人胰岛素原基因胰外表达重组体的构建及鉴定

目的 :构建胰外表达成熟胰岛素的重组体。方法 :将人胰岛素原基因进行二处突变 ,突变后的胰岛素原基因与逆转录病毒载体 pLXSN重组并转染肝癌细胞。提取肝癌细胞基因组DNA ,PCR方法鉴定人胰岛素原基因与载体重组结果及在肝癌细胞基因组中整合情况。同时测定成熟胰岛素的表达。结果 :胰岛素原基因已整合到肝癌细胞基因组。突变的胰岛素原可被广泛存在的furin酶识别 ,在培养基内检测到较高浓度的成熟胰岛素。结论 :成功构建胰外表达成熟胰岛素的突变人胰岛素原基因逆转录病毒重组体。

人胰岛素原基因突变体的构建

目的 完成人胰岛素原基因的定点突变 ,使之能在普通细胞中被Furin蛋白酶识别去除C肽分泌成熟胰岛素。方法 采用PCR体外定点突变技术 (PCRsite directedmutagenesis ,PCR SDM) ,设计 4对引物 ,引入 5个Furin识别的突变位点 ,通过重叠延伸法PCR扩增 ,使人胰岛素原编码基因B10密码子由CAC突变为GAC ;C3密码子由GAA突变为AAA ;C4密码子由GCT突变为CGT ;C3 2密码子由CTT突变为CGT ,将扩增片段克隆入T载体并测序。结果 DNA测序结果表明在预期位点突变符合要求。结论 应用PCR诱导突变技术 ,在体外能准确、简便有效的诱导胰岛素原基因突变 ,使体外应用非内分泌细胞构建高效分泌成熟胰岛素的细胞克隆成为可能。

肌肉注射大鼠胰岛素原基因治疗糖尿病大鼠的研究

目的:研究肌肉注射大鼠胰岛素原基因重组表达质粒转基因治疗对糖尿病大鼠血糖和胰岛素分泌的影响。方法:链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠糖尿病模型,经肌肉注射将大鼠胰岛素原基因重组表达质粒pCMV/proinsulin DNA裸质粒直接导入糖尿病大鼠体内,与转染同等剂量pCMV空载质粒的对照组比较,观察糖尿病大鼠血糖的影响以及体内胰岛素表达的变化。结果:①接受肌肉注射重组质粒的治疗组(A组)糖尿病大鼠血糖下降约4mmol/L,且能维持1～2周,血浆胰岛素水平明显升高,并持续表达2周;②肌肉注射胰岛素原基因治疗后,治疗组血糖明显低于接受pCMV空载质粒对照组(B组)和糖尿病对照组(DM组)(P<0.05),治疗组胰岛素浓度也明显高于这两个对照组(P<0.05);③肌肉注射治疗组大鼠的骨骼肌能检测到大鼠胰岛素原基因mRNA的表达,而对照组则为阴性;治疗组大鼠胰腺胰岛素原基因mRNA的表达量也明显高于对照组;④免疫组化结果显示,肌肉注射治疗组大鼠骨骼肌组织可见胰岛素表达,而对照组则无表达;治疗组胰腺组织胰岛素含量较对照组明显增高。结论:糖尿病大鼠裸质粒肌肉注射转基因治疗可获得胰岛素的有效表达,并有效降低糖尿病大鼠的血糖水平。

人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上，构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体。它能高效表达且有效地分泌表达产物。利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白。融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后，经反相ＨＰＬＣ分析，分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。

