胰岛素样生长因子1基因转染骨髓间充质干细胞对骨折愈合及血管形成的作用研究

目的探究胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)对大鼠骨折愈合及血管形成的影响。方法建立大鼠股骨骨折模型,采用BMSC、含IGF1基因慢病毒转染的BMSC分别处理模型大鼠。X线影像系统、micro-CT扫描仪观察骨折愈合情况,HE染色观察股骨组织病理学变化,免疫荧光染色观察血管内皮标记物CD31表达,蛋白质印迹检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)与血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)表达。结果与模型组比较,BMSC组与IGF1-BMSC组大鼠的骨折线模糊,有愈合性骨痂形成,BMD、BV/TV升高(P<0.05),Tb.N增加(P<0.05),Tb.Sp降低(P<0.05),CD31荧光表达增强,BMP-2、OPN、OCN及VEGF、Ang-1蛋白相对表达量均上调(P<0.05)。与BMSC组比较,IGF1-BMSC组大鼠骨折线几乎消失,愈合效果更佳,BMD、BV/TV升高(P<0.05),Tb.N增加(P<0.05),Tb.Sp降低(P<0.05),CD31荧光表达更强,BMP-2、OPN、OCN及VEGF、Ang-1蛋白相对表达量也进一步上调(P<0.05)。结论IGF1基因转染BMSC能够有效促进大鼠股骨骨折愈合,加速血管形成,且效果优于BMSC单独作用。

碘缺乏对大鼠胰岛素样生长因子1基因表达的影响

目的 建立一种对胰岛素样生长因子 I( IGF- 1)基因 m RNA进行定量检测的竞争 PCR方法 ,对碘缺乏状态下 IGF- 1基因的表达水平进行检测。方法 以自行建立的竞争性 PCR方法对低碘及正常大鼠肝脏中IGF- 1基因 m RNA的水平进行定量检测。结果 低碘大鼠肝脏中 IGF- 1基因 m RNA的浓度 ( 71.3 nmol/ L )较正常组 ( 146 .4nmol/ L )明显减低。结论 碘缺乏导致骨、脑发育障碍的部分原因可能是因为降低了 IGF- 1这一发育调节因子的基因表达。

胰岛素样生长因子1基因转染成肌细胞促小鼠胫骨骨折愈合的作用

背景:随着基因治疗的研究发展,将转有胰岛素样生长因子1基因的细胞移植入损伤区,达到该基因在体内的持续表达已可行,并有可能解决骨折患者骨不连及骨延迟愈合等难题。目的:观察携带人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞体内局部多点注射对C57BL/6J小鼠胫骨骨折愈合的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-04在汕头大学医学院完成。材料:8周龄雄性C57BL/6J小鼠42只,体质量22～25g,建立左胫骨骨折的动物模型。方法:42只小鼠随机数字表法分为2组,每组21只。实验组于骨折处周围肌肉中多点注射0.3mL转人胰岛素样生长因子1基因成肌细胞悬液;对照组注射0.3mL生理盐水。分别在造模后2,3,4周每组各随机取7只小鼠处死,取材,行苏木精-伊红染色。主要观察指标:各组动物骨折部位形成骨痂面积的大小和组成成分的变化;外源性细胞在体内存活及表达人胰岛素样生长因子1情况;各组动物骨密度及骨痂细胞生长情况。结果:①实验组转基因成肌细胞BrdU及人胰岛素样生长因子1免疫组织化学染色均阳性,4周实验组平均灰度值虽稍高于2周实验组,但差异无显著性意义(P>0.05)。②携人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞移植入C57BL/6J小鼠胫骨骨折处周围肌肉中可存活4周以上,并能稳定地分泌人胰岛素样生长因子1。③实验组造模后各时间点外骨痂中小梁骨占骨痂总面积的百分比均高于对照组,其中第3,4周经F检验差异有显著性意义(P<0.05);4周实验组骨痂骨密度高于对照组(P<0.05)。④电镜观察可见实验组骨生成细胞的数量、活跃程度和胶原纤维的数量、分布均优于对照组。结论:局部注射转人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞可以促进C57BL/6J小鼠胫骨骨折的愈合。

