Obestatin抑制胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流

目的观察obestatin对胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流的影响。方法应用穿孔全细胞膜片钳技术研究obestatin对培养的胰岛β细胞株INS-1细胞膜L型电压敏感钙通道电流(L-type calcium ion channel current,ICa,L)的影响。结果胰岛β细胞株INS-1细胞钳制膜电位为-20 mV时,分别给予胰岛β细胞株INS-1细胞0nM(对照组)和1、10、100nM obestatin灌流5min后,ICa,L峰值呈浓度依赖性降低,各组为给药前的(97±8)%、(91±7)%、(60±9)%和(45±6)%。其中,10nM和100nM obestatin灌流5 min后ICa,L峰值与对照组相比显著减小(P<0.01,n=5)。胰岛β细胞株INS-1细胞钳制膜电位分别为-30、-20、-10和0mV时,给予10nM obestatin之前,其ICa,L峰值分别为(-5.48±0.69)、(-5.70±0.68)、(-5.58±0.61)和(-3.90±0.44)pA/pF,灌流10nM obestatin 5 min后,ICa,L峰值分别下降至(-3.11±0.68)、(-3.60±0.99)、(-3.26±1.03)和(-2.28±0.71)pA/pF,均明显低于obestatin给药前(P<0.01,n=5)。结论 obestatin可抑制胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流。

双益方剂及其有效成分对胰岛素抵抗小鼠胰岛β细胞株胰岛素分泌、增殖、凋亡的影响

目的观察双益方及其有效成分对胰岛素抵抗的小鼠胰岛β细胞株Min6胰岛素分泌水平和细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法培养Min6细胞并分为正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组、双益方组方单味中药组(山茱萸、黄芪、黄连、葛根、桑白皮、佩兰)及双益方有效成分组(1-脱氧野尻霉素、小檗碱、黄芪甲苷、熊果酸、马钱苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素)。正常组加入无酚红培养液正常培养;其余各组加入葡萄糖和棕榈酸制作胰岛素抵抗的Min6细胞模型。二甲双胍组加入100μg/L的二甲双胍。双益方组、山茱萸组、黄芪组、黄连组、葛根组、桑白皮组、佩兰组、葛根素组、1-脱氧野尻霉素组、小檗碱组、黄芪甲苷组、马钱苷组、熊果酸组、毛蕊异黄酮葡萄糖苷组分别加入50、100、200μg/L的相应药物。各组于给药24 h后进行胰岛素分泌实验,检测胰岛素分泌水平。各组分别于给药24、48 h采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。于给药24 h后采用双染法检测正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组的凋亡细胞,计算细胞凋亡率;采用Western blotting法检测细胞中的ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白。结果 IR模型组细胞高糖、低糖刺激下胰岛素分泌水平均低于正常组(P均<0.05)。二甲双胍组、黄芪组、葛根组、双益方组、黄芪甲苷组、山茱萸组、1-脱氧野尻霉素组、葛根素组、小檗碱组胰岛素分泌水平高于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞增殖能力低于正常组(P均<0.05);二甲双胍组、双益方组、黄芪组、黄芪甲苷组、1-脱氧野尻霉素组、山茱萸组细胞增殖能力高于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞凋亡率高于正常组,双益方各组细胞凋亡率均低于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞中MEK1/2、ERK1/2、pERK1/2蛋白相对表达量低于正常组(P均<0.05);二甲双胍组及双益方组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量高于IR模型组(P均<0.05)。结论双益方及其黄芪、葛根、黄芪甲苷、山茱萸、1-脱氧野尻霉素、葛根素、小檗碱等成分可有效提高胰岛素抵抗的Min6细胞的胰岛素分泌水平,促进细胞增殖并抑制其凋亡,作用机制可能与ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表达上调有关。

球型脂联素对高糖诱导胰岛β细胞株NIT-1活性氧簇产生的影响

β细胞功能障碍是2型糖尿病发病机制的一个重要环节；但长期高血糖如何损害β细胞功能的分子机制仍未完全清楚。研究表明氧化应激参与β细胞的“葡萄糖毒性”。球型脂联素（globular adiponectin，gad）与机体氧化应激水平有关，可能是通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD（P）H]氧化酶相关机制，而NAD（P）H氧化酶途径是B细胞中活性氧簇（ROS）产生增加的重要途径之一。本实验探讨gAd对高糖诱导胰岛β细胞株NIT-1ROS的产生是否有影响，及其可能的相关机制。

穿心莲内酯衍生物抗H2O2诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究

采用蛋白组学方法筛选穿心莲内酯衍生物（AL-1）抗过氧化氢诱导胰岛RIN—mβ细胞凋亡的差异蛋白质分子并探讨其作用分子机制。结果显示：AL-1浓度依赖性地提高H2O2处理的胰RIN-mβ细胞的存活率。经蛋白组学研究分析，成功地鉴定了18个与凋亡、应激等相关的蛋白，包括Prohibitin、Shmt2、RhoGDP-dissociation inhibitor-1、Galectin-1、Cytb5、Hsps等；与对照组（H202）相比，处理组（AL-1＋H2O2）中，有9个表达上调的蛋白和9个表达下调的蛋白。AL-1过调控与细胞凋亡、应激等相关的蛋白发挥其抗H2O2诱导的凋亡作用。

猪胰岛素启动子调控EGFP表达载体的优化及体外验证

目的获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础。方法利用猪胰岛素启动子(PIP,包含5'调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5 kb)构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-Hind IIIEGFP。鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化:将Hind III酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3'端的内含子剪接受体位点(splicing acceptor site,SA)突变为Hind III内切酶识别位点,命名为PIP-SA(M)-EGFP。三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48 h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Western blot检测,验证载体的表达效率。结果转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光。RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异:载体PIP-Hind III-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA(M)-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Western blot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高。结论通过突变胰岛素启动子第一内含子的3'端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪。