小鼠胰岛的分离纯化及体外功能检测的实验研究

目的:探讨获得高质量小鼠胰岛的分离纯化方法,评价其功能。方法:采用胆总管内胶原酶灌注膨胀消化胰腺的方法分离小鼠胰岛,不连续密度梯度离心法纯化胰岛,用双硫腙(Dithizone,DTZ)对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,以葡萄糖和茶碱刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果:胰岛的产量和活性主要与胰腺均匀膨胀和胶原酶的消化时间有关。平均每个小鼠胰腺能得到150～250个高质量胰岛,活性>95%,纯度>90%。葡萄糖及茶碱(carbachol,Cch)刺激后胰岛素释放量明显增加。结论:改良的胆总管内胶原酶灌注膨胀消化小鼠胰腺及不连续密度梯度Ficoll-400纯化胰岛的方法,可获得产量较高、纯度及功能较好的胰岛。

大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定

目的通过改进胰腺消化和分离的技术条件,提高成年大鼠胰岛分离纯化产率和质量。方法用胶原酶Ⅺ液灌注消化成年SD大鼠胰腺,对胰岛分离纯化方法加以改进:以4种比重的Euro-Ficoll(F1:D=1.132,F2:D=1.108,F4:D=1.069)Hank’s(F5:D=1.023)不连续密度梯度离心,以离心半径15cm,2000r/min于4℃缓慢升降离心20min,收集位于F1和F2界面的胰岛。双硫腙特异染色法鉴定胰岛纯度;二醋酸酯荧光素/碘化丙啶染色法计算胰岛成活率;放射免疫分析法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌量,计算刺激指数。将胰岛当量(islets equivalent quantity,IEQ)为1000的胰岛移植于同品系糖尿病大鼠肾包膜下,9d内隔日观察动物血糖的变化,评价胰岛功能。比较分离条件优化前后收获胰岛的产率和质量。结果改进纯化方法后每只大鼠胰岛收获量为(920±122)IEQ,胰岛纯度>90%,胰岛细胞成活率为91%±2%。胰岛细胞功能良好,在低糖和高糖刺激后培养液中胰岛素浓度分别为(18.25±0.32)mU/L和(36.70±3.57)mU/L,刺激指数为2.01±0.15。1000 IEQ胰岛移植于糖尿病大鼠肾包膜下,观察期内可维持动物血糖水平正常。结论改进后的胶原酶灌注消化和不连续梯度离心方法提高了胰岛的产率,保证了胰岛的高纯度及高成活率。

一种简易高效的大鼠胰岛分离纯化方法

目的探索一种高效、高纯度大鼠胰岛分离纯化方法，并研究纯化后的胰岛细胞在体内外环境中的基本生物学功 能状况。方法采用 Ｈａｎｋｓ液经胰管内注射法机械性扩张破坏大鼠胰腺的腺泡组织点后将其剪碎置于含 １ｇ／Ｌ胶原酶 的 Ｈａｎｋｓ 液中，于 ３７℃中静止消化 ２５～３０ｍｉｎ后移入含 １０％胎牛血清的 ＲＭＰＩ－１６４０完全培养液中，２４℃短期培养， Ｆｉｃｏｌｌ－４００非连续密度梯度液离心纯化胰岛，纯化后的胰岛进行异种移植。结果经Ｆｉｃｏｌｌ－４００纯化后，平均每只成年 Ｗｉｓｔａｒ大鼠胰腺能获得 ９２０～ｌ ２３０个胰岛，纯度可达 ９８％以上；在葡萄糖刺激下胰岛素释放量约为基础分泌水平的 ２．２ 倍（Ｐ＜０．００１）纯化后的胰岛异种移植可逆转实验性糖尿病ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的高血糖平均达（８．７±１．６）ｄ。结论胰腺消化 物经短期培养后再进行胰岛纯化的方法具有耗酶量少、技术难度小、胰岛纯度和产率及活率高的特点，是一种简便易行 的高效分离纯化方法．