体内直接人胰岛素原基因转移对糖尿病小鼠治疗作用的研究

目的 研究人胰岛素原基因表达质粒直接转移至糖尿病小鼠体内后对其血糖和血浆胰岛素水平的影响。 方法 将人胰岛素原基因和大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK)启动子的重组质粒 p N - PEPCK- INS经脂质体介导 ,直接转入糖尿病小鼠体内 ,监测空腹血糖并测定血浆胰岛素水平 ,PCR法鉴定基因转入。 结果 人胰岛素原基因转移组小鼠血浆胰岛素为 (49.2 9± 14 .5 6 )ml U / L ,显著高于生理盐水对照组 (37.5 6± 8.4 ) m l U / L (P<0 .0 5 )和质粒 PL NC对照组 (33.5 4±13.35 ) ml U / L (P<0 .0 5 ) ,生理盐水组与质粒 PL NCX组差别无显著性 (P>0 .0 5 ) ,人胰岛素原基因转移组空腹血糖显著低于基因转入前 (P<0 .0 5 )。生理盐水组和质粒 PL NCX组空腹血糖基因转入前后差异无显著性。

人胰岛素原基因在转基因小鼠乳汁中的表达

将构建的绵羊 β-乳球蛋白基因 ( BLG)调控人胰岛素原基因的重组基因通过显微注射生产转基因小鼠。共移植 888枚注射 BLG-胰岛素原基因的小鼠卵 ,移植受体 31只 ,怀孕 1 4只 ,产仔 53只。PCR检测 51只 ,有 5只为阳性 ,并均为雌性 ,其中 2只小鼠泌乳 ,经放免检测小鼠乳汁中人胰岛素原的质量浓度分别为 37.44mg/L和 39.99mg/L。另外 3只异常消瘦而不孕 ,其中

显微注射生产转人胰岛素原基因奶山羊

将构建的绵羊β-乳球蛋白基因 ( BLG)调控人胰岛素原基因的重组基因通过显微注射生产转基因奶山羊。同期化超排处理供体奶山羊 1 5只 ,排卵 2 62枚 ,回收卵 2 2 1枚 ,移植 2 0 6枚注射卵 ,移植受体 68只 ,怀孕2 1只 (妊娠率 3 3 % ,其中成年母羊妊娠率为 58.62 % ,周岁母羊为 9.4 % ) ,产羔 3 3只 ,其中母羔 8只 ,公羔 2 5只。经 PCR检测及酶切分析 ,证明有 5只为阳性 ,阳性整合率为 1 5.1 5% ,但

人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究

目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。

人胰岛素原基因的包装及增殖

目的:用PA317包装细胞包装突变人胰岛素基因原质粒,并检测其增殖情况.方法:用脂质体转染法将PLXSN-MPINS质粒转染至PA317包装细胞,用G418筛选出阳性PA317包装细胞克隆并测定胰岛素原基因浓度,用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA,PCR检测突变人胰岛素基因的整合情况.结果:(1)用脂质体转染法获得G418阳性PA317包装细胞克隆;(2)该细胞克隆获高滴度的胰岛素原基因浓度;(3)PCR方法在转染后PA317基因组中检测到突变人胰岛素原基因.结论:脂质体转染法是一种操作简便且行之有效的转染方法.PA317包装细胞系可成功包装突变人胰岛素原基因质粒并可获得高滴度表达,为1型糖尿病基因治疗的进一步实验研究奠定了基础.

Patatin启动子驱动的人胰岛素原基因的植物表达载体的构建

使用马铃薯的偏爱密码子设计合成人胰岛素原基因,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,构建由patatin启动子调控的人胰岛素原基因植物表达载体p1301Ph,并将导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为日后转基因工作奠定了基础。

人胰岛素原基因的PCR扩增、克隆和鉴定

根据已知的人胰岛素原基因序列设计引物 ,用PCR直接从人基因组DNA中获得天然的人胰岛素原基因 ,并将其克隆到 pUC1 8载体中 ,通过内切酶图谱及序列分析 ,证实所获得的人胰岛素原基因与已报道的序列完全一致。对于已知序列的基因克隆 ,PCR扩增法操作简捷 。

