Hes1在hUMSCs向胰岛前体细胞诱导过程中的表达改变

目的:探讨Notch信号节点分子Hes-1以及神经元素3(neurogenin 3,Ngn3)在人脐带间充质干细胞(human umbilicalcord mesenchyreal stem cells,h UMSCs)向胰岛前体细胞分化过程中的表达变化.方法:(1)分离培养并鉴定h UMSCs;(2)采用联合分阶段诱导法,取P5代h UMSCs向胰岛前体细胞分化,倒置相差显微镜观察诱导前后细胞形态变化,免疫组织化学技术检测诱导后Insulin、Ngn3、胰高血糖素的表达;(3)诱导后7、14、21 d分别取细胞进行免疫组织化学法、Western blot检测Hes1以及Ngn3的表达变化.结果:h UMSCs经诱导后,细胞胞体呈现宽大形态,并出现胰岛前体细胞的集落,免疫组织化学技术检测诱导后细胞Ngn3、Insulin、胰高血糖素呈阳性表达;Western blot检测Ngn3在诱导过程中逐渐升高,诱导14 d(E2组)达到峰值,21 d(E3组)下降;Hes1的表达7-14 d与空白对照组(CG组)无明显差异,与21 d(E3组)下降.结论:在h UMSCs向胰岛前体细胞诱导过程中Notch信号通路节点分子Hes1表达改变可能参与诱导后细胞进一步分化的调节过程.

葡萄糖转运蛋白2在人脐带间充质干细胞向胰岛前体细胞分化过程中表达的变化

目的探讨葡萄糖转运蛋白2(Glut2)在人脐带间充质干细胞(h UMSCs)向胰岛前体细胞分化过程中的表达变化。方法分离、培养、鉴定及诱导h UMSCs,分别收集诱导过程中第7天、14天和21天细胞和细胞上清液,采用免疫细胞化学、ELISA、免疫荧光、Western blotting及Real-time PCR检测诱导后细胞相关蛋白和基因的表达。结果免疫组织化学检测诱导后细胞胰腺十二指肠同源盒基因-1(PDX-1呈阳性表达;免疫荧光检测诱导后细胞Ngn3和胰岛素呈阳性表达;Western blotting检测Glut2在诱导过程中逐渐升高,诱导14 d达到峰值,与正常组比较P<0.01;Real-time PCR显示,Glut2基因自第7天即增高(P<0.05)。结论 h UMSCs经诱导后分化为胰岛前体细胞,表达Glut2后能引起胰岛素分泌,已初步具有胰岛B细胞功能。

神经元素3基因沉默对脐源性胰岛前体细胞MafA表达的影响

目的探讨神经元素3(Ngn3)基因在人脐带间充质干细胞(h UMSCs)向胰岛前体细胞分化过程中的作用以及对肌腱膜纤维肿瘤基因同系物A(MafA)表达的影响。方法组织块法分离培养并鉴定h UMSCs;采用分阶段联合诱导法诱导h UMSCs向胰岛前体细胞分化,将其分为正常诱导组、基因沉默组、空病毒转染组,后两组在诱导第7天分别转染干扰病毒和空病毒,嘌呤霉素筛选后检测感染效果;21 d诱导结束后倒置相差显微镜和电子显微镜观察细胞形态变化;免疫细胞化学技术检测诱导后各组细胞胰岛素、胰高血糖素、Ngn3的表达;Real-time PCR、Western blotting检测Ngn3以及MafA的表达变化。结果成功分离培养h UMSCs;分阶段联合诱导使正常诱导组和空病毒转染组细胞分化为胰岛前体细胞,Ngn3、胰岛素、胰高血糖素呈阳性表达,电子显微镜观察可见分泌颗粒;成功沉默了基因沉默组细胞的Ngn3基因,且该组细胞Ngn3、胰岛素、胰高血糖素呈阴性表达;Ngn3、MafA在基因沉默组明显下降(P<0.05)。结论Ngn3基因沉默阻滞了h UMSCs向胰岛前体细胞的分化,并抑制了MafA的表达。