大鼠胰岛分离纯化技术的改进

目的探索成年大鼠胰岛的分离纯化理想方法,并对获得的胰岛进行体外功能鉴定。方法通过用胶原酶P液灌注分离成年SD大鼠胰岛,不连续密度梯度离心法纯化胰岛,STZ染色鉴定胰岛,AO/PI染色鉴定胰岛活率,胰岛素释放试验判定胰岛功能,光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果纯化后每只大鼠胰岛收获量为(629±102)IEQ,胰岛纯度>90%,胰岛细胞活率>90%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在低糖和高糖刺激下的浓度分别为(3.701 5±0.492 0)mIU/L和(10.477 1±2.233 4)mIU/L,刺激指数为2.837 8±0.102 3,体外培养48h几乎完全贴壁,培养3周生长状况仍良好。结论分离条件把握好后,胶原酶P消化、Fi-coll400非连续密度梯度离心法可获得高纯度高活率的大鼠胰岛。

多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

【目的】采用不同的分离或消化方法 ,探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。【方法】将 2 5只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为 5组 :①A组 :胆总管灌注胶原酶P ;②B组 :胆总管灌注Hanks液 ;③C组 :胆总管不灌注液体 ;A、B、C 3组胰腺直接分次消化 ;④D组 :胆总管不灌注 ,胰腺剪碎后分次消化 ;⑤对照组 :胆总管灌注胶原酶P ,胰腺直接单次消化。将分离的胰岛沉淀物用Ficoll 4 0 0纯化并培养 ,再把胰岛细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。【结果】纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组 ,而D组最低 ;A、B和D 3组的纯度均高于对照组或C组 ;在胰岛成活率方面 ,A、B、C 3组均高于对照组或D组。移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。【结论】经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性。

大鼠胰岛分离纯化和功能分析的研究

目的:探讨大鼠胰岛分离纯化的方案。方法:采用胰管内灌注胶原酶Ⅴ消化、Histopaque-1077密度梯度离心分离纯化20只雄性SD大鼠胰岛。椎虫蓝染色判断胰岛存活率,双硫腙染色后计数胰岛,葡萄糖刺激胰岛素释放实验评估胰岛功能,同种异体胰岛门静脉移植治疗5只链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠,监测血糖变化。结果:分离纯化后平均胰岛得率为(646±67)个/大鼠,存活率达到90%以上。新鲜分离的胰岛呈椭圆或圆形,悬浮于培养液面,胞膜光滑完整,直径大于150μm的细胞团占95%以上。葡萄糖刺激的胰岛素释放试验结果表明:第1、3、5天胰岛的刺激指数分别为2.6倍、1.7倍和1.4倍,两组间低糖和高糖的胰岛分泌量差异均有显著性(P<0.05)。胰岛门静脉移植术后,第2天大鼠血糖降至11.1mmol/L,8天内血糖可控制在15mmol/L以下,随后血糖逐步升高。结论:采用胰管内灌注胶原酶Ⅴ消化联合Histopaque-1077分离纯化是一种较好的大鼠胰岛分离方法,胰岛得率较高且功能良好。

一种简便分离纯化大鼠胰岛方法的探索

目的 探索可大量获取纯化大鼠胰岛的最佳方法。方法 采用胰管内灌注生理盐溶液 KRBB, 外置胶原酶消化法及用单核细胞分离液Histopaque 1077纯化胰岛。结果 成年Wistar大鼠胰腺消化后能获得 (540±84) 胰岛/胰腺, 纯化后获得 (335±81) 胰岛/胰腺, 纯度可达90%。纯化后的胰岛培养上清液中未检测到胰淀粉酶。胰岛培养1周后, 胰岛素分泌量仍保持较旺盛状态。结论 本方法能获得大量纯度较高且活性好的胰岛, 是一种简便高效的胰岛分离方法。

大鼠胰岛的分离和纯化

目的探讨获得足够数量和较高纯度大鼠胰岛的分离和纯化方法。方法采用Ⅴ型胶原酶灌注消化法分离成年大鼠胰岛,Ficoll400非连续密度梯度法纯化胰岛。双硫腙(DTZ)染色鉴定培养的胰岛细胞,锥虫蓝染色检测细胞活性。葡萄糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛细胞的功能。结果分离纯化后大鼠胰岛平均收获量为(480±30)IEQ,纯度大于90%,活性大于90%。在低糖和高糖刺激下,胰岛素分泌量分别为(12.28±0.89)mIU/L、(19.01±1.49)mIU/L,二者相比较,差异有统计学意义(P<0.05),刺激指数为(1.55±0.01)。结论胶原酶Ⅴ逆行灌注消化胰腺和Ficoll400非连续密度梯度纯化法,可获得高纯度高活率的大鼠胰岛。

Dextran分离纯化大鼠胰岛的生物学特性

目的探讨一种分离纯化大鼠胰岛的方法，并评价该法分离得到的胰岛的生物学特性。方法常规外科手术分离胰腺。然后将其剪为lrnm3左右碎块，置于0．9mg／ml胶原酶V37℃振荡消化10～17min，以含10％胎牛血清的Hank’s液终止消化。60目筛网过滤。DextranT40非连续密度梯度离心纯化胰岛。纯化后的胰岛经DTZ染色，吖啶橙／碘化丙啶（AO／PI）染色、放射免疫分析检测胰岛素分泌量，纯化后的胰岛进行异种移植，检测降糖效果。结果胰岛分布于11％Dextran和1640及11％和22％Dextran界面之间，平均每只Wistar大鼠消化后可获得2181士14个胰岛，纯化后回收1826±24个胰岛，胰岛收获量达（85．7±5．9）％，纯度高达95％以上。胰岛对葡萄糖刺激有良好的反应性，纯化后胰岛异种移植，可逆转实验性糖尿病SD大鼠血糖7～10天。结论胶原酶消化，Dextran T40纯化是一种简单、高效的胰岛分离纯化方法，获得的胰岛有良好的生物学特性。

大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响

目的探讨提高大鼠胰岛细胞产量和纯度的最佳分离纯化方法。方法40只大鼠分为4组,每组10只。A组:Hanks液灌注+胶原酶V消化+Ficoll400梯度纯化;B组:组织剪碎研磨+筛网过滤;C组:胶原酶V灌注+Ficoll400梯度纯化;D组:胶原酶V灌注+筛网过滤。对用四种不同方法分离纯化的结果进行比较。结果完全随机设计的方差分析显示,A、B、C、D组收获量及纯度比较均有显著性差异(P<0.05);组间多重比较显示,A组收获量均高于B、D组(P<0.05),与C组比较差异无统计学意义(P>0.05);A组纯度与其他组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论用胶原酶V或Hanks液灌注,Ficoll400梯度纯化法所收获胰岛细胞的产量和纯度较高,而且价格低廉,是一种较理想的胰岛细胞分离纯化方法。

NOD小鼠胰岛分离与纯化的方法研究

目的 :研究非肥胖性糖尿病 (NOD)小鼠胰岛分离与纯化的方法。方法 :采用改良的胰导管逆行灌注胶原酶静止消化胰腺 ,分离成年NOD小鼠胰岛 ,不连续密度梯度Ficoll液 (2 5 % ,2 3% ,2 0 5 % ,11% )离心、纯化胰岛。用双硫棕 (Dithizone ,DTZ)对胰岛进行特异性染色 ,以葡萄糖刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果 :不同浓度 (0 5mg·ml-1,1mg·ml-1,2mg·ml-1)的胶原酶在不同时间 (2 0min ,4 0min ,6 0min)内静止消化胰腺后收获的胰岛数量和胰岛活性不同 ,采用 1mg·ml-1浓度的Ⅺ型胶原酶消化 4 0min后效果最好 ,平均能得到 (195± 8)个胰岛 /胰腺 ,活性 >90 % ,纯度 >90 %。DTZ染色后胰岛呈红色 ,形态完整。高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激后的 2倍。结论 :改良的胰导管逆行灌注胶原酶静止消化NOD鼠胰腺 ,及不连续密度梯度Ficoll液纯化胰岛的方法 ,可获得数量较多 ,纯度较高和功能较好的胰岛。

