胞胰岛素分泌及PPAR-γ、PDX-1、IRS-1、IRS-2、PI3K蛋白表达情况及运用IRS-1/2抑制剂干预Visfatin的作用。结果Visfatin干预可增加胰岛βTc6细胞胰岛素分泌(P<0.05),且受干预浓度和时间调节,100 ng/ml Visfatin干预24 h出现胰岛素分泌高峰(4.01±0.65)μU/ml。Visfatin可上调PPAR-γ、PDX-1的m RNA和蛋白表达(P<0.05),蛋白表达高峰值PPAR-γ(1.52±0.02),PDX-1(1.20±0.11),Western blot及免疫组织化学检测均显示50~100 ng/ml Visfatin干预可上调IRS-1、IRS-2蛋白表达(P<0.05),蛋白最显著值IRS-1(1.43±0.01),IRS-2(1.38±0.01);Visfatin对PI3K蛋白表达无影响(P>0.05)。运用IRS-1/2抑制剂(NT157)可减弱Visfatin的促胰岛素分泌和上调PPAR-γ、PDX-1蛋白表达作用。结论Visfatin具有促进胰岛β细胞胰岛素的分泌,上调PPAR-γ、PDX-1表达,但高浓度Visfatin的长时间干预降低这一效应。Visfatin的干预作用可能与调节IRS-1/IRS-2蛋白表达有关,但与PI3K无相关性。

真核过表达载体共转染3个胰岛发育关键基因在小鼠胎肝细胞内的表达

背景:大量文献表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子(如Pdx1、MafA及Ngn3)可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化。目的:构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体并共同转染胰十二指肠同源框蛋白(Pdx1)、神经源素3(Ngn3)及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)至小鼠胎肝细胞并检测其表达情况。方法:以基因组或小鼠胰腺cDNA为模板扩增Pdx1、MafA及Ngn3三个目的基因,应用分子生物学技术,将3个目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建小鼠系列真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF通过Lipofectamine2000介导的脂质体转染小鼠胎肝细胞系BNLCL.2,用反转录PCR以及间接免疫荧光法检测3个目的基因的表达情况。结果与结论:目的基因克隆正确,反转录PCR,间接免疫荧光法证实了脂质体转染后小鼠胎肝细胞中有Pdx1、Ngn3以及MafA的表达。结果表明,真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF可成功构建,并能够将Pdx1、Ngn3以及MafA三个基因转至小鼠胎肝细胞进行表达。

烟酰胺单核苷酸对RIN-m5f细胞中胰岛素分泌及PDX-1和FoxO1基因表达的影响(英文)

目的:在细胞水平研究烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)对胰岛素分泌的调节作用及其对与胰岛素分泌相关的重要转录因子胰十二指肠同源盒基因(pancreatic and duodenalhomeobox-1,PDX-1)和分叉头框家族转录因子1(forkhead box-containing protein O-1,FoxO1)基因表达的影响。方法:采用大鼠胰岛素ELISA试剂盒检测RIN-m5f细胞胰岛素分泌水平。用Real-time PCR检测RIN-m5f细胞PDX-1和FoxO1的mRNA表达水平。用Western印迹检测RIN-m5f细胞PDX-1蛋白表达水平。结果:用瑞格列奈10 nmol/L+NMN 100μmol/L处理RIN-m5f细胞48 h,与空白对照及DMSO对照组相比,胰岛素分泌量均显著增高(P<0.05);与NMN 50μmol/L组比较,胰岛素分泌量的增高也有统计学意义(P<0.05)。10,50和100μmol/L的NMN作用RIN-m5f细胞36 h,PDX-1的mRNA表达量均上调(依次为P<0.05,P<0.01,P<0.001)。100μmol/L剂量组与10μmol/L和50μmol/L剂量组比较差异也有统计学意义(P<0.001)。50,100和200μmol/L的NMN作用RIN-m5f细胞36或48 h,PDX-1的蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:NMN可以调控RIN-m5f细胞中胰岛素的分泌及PDX-1的mRNA表达水平。

Pdx1与Ngn3协同诱导LO2细胞分化为胰腺β样细胞

目的:胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)与神经源素3(Ngn3)联合诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化。方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1与Ngn3基因。应用分子生物学技术,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建pEGFP-C1/Pdx1与pEGFP-C1/Ngn3真核表达质粒,并共转染L02细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法检测目的基因及胰岛素相关基因葡萄糖转运体2(GLUT2)与胰岛素的表达情况。结果:目的基因克隆正确,RT-PCR、免疫组化、间接荧光证实转染后LO2细胞中有Pdx1、Ngn3和胰岛素及胰岛素相关基因GLUT2的表达。结论:Pdx1与Ngn3协同作用可诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化。

PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

【目的】探讨PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用。【方法】将C2C12细胞分别经过不同浓度的类胰高血糖素(GLP-1)诱导120h后,瞬间转染胰腺十二指肠同源框(PDX-1)基因,用RT-PCR检测PDX-1的表达,流式细胞仪、放射免疫法检测细胞内和培养基中是否存在胰岛素。【结果】GLP-1可以直接诱导C2C12细胞表达PDX-1;PDX-1瞬时转染C2C12细胞后,胰岛素分泌细胞阳性率比值(1.19±0.10)、培养基中的胰岛素含量(2.45±1.48)×10-6U/mL均明显升高(P<0.05);单独的40nmol/LGLP-1诱导与瞬间转染PDX-1相比,阳性率比值及胰岛素浓度的差别均无统计学意义。【结论】GLP-1可以诱导C2C12表达PDX-1,而且PDX-1可以促进C2C12分泌胰岛素。提示GLP-1诱导C2C12分化为胰岛素分泌细胞可能与PDX-1有关。

Apelin对葡萄糖的毒性作用及对胰岛细胞PDX-1表达的影响

目的探讨Apelin对葡萄糖毒性作用及对胰岛细胞胰十二指肠同源盒蛋白-1(PDX-1)表达的影响。方法在不同葡萄糖浓度下(正糖组5.6mmol/L,高糖组16.7mmol/L,极高糖组33.3mmol/L),+/-Apelin-36培养胰岛β细胞株NIT-1细胞3d,然后测定基础和葡萄糖刺激后胰岛细胞胰岛素分泌量,测定细胞内胰岛素含量和PDX-1蛋白及mRNA表达。结果与正糖组比较,高糖组和极高糖组的基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌、细胞内胰岛素均明显减少,PDX-1蛋白表达下降(P<0.05);与未加Apelin组比较,加Apelin高糖组和极高糖组的基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌、细胞内胰岛素明显减少,PDX-1蛋白表达下降(P<0.05);6组胰岛细胞的胰岛素水平与PDX-1蛋白表达呈正相关,与PDX-1mRNA表达无关。结论 Apelin可能通过降低PDX-1蛋白表达参与葡萄糖毒性作用,引起胰岛素分泌减少,从而在糖尿病的发病机制中发挥作用。

人TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建人TAT-PDX-1表达载体,并对其融合蛋白进行纯化。方法采用RT-PCR技术从人胰腺组织中获得目的基因hPDX-1,将TAT序列与PDX-1克隆到原核表达载体pET-28a;用IPTG诱导、表达融合蛋白;NiNTAagaros纯化融合蛋白,Western blot鉴定。结果目的片段PDX-1被有效扩增,DNA序列测定表明所构建重组质粒pET28a-TAT-h PDX-1与设计相同;TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化。结论成功地获得了TAT-hPDX-1融合基因的表达产物,为进一步研究及临床应用奠定了基础。

血清诱导乳鼠骨髓间充质干细胞表达胰岛样细胞基因效果观察

目的观察血清诱导乳鼠骨髓间充质干细胞(MSC)表达胰岛样细胞基因的效果。方法 SD乳鼠10只,手术分离胫骨和股骨,分离、培养MSC,分别采用5%(对照组)、10%(低浓度组)和20%(高浓度组)的胎牛血清(FBS)刺激。纯化至第4代时以MTT法检测MSC增殖趋势;诱导14 d时用RT-PCR检测MSC细胞中的巢素蛋白(Nestin)、胰十二指肠同源性盒因子-1(PDX-1)、Insulin mRNA,用免疫荧光法检测Nestin、PDX-1、Insulin蛋白。结果随着血清浓度增高与刺激时间延长,MSC呈现明显的增殖趋势,细胞形态发生改变,形成胰岛β细胞轮廓。高浓度组MSC Nestin mRNA表达低于对照组,PDX-1、Insulin mRNA表达高于对照组(P均<0.05)。诱导14 d时Insulin、Nestin、PDX-1蛋白表达与7d时比较,P均<0.05。结论血清诱导下乳鼠MSC中胰岛相关基因PDX-1、Insulin表达上调,Nestin表达减少,显示MSC在一定条件下可被定向诱导分化成胰岛样细胞。

