大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证

【目的】克隆大鼠胰岛素II基因启动子(RIP2)序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据Gen Bank中已发表的RIP2序列(J00748.1)设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接p MD18-T载体后用Hind III和Bam H I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的p EGFP-1载体上构建真核表达载体p EGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24 h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列(J00748.1)的同源性为99.9%,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG(+1)上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box(-206^-201位点)和一个CAAT-box(-343^-339位点)。以重组质粒p EGFP-1-RIP2转染PK15细胞,24 h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。