新生期小鼠胰岛分离纯化方法的研究

目的:探讨新生期小鼠胰岛分离纯化方案。方法:采用胰腺局部充盈、胶原酶Ⅴ消化,对比不同消化时间及单纯显微镜下手挑胰岛或Histopaque-1077纯化对胰岛得率的影响,并通过胰岛素/胰高血糖素双染后流式细胞术检测胰岛β和α细胞构成比例。结果:在1 mg/ml酶浓度下,1周和3周小鼠胰岛的最适消化时间分别为23 min(胰岛/胰腺38.11±2.78)和25 min(胰岛/胰腺66.06±2.61)。1周以直径<50μm胰岛居多(P<0.01),而3周以50～99μm者居多(P<0.01)。单纯手挑组胰岛得率显著高于Histopaque-1077纯化组(P<0.05)。所得胰岛存活率和纯度均>90%,且存在β和α细胞构成比例的动态变化(P<0.05)。结论:胰腺局部充盈、胶原酶Ⅴ消化后镜下手挑胰岛是一种较好的新生期小鼠胰岛分离纯化方法,消化时间和纯化方法是其重要影响因素。

Wistar大鼠胰岛细胞体外分离、纯化及鉴定(英文)

目的探索Wistar大鼠胰岛分离纯化的最佳条件。方法采用肝胰管内灌注胶原酶消化分离胰岛及Ficoll 400密度梯度离心纯化。纯化后的胰岛经组织学染色、电镜及放射免疫法鉴定其特异性和活力。结果组织学染色显示纯化后胰岛的活力和纯度分别在95%和85%以上。电镜显示纯化后的胰岛形态完整,包膜清晰,分泌颗粒丰富。放射免疫结果表明,低糖组和高糖组分泌胰岛素的浓度有显著差异,证明胰岛功能良好。结论肝胰管内灌注胶原酶消化法是一种好的消化方法。影响胰岛收获量的因素很多,例如胰腺的充分扩张,胶原酶的浓度和活性以及消化的时间等。

成年大鼠胰岛分离纯化的实验研究

为探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法 ,为成人胰岛细胞的分离纯化奠定基础 ,采用胰管内注射胶原酶水浴孵化以及不连续密度梯度法进行成年Lewis大鼠胰岛分离纯化 ,并对获得的胰岛细胞通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验进行功能活性检测。分离后获得 (93 8± 2 1 8)个胰岛细胞 ,染色观察胰岛细胞形态完好。纯化后获得 (80 2±1 81 )个胰岛细胞 ,平均纯度为 (68± 1 1 ) % ,纯化后细胞回收率为 (85 .9± 5 .9) % ,纯化后细胞形态完好。体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验 ,低糖情况下胰岛素分泌量为 (2 .5 3± 0 .1 8)mIU/L ,高糖情况下为 (5 .41± 0 .3 1 )mIU/L ,两者相比有极显著性差异 (P =0 .0 0 1 )。低糖刺激下C肽分泌量为 (7.5 1± 1 .0 9)ng/L ,高糖情况下为 (8.5 6± 1 .0 6)ng/L ,具有极显著性差异 (P =0 .0 0 6)。提示 :采用胰管内胶原酶灌注水浴孵化进行成年大鼠胰岛分离及不连续密度梯度法纯化可获得较多的〔(80 2± 1 81 )个〕形态及功能完好的胰岛细胞 。

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的探寻提高大鼠胰岛细胞分离纯化技术的方法。方法通过用胶原酶灌注及不连续密度梯度离心法分离纯化胰岛细胞,用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和糖尿病大鼠移植判定胰岛细胞功能。结果纯化后每只胰腺获得(768±135)个胰岛细胞,纯度为(81.5±11.6)%;纯化后细胞形态完好,活度大于92%。体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,低糖情况下胰岛素分泌量为(23.16±4.13)mU/L,高糖情况下为(36.82±4.34)mU/L,两者有显著性差异(P<0.05)。胰岛移植后,实验组48 h后血糖值降至正常。结论用胰管内胶原酶灌注及不连续密度梯度法纯化可获得较高纯度、功能均良好的胰岛细胞。