hUMSCs向胰岛前体细胞诱导分化过程中Notch1和神经元素3的表达

目的:探讨人间充质干细胞(hUMSCs)向胰岛前体细胞诱导分化过程中Notch信号通路受体Notch1与神经元素3(Ngn3)变化。方法:分离培养并鉴定hUMSCs,采用分阶段联合诱导法(前10 d用含EGF低糖培养基诱导,后11 d用含激活素A和尼克酰胺高糖培养基诱导)诱导hUMSCs向胰岛前体细胞分化,设单独培养的hUMSCs作为对照;观察诱导分化前后细胞的形态变化,免疫细胞化学法检测诱导后细胞Ngn3、胰高血糖素(Glucagon)表达鉴定胰岛前体细胞,电镜下观察诱导后胰岛前体细胞改变;采用免疫细胞化学法、real-time PCR法及Western blot法检测诱导第7天、第14天及第21天时细胞中Notch1及Ngn3的表达;Western blot法检测诱导并加入γ分泌酶抑制剂(DAPT)后第21天时细胞中Notch1及Ngn3的表达水平。结果:诱导后Glucagon免疫组化染色呈阳性,出现胰岛前体细胞集落,电镜下可见胞体内有分泌颗粒;real-time PCR和Western blot结果显示,Notch1水平在诱导后第7天时最高,Ngn3水平至第14天时达到峰值;添加Notch信号通路抑制剂后Ngn3表达水平升高。结论:Notch信号通路可能通过激活Notch1受体与下游基因Ngn3共同调控体外诱导hUMSCs向胰岛前体细胞分化过程。

Sox9在人脐带间充质干细胞向胰岛前体细胞诱导过程中的表达

目的探讨转录因子Sox9在人脐带间充质干细胞(human umbilicalcord mesenchyreal stem cells,hUMSCs)向胰岛前体细胞分化过程中的表达变化。方法(1)分离培养并鉴定hUMSCs;(2)采用联合分阶段诱导法,取P5代hUMSCs向胰岛前体细胞分化,倒置相差显微镜观察诱导前后细胞形态变化,免疫组织化学技术检测诱导后胰高血糖素的表达;(3)诱导后7、14、21 d分别取细胞进行免疫荧光化学法、QPCR检测Sox9水平变化。结果hUMSCs经诱导后,细胞胞体呈现宽大形态,并出现胰岛前体细胞的集落,免疫组织化学技术检测诱导后细胞Ngn3、胰高血糖素和PDX-1呈阳性表达;QPCR检测Sox9在诱导过程中逐渐升高,其中诱导14 d达到峰值,21 d下降。结论在hUMSCs向胰岛前体细胞诱导过程中转录因子Sox9表达水平改变,可能参与胰岛前体细胞形成调节过程。

对比研究胎儿和成年来源的胰岛前体细胞体外增殖和分化潜能

对比研究胎儿和成年胰岛来源的前体细胞(hIPCs)体外增殖和分化,探讨胎儿和成年hIPCs的体外增殖和分化潜能,为细胞移植治疗糖尿病提供实验数据。体外分离培养胎儿和成体hIPCs,诱导分化,通过免疫组织化学、分子生物学方法,检测hIPCs体外增殖潜能和分化效率。与成年hIPCs相比较,胎儿hIPCs在体外具有更强的增殖潜能,BrdU掺入率明显高于成年胰岛来源的hIPCs(P<0.05)。体外诱导hIPCs分化成具有分泌胰岛素功能的胰岛样细胞团(ICCs),免疫荧光染色显示ICCs表达Insulin、Glucagon和Somatostatin,定量检测Insulin、PDX-1和ISL-1基因的相对表达量,胎儿来源的ICCs明显高于成年ICCs(P<0.05),分别是成年ICCs的1.69倍、1.51倍和1.81倍。提示胎儿来源的胰岛前体细胞具有较强的增殖和分化能力。

昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞并诱导分化为胰岛素前体细胞的实验

目的:自囊胚内细胞团分离培养患者自身的胚胎干细胞并将其诱导分化为目的细胞可用于特定疾病的治疗。实验采用昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞,并将其诱导分化为胰岛素前体细胞。方法:实验于2005-09/2006-11在哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室完成。①选取妊娠3.5d昆明雌性小鼠123只,至13.5d时取11只用于胚胎成纤维细胞饲养层制备。剩余112只妊娠3.5d小鼠冲胚后,挑取扩展充分、囊胚内细胞团明显的囊胚采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法分离培养胚胎干细胞,进行碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色鉴定。②在细菌培养皿的盖上用不含人重组白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液制备液滴,选取生长旺盛、形态典型的胚胎干细胞集落,采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法悬浮培养4d,形成拟胚体,行巢蛋白免疫荧光染色。③将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞,首先需要L-多聚赖氨酸和纤维粘连蛋白包被培养皿,然后用ITSFn筛选液(含5mg/L胰岛素、50mg/L转铁蛋白、30nmol/L亚硒酸钠、5mg/L纤维粘连蛋白的DMEM/F12培养液)筛选巢蛋白阳性细胞6d,碱性成纤维细胞生长因子扩增及初步诱导6d,再以烟碱诱导功能成熟的胰岛素前体细胞27d。应用DTZ染色、Insulin免疫荧光染色对诱导的细胞进行鉴定。结果:①胚胎干细胞的分离培养:将扩展充分的囊胚放置在饲养层上4d后,可见囊胚内细胞团自透明带中孵出,呈柱状生长,中央颜色深于周边,并将周边的饲养层细胞推开。胚胎干细胞传代后呈典型的克隆样生长,相差显微镜下折光性强。②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色结果:两种染色均呈阳性表达。③拟胚体的形成及向巢蛋白阳性细胞的诱导:胚胎干细胞悬浮培养4d可形成拟胚体,经ITSFn筛选6d后可见90%巢蛋白阳性细胞。④巢蛋白阳性细胞向胰岛素前体细胞的分化:烟碱诱导6d后,上皮样细胞增多,细胞逐渐密集形成类胰岛样组织。诱导10dDTZ染色可见集落的边缘细胞被染成腥红色。诱导27dInsulin免疫荧光染色可见染色阳性细胞团簇。结论:采用昆明小鼠3.5d囊胚成功分离培养胚胎干细胞,并可以将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞。

诱导型多能干细胞体外向胰岛素分泌细胞分化及对血糖的调控

背景:诱导小鼠多潜能性干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞能有效改善糖尿病小鼠血糖水平。目的:在体外将诱导型多能干细胞定向分化的胰岛样细胞团进行相关分子及蛋白水平检测,并观察其在体外和体内胰岛素分泌情况。方法:将体外培养的小鼠诱导型多能干细胞采用联合诱导剂分3个阶段对其进行诱导分化,并对每个诱导阶段形成的内胚层细胞、胰岛前体细胞和成熟胰岛细胞进行形态学观察和PCR检测相关基因的表达水平。对成熟的胰岛样细胞团进行双硫腙染色,ELISA检测体外释放胰岛素功能。将获得的胰岛素分泌细胞移植到糖尿病小鼠肾包膜下,观察其血糖水平变化。结果与结论:(1)体外成功获得的小鼠胰岛样细胞团,其结构呈球形,双硫腙染色呈铁红色,PCR检测到在m RNA水平上表达胰岛素基因;(2)ELISA检测到胰岛样细胞团在受到葡萄糖刺激时能够分泌胰岛素;(3)通过肾包膜方法将细胞团移植到1型糖尿病小鼠体内,对小鼠高血糖有明显的调控作用。

前沿

五星并肩打响火星争霸火星到底是什么样子?火星生命究竟存在不存在?现在也许只能进行一下科学幻想。但是,最近先是印度发射火星探测器;紧接着有人从"好奇"那儿发现了"火星蜥蜴"。现在,美国"专家"也奔赴火星准备探测大气了。到明年9月份,美国"勇气号""、好奇号""、专家号",欧洲"火星快车"和印度火星飞船将会协同作战,呈现五星并肩的局面。届时,我们对火星的认识将会发生一个质的变化。

2014-1胚胎干细胞或能治疗糖尿病

日本熊本大学一个研究小组最新报告称,他们利用实验鼠胚胎干细胞（ES细胞）高效培养出分泌胰岛素的胰岛细胞,将其移植到患糖尿病的实验鼠体内后,获得了满意的疗效,这一技术未来可能造福糖尿病患者。此前,研究人员已尝试过利用胚胎干细胞培养分泌胰岛素的胰岛β细胞,但都未能取得理想的结果,只能培养得到胰岛前体细胞（成为胰岛β细胞之前的一种细胞形态）。研究小组为了找到胰岛前体细胞分化成胰岛β细胞时的必要物质,