鳡胰岛素样生长因子1基因的克隆及其组织特异性表达分析

为克隆鳡(Elopichthys bambusa)的胰岛素样生长因子1(IGF1)全长cDNA和启动子序列及明确其组织表达特征,采用反转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)和染色体步移等技术,从鳡肌肉中获得了IGF1基因的全长cDNA(844bp)和上游启动子部分序列(627bp)。结果表明:IGF1基因包含218bp的5′端非翻译区、140bp的3′端非翻译区和486bp的开放性阅读框(ORF),编码161个氨基酸,包含前44个氨基酸残基为信号肽、70个氨基酸残基的4个功能结构域和C端47个氨基酸残基的延伸肽结构域。启动子无TATA框,但含有一成肌分化抗原(Myo D)结合位点。氨基酸同源性和系统发育分析发现,鳡IGF1与鲤形目其他鱼类的同源性较高(94.41%～99.38%),亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,IGF1在鳡的肝脏中表达最高,而心脏中未见其明显表达。该研究为明确IGF1参与鳡生长发育的机制研究及其在鳡的繁殖育种中的应用奠定了基础。

水稻种子表达人源性胰岛素样生长因子1基因

人源性胰岛素样生长因子1(hIGF-1)是一类在许多人类疾病治疗中都具有重要作用的细胞因子。本研究成功构建了以水稻种子高效表达的谷蛋白Gt1基因5.3 kb启动子引导hIGF-1基因(higf-1)的表达载体:pCAMBIA 1301-5.3kbGt1-higf-1-nos。在此基础上,将构建好的表达载体,通过根癌农杆菌介导法转化水稻,获得转基因植株。通过对转基因水稻植株叶片总DNA的PCR检测,初步确定表达载体的T-DNA区段已经成功整合入水稻基因组中。目的基因RT-PCR检测结果显示,higf-1在转基因水稻种子中能够正常转录。开展本试验为利用水稻及其他单子叶植物表达IGF-1研究奠定了基础。

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景:航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1mRNA的表达。目的:观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。方法:采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。结果与结论:与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P<0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。

肌腱愈合及粘连形成机制的研究:胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达

目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达,ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1;RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA;ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2.873,P<0.05)。结论:重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。

甲钴胺对实验性糖尿病大鼠组织胰岛素样生长因子1基因表达及周围神经病变的影响(英文)

背景糖尿病状态造成胰岛素样生长因子1基因表达异常,后者参与糖尿病周围神经病变的发生、发展。目的探讨单剂量甲钴胺预防实验性糖尿病周围神经病变的分子学机制。设计分组对照动物实验。单位南京医科大学第一附属医院内分泌科。材料实验于2001-02/2002-01在南京医科大学动物实验中心完成。选用清洁级SD雄性大鼠80只。方法①取64只大鼠进行造模四氧嘧啶溶于生理盐水,以240m g/kg剂量腹腔注射,48h后,取20m m ol/L以上者为糖尿病模型。②取16只作为正常对照组,不造成糖尿病模型,仅腹腔注射等量生理盐水。③将造模成功的64只大鼠中采用猪短效和长效胰岛素按21比例每日皮下注射后根据血糖水平不同分为2组一组血糖控制较好为胰岛素治疗1组和血糖控制较差为胰岛素治疗2组,每组32只。各组取16只给予给予甲钴胺500μg/(kg·d)肌注,分为甲钴胺+胰岛素治疗1组和甲钴胺+胰岛素治疗2组。其余每组16只用作胰岛素治疗组对照。④于实验开始时及造模成功后2周,2,3个月测定动物体质量为初质量和末质量;血糖测定用葡萄糖氧化酶法;血清果糖胺测定采用1-脱氧-1-吗咛。⑤采用VikingⅣ诱发电位仪测定诱发电位出现的波幅和感觉及运动神经传导速度。反转录聚合酶链反应法半定量分析胰岛素样生长因子1m RNA表达。采用酶联免疫吸附分析法测定神经组织胰岛素样生长因子1肽含量。⑥组间差异采用单析因方差分析。主要观察指标①各组大鼠各实验阶段神经组织胰岛素样生长因子1m RNA、胰岛素样生长因子1肽含量,神经电生理变化。②各组大鼠各实验阶段糖代谢指标及体质量比较。结果实验过程中糖尿病感染或急性并发症死亡3只,最终进入结果分析77只。①体质量及血糖代谢变化糖尿病成模后,甲钴胺+胰岛素治疗组分别与胰岛素治疗组血糖、果糖胺等血糖代谢指标差异不明显,体质量增长较正常对照组延缓趋势一致。②组织胰岛素样生长因子1m RNA表达及其肽含量变化甲钴胺+胰岛素治疗组组织胰岛素样生长因子Ⅰm RNA含量均不同程度高于胰岛素治疗组(P<0.05～0.01)。.糖尿病成模后2周时,坐骨神经甲钴胺+胰岛素治疗1组组织胰岛素样生长因子1m RNA含量显著高于胰岛素治疗1组(P<0.05),与正常对照组差异不明显;甲钴胺+胰岛素治疗2组明显高于胰岛素治疗2组(P<0.05),但低于正常对照组(P<0.01);病程2个月时,甲钴胺+胰岛素治疗组明显低于对照组,高于相应胰岛素治疗组(P<0.05～0.01)。病程3个月时,甲钴胺+胰岛素治疗2组神经组织与胰岛素治疗2组无差异。甲钴胺对组织胰岛素样生长因子1肽含量变化的影响趋势与对胰岛素样生长因子1m RNA基本平行。③神经电生理指标变化病程2和3个月时,甲钴胺+胰岛素治疗1组感觉和运动神经传导速度及波幅明显高于胰岛素治疗1组同期(P<0.05);病程2个月时,甲钴胺+胰岛素治疗2组感觉神经传导速度及波幅基本明显高于胰岛素治疗2组(运动神经传导速度除外,P<0.05)。病程3个月时,甲钴胺+胰岛素治疗2组和甲钴胺+胰岛素治疗2组感觉和运动神经传导速度及波幅明显低于正常对照组(P<0.05～0.01)。结论①甲钴胺对糖尿病的血糖水平无显著影响。②甲钴胺可以通过影响实验性糖尿病大鼠组织胰岛素样生长因子1基因表达预防糖尿病外周神经病变的发生。③血糖控制较好结合甲钴胺治疗能更有效预防糖尿病外周神经病变。