PDX1正义表达载体的构建及表达

目的亚克隆人胰十二指肠同源框-1(PDX-1)基因,构建PDX1正义表达重组质粒。方法亚克隆PDX1基因至真核表达载体pcDNA3.1,双酶切及测序鉴定。同时瞬时转染胃癌细胞株,免疫印迹法检测PDX1的过表达。结果双酶切和测序鉴定结果正确;PDX1正义表达载体转染SGC7901和TMK1细胞24 h后,PDX1蛋白表达水平显著升高。结论成功获得正义表达重组质粒pcDNA-PDX1,顺利在胃癌细胞中过表达PDX1,为进一步研究PDX1在胃癌发生发展中的作用奠定了基础。

pdx-1基因克隆及其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

背景与目的克隆小鼠胰十二指肠同源框-12(PEGFP-C1pdx-1)基因,并构建pdx-1的表达载体。材料与方法通过RT-PCR方法从小鼠胰腺总RNA中克隆pdx-1基因,并将该基因构建到pEGFP-C1和pcDNA3.0中获得pdx-1的表达载体。通过观察荧光和RT-PCR方法检测表达载体转染SMMC-7721后pdx-1基因在细胞中的表达。结果克隆了883bp的pdx-1全长cDNA,成功构建了pEGFP-C1pdx-1和pcDNA3pdx-1两种表达载体。pEGFP-C1pdx-1转染SMMC-7721后,可观察到绿色荧光仅局限于细胞核中;通过RT-PCR方法在转染后的细胞中都检测到了pdx-1基因的转录。结论pdx-1表达载体的构建为进一步研究pdx-1基因在胰腺发育和肝干细胞增殖与分化方面的作用奠定了基础。

利用Tet-On系统构建稳定表达Pdx1的小鼠ESC细胞株

目的:利用Tet-On系统构建稳定表达胰十二指肠同源异形框1(Pdx1)的小鼠胚胎干细胞(ESC)株,为进一步研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化奠定了基础。方法:采用Tet-On系统构建具有绿色荧光蛋白标记及嘌呤霉素抗性的Pdx1过表达慢病毒载体并感染胚胎干细胞。实验分为空白对照组(ESC组)、空载慢病毒对照组(PDX1−ESC组)和Pdx1慢病毒转染组(PDX1+ESC组)。流式细胞术检测多西环素(DOX)筛选后转染细胞的阳性率;检测Tet-On系统功能及Pdx1的mRNA和蛋白表达。流式细胞分选仪分选转染细胞,构建稳定表达Pdx1基因的ESC株及阴性对照ESC株。结果:(1)DOX筛选后PDX1−ESC组的转染细胞阳性率为90.72%,PDX1+ESC组的转染细胞阳性率为94.01%。用流式细胞分选仪分选后PDX1−ESC组的转染细胞阳性率为97.84%,PDX1+ESC组为98.13%。(2)加入DOX后,PDX1−ESC组和PDX1+ESC组可见绿色荧光。PDX1+ESC组Pdx1的mRNA和蛋白表达明显增高(P<0.05)。不加DOX,则3组细胞均未见绿色荧光,且Pdx1 mRNA和蛋白表达的差异无统计学显著性(P>0.05)。(3)细胞株冻存3个月后复苏培养仍然存活,并受DOX调控。结论:利用Tet-On系统成功构建可诱导表达Pdx1的小鼠ESC株,为研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化提供了有效的细胞模型。

pEGFP-N1/PDX1真核载体的构建与表达

目的:构建胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor1,Pdx1)转录因子真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达能力及其生物活性。方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1基因编码序列,克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中,构建pEGFP-N1/Pdx1真核表达质粒,并转染L02细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法和Western Blot检测目的基因表达情况。结果:酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确;RT-PCR检测目的基因Pdx1 mRNA在靶细胞L02中表达;免疫组化和间接荧光结果证实Pdx1主要存在于细胞核内;Western blot检测到细胞核内Pdx1目的蛋白。结论:完成人Pdx1基因克隆,成功构建了目的基因Pdx1真核表达载体,并在L02细胞中获得有效表达。

用pdx-1和EGFP建立核定位信号的实验教学模型

目的建立核定位信号的实验教学模型.方法构建pdx-1基因和EGFP基因融合表达的表达载体,脂质体转染法将载体转入培养的HeLa细胞,荧光显微镜下观察.结果转染的HeLa细胞仅在细胞核发荧光,证明pdx-1蛋白的核定位信号将融合蛋白EGFP-pdx-1引导到细胞核.结论用转录因子pdx-1和增强型绿色荧光蛋白EGFP建立核定位信号的实验教学模型是可行的.