鸭前胰岛素原基因多态性及其与屠体性状的关联分析

以384只北京鸭(Z2系、Z4系、Z2×Z4杂交系)和樱桃谷鸭为材料,利用PCR-SSCP结合测序技术,对前胰岛素原基因外显子2与部分内含子的多态性进行了研究,并分析对屠体性状的遗传效应。结果发现存在2个单核苷酸突变位点,即在第179位和第195位分别发生了T→C和C→T的突变。适合性χ2检验结果表明,北京鸭各品系和樱桃谷鸭均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。最小二乘分析SNPs与屠体性状的关系表明,在北京鸭3个品系中,基因型BB在胴体重、全净膛重和胸肌重上极显著(P<0.01)高于基因型AA和AB,在腿肌重和皮脂重上极显著(P<0.01)高于基因型AB;基因型AA在皮脂率和全净膛重上极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于基因型AB。而对于樱桃谷鸭,只有AB型在皮脂重和腹脂重上显著(P<0.05)高于基因型AA。研究结果表明,鸭前胰岛素原基因多态性与鸭的部分屠体性状存在显著相关性,且B等位基因有利于增加鸭的胴体重和胸肌重。

人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3细胞系中的瞬时表达研究

目的：研究人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3中的瞬时表达情况。方法：采用脂质体转染法将携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）启动子－人胰岛素原基因的质粒转染到体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，转染后48h，用放射免疫分析方法（RIA）分别测定NIH3T3细胞内外的胰岛素水平。结果：NIH3T3细胞外的胰岛素水平于转染前后无显著性变化（P＞0．05），而细胞内的胰岛素水平则于转染后明显升高（P＜0．05）。结论：转染后48h的人胰岛素原基因在NIH3T3细胞内有较高的胰岛素表达水平，使I型糖尿病的基因治疗成为可能。

重组人胰岛素原基因质粒在糖尿病鼠体内表达的安全性初步研究

目的初步研究重组人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(RHPGP)在糖尿病大鼠体内的安全性。方法将三碘甲腺原氨酸(T3)和肝细胞生长因子(HGF)注射入糖尿病鼠体内后,导入RHIGP,检测血糖、血清谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN),进行24h饥饿试验以及组织病理学检测和逆转录病毒复制完整型病毒(RCR)的检测。结果实验组大鼠血糖明显下降,饥饿试验中未有低血糖事件发生;实验组动物的ALT、ALB、CRE和BUN与正常组大鼠无统计学差异;病理检测光镜下未见癌细胞及异形核细胞;未检测到野生型逆转录病毒。结论我们构建RHIGP体内表达实现了安全性调控;RHIGP应用于活体动物是安全的。

定点突变的人胰岛素原基因在体细胞中的表达

目的 研究在非β细胞中表达成熟胰岛素 ,探讨替代胰岛素注射或胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的方法。方法 采用重叠区扩增基因拼接法 (geneSOEing)自胰岛素原基因组基因中扩增胰岛素原的cDNA ,并于C肽的两端引入蛋白酶furin的识别和切割位点Arg Xaa Lys/Arg Arg ,将获得的突变体重组表达载体 pcDNA3 .1 /C .mINS通过脂质体法转染体外培养的Hela、2 93和L0 2细胞 ,转染后 48、72h取细胞培养液 ;并将L0 2细胞经G41 8(450mg/L)筛选 2个月后 ,得到稳定表达胰岛素的细胞株 ,同时用放射免疫和免疫组织化学的方法监测细胞内外胰岛素的表达水平。结果 成功地对胰岛素原cDNA的 3个位点进行了突变 ,空载体转染的细胞无胰岛素表达 ,而在转染突变后胰岛素原基因cDNA的细胞培养液中胰岛素的表达量各不相同 :每天 8.45～ 1 88.0 0 μIU/2 .0× 1 0 6 Hela细胞、每天 1 59.88～ 2 4 2 .1 4 μIU/ 2 .0× 1 0 6 2 93细胞、每天 2 .56～ 61 .95μIU/ 2 .0× 1 0 6L0 2细胞 ;免疫组织化学显示细胞浆内有囊泡状分泌颗粒。

