兔脂肪干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞的可行性

背景:胚胎干细胞、胰腺干细胞、肝卵圆细胞、小肠上皮干细胞和骨髓间充质干细胞均可以在体外诱导分化为胰岛β样细胞,那么脂肪干细胞是否也可以呢?目的:探讨兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。方法:以常规方法从兔脂肪抽吸物中分离、培养脂肪干细胞;传2代后,用高浓度葡萄糖(25mmol/L)培养液DMEM以及碱性成纤维生长因子和尼克酰胺诱导兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化。结果与结论:第2代兔脂肪干细胞经过高糖诱导后,细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。说明兔脂肪干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。

诱导多能干细胞分化为胰岛β样细胞的研究进展

人类诱导多能干细胞(iPSCs)是通过体外基因转染、小分子化合物处理等方法诱导体细胞重编程而获得的类似胚胎干细胞的多能性干细胞,在体外将其诱导为有分泌胰岛素功能的具有3D结构的胰岛β样细胞进行移植治疗糖尿病,可以较好地解决既往成体胰岛移植所面临的伦理、来源受限等诸多难题。人类iPSCs诱导分化成胰岛β样细胞需内外因子体外联合调控,但目前尚无统一标准诱导方法大量并稳定的获得胰岛β样细胞,且存在致瘤风险及免疫排斥两大关键问题。因此,iPSCs来源的胰岛β样细胞移植治疗糖尿病是未来亟待解决的重点和难点问题。

Pdx1基因修饰的人脐带间充质干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞

本研究探讨胰十二指肠同源框因子-1(Pdx1)基因修饰的人脐带间充质干细胞(MSCs)体外分化为胰岛β样细胞。采用携带Pdx1基因的重组腺病毒感染MSCs 7d,联合细胞因子分阶段诱导分化。RT-PCR及Westernblot、免疫细胞化学法检测诱导后细胞胰岛素相关基因表达变化;化学发光法检测诱导后细胞培养液上清中胰岛素和C肽的分泌水平。用流式细胞术检测胰岛素阳性细胞百分率。结果显示:诱导转入Pdx1基因的人脐带MSCs后,梭形细胞聚集形成胰岛样细胞团,双硫腙染色胞浆呈亮红色;诱导后的细胞表达Pdx1、胰岛素、C肽和葡萄糖转运体2基因;诱导细胞分泌胰岛素和C肽,并且在高糖作用后,胰岛素和C肽分泌增加;诱导后胰岛素阳性细胞百分率为(11.61±4.83)%。结果表明,Pdx1修饰人脐带MSCs在体外能够诱导分化为胰岛β样细胞。

胰十二指肠同源框因子-1联合细胞因子诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β样细胞的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外诱导分化为胰岛β样细胞的办法。方法用含胰十二指肠同源框因子-1基因（pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX1）重组腺病毒（Adxsi—CMV—PDX1）感染人脐带MSCs，再联合多种细胞因子进行诱导分化。应用RT—PCR、免疫荧光染色法检测诱导后细胞的PDX1、胰岛素（insulin）、神经元素3（ngn3）、葡萄糖转运体2（glut2）、NK转录因子6．1（NKX6．1）mRNA的表达；化学发光法检测诱导后细胞培养上清中胰岛素和C肽的分泌精；流式细胞仪检测胰岛素阳性细胞率。结果Adxsi—CMV—PDX1感染脐带MSCs并联合细胞因子诱导后，细胞从短梭形变成长梭形，并聚集形成胰岛样细胞团，经双硫腙染成亮红色。诱导17d后的细胞表达PDX1、ngn3、NKX6．1、insulin、glut-2的mRNA；细胞胞质内有胰岛素和C肽；细胞培养上清中胰岛素和C肽含量分别为（473．1±51．5）mU／L和（1．61±0．41）ng／ml，用25mmol／L高糖刺激1h后，胰岛素和C肽分泌量高达（964．4±68．1）mU／L和（3．72±1．52）ng／ml；胰岛素阳性细胞率达（11．6±4．8）％。结论PDX1转入脐带MSCs后，联合细胞因子在体外能够诱导其分化为胰岛β样细胞，胰岛素和C从分泌水平较高，且对高糖刺激有反应，但还不是完全成熟的β细胞。

PDX1基因促进骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的实验研究

探讨骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化过程中PDX1基因的促进作用。方法:从我院接受干细胞治疗的患者身上收集了骨髓样本,应用双硫腙染色和流式细胞仪检测分化过程中巢蛋白的表达。结果:与空白载体病毒组相比,PDX1载体病毒组细胞双硫腙染色形成棕色络合物,可以认定PDX1基因可以诱导干细胞向胰岛B细胞的转化,且诱导作用与单纯的慢病毒无关系。结论:PDX1基因可以诱导骨髓间充质干细胞向胰岛B细胞的分化,对罹患1型糖尿病高风险的个体具有有益的作用。

shRNA-NRSF基因促进骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的实验研究

探究骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化过程中shRNA-NRSF基因所起到的促进作用。 方法:招募20名志愿者进行骨髓提取,培养骨髓间充质干细胞进行分化实验。应用RNA干扰(RNAi)筛查来促进基因功能的评估;应用双硫腙染色鉴定细胞分化;应用BD Aria-III流式细胞仪检测分化过程中巢蛋白的表达。结果:诱导第28天细胞用双硫腙染液染色鉴定,追踪显示了潜在的?细胞再生。与空白载体病毒组相比,shRNA-NRSF载体病毒组细胞双硫腙染色形成棕色络合物。可以认定shRNA NRSF基因沉默可以诱导干细胞向胰岛B细胞的转化,且诱导作用与单纯的慢病毒无关系。结论:shRNA-NRSF质粒可以诱导骨髓间充质干细胞向胰岛B细胞的分化。

人脂肪间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的体外研究

目的探讨体外诱导人脂肪间充质干细胞（hADSCs）向胰岛β样细胞分化的方法。方法手术获取人脂肪组织，分离培养hADSCs，流式细胞术鉴定其分子表面标志。应用含胰十二指肠同源框因子1（PDX1）与神经元素3（Ngn3）的慢病毒转染hADSCs，并联合乙基咔唑（NECA）及多种细胞因子进行诱导分化后，采用实时定量聚合酶链反应（Real—time PCR）检测胰岛素分泌细胞特异基因肌腱膜的纤维肉瘤肿瘤基因同系物A（Mafa）、胰岛素1（Insulin1）、葡萄糖转运体2（Glut2）及叉头蛋白转录因子01（Fox01）的表达，采用免疫荧光法鉴定诱导后细胞内胰岛素及C肽的表达，采用化学发光法检测诱导后细胞的胰岛素分泌水平。结果hADSCs、CD105、CD44、CD29及CD90表达阳性，CD45及CD34表达阴性。Real-time PCR结果显示诱导后的细胞高表达PDX1、Ngn3、Insulin1及Glut2；免疫荧光结果显示诱导后的细胞胞质内表达胰岛素及C肽；化学发光法测得诱导后的细胞胰岛素分泌量为（156．23±30．97）mIU／L，高糖刺激后分泌量为（836．50±231．22）mlU／L。结论人脂肪间充质干细胞在体外可以通过转染含PDX1和Ngn3慢病毒并联合NECA及多种细胞因子的方法诱导分化为胰岛B样细胞。