构建EGFP-PDX-1融合表达载体电穿孔转染大鼠胎肝干细胞的研究

目的构建PDX-1绿色荧光蛋白融合表达载体,电穿孔转染入大鼠胎肝干细胞以得到稳定表达。方法从SK900/BLSCRIPT质粒中扩增PDX-1,将其插入pEGFP-C1的多克隆位点中,构建重组质粒pEGFP-C1-PDX-1;分离培养大鼠胎肝干细胞,经鉴定后用电穿孔法转染;分析转染前后细胞生长曲线,荧光显微镜下观察、RT-PCR鉴定转染结果。结果重组质粒经酶切鉴定正确无误,经电穿孔转染后GFP和PDX-1基因均能在胎肝干细胞中保持较长时间稳定表达,并对胎肝干细胞的生长增殖影响较小。结论成功构建了PDX-1绿色荧光蛋白融合表达载体,能在胎肝干细胞中较稳定表达,为研究PDX-1在干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞中的调控作用提供了物质基础。

PDX-1腺病毒载体构建及其在脂肪间充质干细胞中的表达

研究通过重组腺病毒表达系统包装重组腺病毒Ad-PDX-1,通过重组腺病毒将Pancreatic duodenal homeobox1(PDX-1)导入大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose mesenchymal stem cells,rASCs)中,评价PDX-1在rASCs中的表达情况,为进一步探讨ASCs-PDX-1在体内修复糖尿病的潜能提供了实验基础。研究通过构建pAdEasy-CMV-PDX-1腺病毒质粒,在重组腺病毒表达系统PadEasy-1中成功包装出重组腺病毒Ad-PDX-1。培养及鉴定大鼠脂肪间充质干细胞,将携带PDX-1的重组腺病毒感染rASCs,通过RT-PCR、免疫荧光及免疫印迹(Western blotting)检测PDX-1在rASCs中的表达及产物定位。结果显示,构建的重组腺病毒包装成功,具有较高滴度,并能成功感染大鼠脂肪间充质干细胞。PDX-1蛋白定位于细胞核,并可稳定表达,为后续将大鼠脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞诱导分化奠定了基础,为糖尿病的干细胞治疗提供依据。

PDX-1基因克隆载体的体外构建

目的体外构建胰-十二指肠同源框-1(PDX-1)基因的克隆载体。方法采用TRIzol方法从大鼠胰岛细胞瘤细胞株中提取RNA,通过RT-PCR方法在体外扩增大鼠PDX-1 c DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定,割胶纯化后回收目的基因,与p MD-18T克隆载体连接构建,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定p MD-18T-PDX-1的正确构建。结果正确构建了含有PDX-1 c DNA的克隆载体p MD-18T-PDX-1,其中PDX-1 c DNA全长为908 bp。将经双酶切鉴定正确的p MD-18T-PDX-1细菌克隆进行测序,测定结果与Gen Bank中大鼠PDX-1基因序列(NM_022852.3)一致。结论成功构建了PDX-1基因克隆载体。该载体可为PDX-1基因分子生物学研究及PDX-1基因在诱导非β细胞向胰岛素分泌细胞分化中作用机制的研究提供基础。

PDXl与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上,替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4;双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上,得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒,然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒,并进行病毒滴度测定;体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;而RTPCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体,转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。

枸杞多糖对β-TC6细胞胰岛素分泌及相关基因的影响

目的研究枸杞多糖(LBP)对小鼠胰岛β-TC6细胞胰岛素分泌及相关基因的影响。方法用浓度为0、12.5、25、50、100、200、300μg/ml的LBP处理β-TC6细胞,MTT法检测细胞增殖活性,ELISA法检测LBP对葡萄糖刺激胰岛素的分泌水平,RT-PCR法检测胰岛素及相关基因mRNA表达。结果 LBP呈浓度依赖性地刺激β-TC6细胞生长。在葡萄糖浓度为20mmol/L的高糖环境下,LBP≥25μg/ml时胰岛素分泌明显增多(P<0.01)。LBP 12.5μg/ml、100μg/ml能显著降低胰岛素mRNA表达(P<0.01),但对胰十二指肠同源盒因子1、葡萄糖激酶和葡萄糖转运蛋白2基因mRNA表达无明显影响。结论 LBP的促胰岛素分泌作用可能与促进β-TC6细胞增殖有关,而与胰岛素相关基因表达无关。