鸭前胰岛素原基因的单核苷酸多态性研究

为了研究前胰岛素原(Preproinsulin)基因在鸭群体中的遗传变异情况,本试验运用连接酶检测反应(PCR-LDR)的方法对北京鸭、莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、建昌鸭等六个鸭种的前胰岛素原基因C195T位点进行基因分型,并分析了该位点在各鸭群体中的基因型频率、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡情况。结果表明:鸭前胰岛素原基因C195T多态位点在除绍兴鸭外的品种中均检测到CC、CT和TT三种基因型。北京鸭等位基因C的频率与等位基因T的频率相同,其他品种等位基因T的频率均高于等位基因C的频率。连城白鸭在此位点基因型分布不符合Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05),其他品种均符合Hard-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

糖尿病大鼠胰岛素原基因转基因治疗的研究——门静脉注射与肌肉注射对血糖影响的比较

目的比较门静脉注射与肌肉注射胰岛素原转基因治疗对糖尿病大鼠血糖的影响。方法（1）分别用门静脉注射及肌肉注射的方法将含有大鼠胰岛素原基因的重组表达质粒pCMV／胰岛素原DNA裸质粒导入糖尿病大鼠模型以观察其血糖的变化。门静脉注射治疗组（A组）及肌肉注射治疗组（C组）每只大鼠分别接受pCMV／胰岛素原DNA100μg，门静脉对照组（B组）和肌肉对照组（D组）则分别以同样方法给予同等剂量pCMV空载质粒DNA。同时设立糖尿病对照组（DM组）和正常对照组（N组）。（2）采用超敏放射免疫法检测大鼠转基因治疗前后胰岛素浓度的变化，用RT—PCR和免疫组化方法检测治疗后大鼠肝脏、骨骼肌等组织胰岛素原基因mRNA和蛋白的表达水平。结果（1）接受重组质粒pCMV／胰岛素原DNA裸质粒的两治疗组糖尿病大鼠血糖显著下降。其中，门静脉组大鼠血糖下降约7mmol／L，且能维持3—4周，血清胰岛素水平显著升高，且可持续表达4周；肌肉注射组大鼠血糖下降约4mmol／L，且能维持1—2周，血清胰岛素水平明显升高，并持续表达2周。（2）门静脉治疗组大鼠的肝脏及肌肉注射治疗组大鼠的骨骼肌分别能够检测到大鼠胰岛素原mRNA和蛋白的表达，而对照组则显示阴性结果。结论裸质粒门静脉注射和肌肉注射两种方法均获得了糖尿病大鼠胰岛素原基因的有效表达和血糖水平的显著降低，是糖尿病基因治疗的有效手段之一。

简捷的PCR点突变实现人胰岛素原基因非β细胞表达

利用聚合酶链反应 (PCR)技术将人胰岛素原基因进行两处突变 ,引入Furin酶的裂解位点 ,再构建突变人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒 ,转染HepG2肝癌细胞 ,经检测可表达成熟胰岛素。

胰岛素原转化酶基因克隆及序列测定

目的研究胰岛素抵抗和胰岛素缺乏与Ⅱ型糖尿病发病机制的关系.方法Ⅱ型糖尿病普遍存在胰岛素、胰岛素原障碍,胰岛β细胞分泌出胰岛素原经胰岛素原转化酶(Prohormone convertase,PC2)去除部分肽段后形成胰岛素.结果与结论若PC降解功能异常可导致胰岛素原及其代谢产物不适当分泌引起胰岛素缺乏,研究该基因分布和表达的变化,对探讨糖尿病胰岛素抵抗的发病机制奠定基础.

糖尿病基因治疗的实验研究Ⅰ.人胰岛素基因真核细胞表达质粒的构建

为有效开展糖尿病基因治疗，作为第一步，本研究构建了人胰岛素原基因与表达载体PRC／CMV的重组体。首先，从质粒PBCA中酶切回收260bp的人胰岛素原基因片段，利用中间载体PBS．SK构建了含人胰岛素原基困片段的过渡质粒PBS．INS，在此基础上构建了真核细胞表达的人胰岛素基因重组体PRC／CMV．INS。