大鼠胰岛分离纯化方法的改进

目的探寻提高大鼠胰岛分离纯化技术的方法。方法通过用胶原酶灌注分离纯化胰岛,用双硫棕染色,台盼蓝染色和胰岛素释放试验来鉴定胰岛的数量、形态和功能。结果改进方法后穿刺灌注成功率达96.7%,分离纯化后每只大鼠可获得483±83个胰岛,胰岛存活率及纯度均90%以上,胰岛素释放指数为2.4462±0.1187。结论良好的胶原酶灌注消化和梯度离心可以获得形态和功能均良好的胰岛。

一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞分离纯化方法

采用改良的胶原酶P胆总管内逆行灌注膨胀胰腺的分离方法,比较Ficoll-400不连续密度梯度离心法和人工挑取法两种纯化胰岛的方法,用双硫腙(DTZ)对胰岛细胞团进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,用台盼蓝染色判定胰岛细胞活性,使用间接免疫荧光法检测体外培养7 d后胰岛的功能.采用人工挑取法平均每只小鼠可获取的胰岛细胞团(245±35.6个)明显高于密度梯度离心法(120±26.3个)(n=5,P<0.05),两种方法分离纯化的胰岛活力均大于98%;但人工挑取法获得胰岛细胞团的纯度(100%)要高于密度梯度离心法(90%);纯化胰岛所用时间,采用人工挑取法(22±4 min)也少于密度梯度离心法(31±3 min).间接免疫荧光染色检测体外培养7 d后的胰岛细胞团,两种方法分离纯化的胰岛细胞团均具有良好的功能.胶原酶P胆总管内灌注消化分离法联合人工挑取纯化胰岛细胞团的方法,是一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞团分离纯化方法.

成年猪和大鼠胰岛分离纯化的实验研究

目的选择最佳猪、鼠胰岛的制备方法。方法采用不同的胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果选出了制备适合猪、鼠胰岛的最佳方法。结论由于猪、鼠胰腺结构的不同，制备胰岛细胞应采取不同的消化及纯化方法。

大鼠胰岛分离、纯化技术改良

目的:探讨SD大鼠胰岛分离、纯化的较优方案,并评价依该法分离所得胰岛的生物学特性。方法:以浓度为0.75mg/ml的Ⅺ型胶原酶经胆管充分灌注大鼠胰腺;完整分离后以37℃水浴振荡消化17min,Dextron70不连续密度梯度(1.091、1.081及1.037)离心法分离、纯化胰岛;以DTZ染色鉴定胰岛并计算得率,AO-PI染色检测胰岛活性,糖刺激试验判定胰岛功能,胰岛"细胞免疫细胞化学鉴定"细胞,光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果:纯化后,每只大鼠胰岛收获量为(743.60±43.07)个,胰岛纯度>90%,胰岛细胞活率>90%。在45min内每10个胰岛细胞在低糖和高糖刺激下分泌的胰岛素浓度分别为(25.35±7.00)μIU/ml和(86.48±12.75)μIU/ml。结论:依改良后的分离纯化方案分离大鼠胰岛可获得高纯度高活率的胰岛细胞,且细胞形态正常、功能良好。

应用淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的实验研究

目的 :建立一种简便、易行和高效的胰岛分离纯化方法 ,以减少对胰岛细胞的损伤 ,获得高质量的胰岛组织。方法 :选用SD大鼠经胆总管原位灌注胶原酶液 ,分离消化胰腺组织 ,用淋巴细胞分离液 (histopaque 10 77)纯化胰岛细胞。结果 :可收获大量的高纯度胰岛 ,纯度达 95 %以上 ,体外葡萄糖刺激实验表明胰岛对刺激反应良好 ,将胰岛移植于糖尿病小鼠体内可短期纠正其高血糖状态。结论 :应用单一密度淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的方法是一种操作简单、价格低廉、重复性好的大鼠胰岛纯化方法。