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景：基因工程是目前软骨修复的主要方法，脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞。目的：探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响。设计、时间及地点：细胞学基因转染体外观察，于2006-03／2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成。材料：成年新西兰大白兔3只，由中国医科大学实验动物中，心提供。含有全长人胰岛素样生长因子1cDNA片段的质粒pcDNA3．1．hlGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠。方法：取兔颈后皮下脂肪，Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞。取传至第2代细胞，以．0．5×10^6/孔密度接种于6孔板，细胞融合至90％-95％时随机分为未转染组、转染空载体pcONA3．1组、转染质粒pcDNA3．1-hlGF-1组，采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3．1-IGF-1转染，经G418筛选后培养4周。主要观察指标：采用RT-PCR及Westernblot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况，MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果：转染pcDNA3．1-hlGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1mRNA及蛋白表达，未转染组及转染空载体pcDNA3．1组无表达。细胞增殖曲线显示，转染质粒pcDNA31-hlGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快。流式细胞仪检测显示，转染质粒pcDNA3．1-hlGF．1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加（户〈0．05），G1期比例显著下降（P〈0．05）。结论：质粒pcDNA3．1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后，可以获得稳定表达，并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖。

人胰岛素样生长因子1基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的 研究人胰岛素样生长因子 1 (hIGF 1 )基因转染关节软骨细胞获得稳定表达的可行性。方法 用脂质体转染法将含有hIGF 1cDNA的真核表达载体转染兔关节软骨细胞 ,经G4 1 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养 4周 ,原位杂交检测hIGF 1的表达 ,免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原的表达。结果 G4 1 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,原位杂交检测表明hIGF 1基因得到稳定表达 ,免疫细胞化学检测显示转染后的软骨细胞仍表达Ⅱ型胶原。结论 外源性hIGF 1基因能够在软骨细胞内获得稳定表达 。

胰岛素样生长因子1基因多态性与生产性能关系研究进展

胰岛素样生长因子1(IGF-1)是一种活性蛋白多肽物质,由IGF-1基因编码,具有类胰岛素功能,它对促进动物机体生长发育、调节机体物质代谢和治疗众多疾病等方面具有重要意义。探讨IGF-1基因功能区多态性对动物体生产机能的作用,具有重要的实践意义与经济价值。论文对IGF-1基因功能、基因多态性与生产性能关系进行综述,以其为相关研究提供参考。

胰岛素样生长因子1基因多态性与多囊卵巢综合征相关性研究

目的分析胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因多态性与多囊卵巢综合征(PCOS)的相关性。方法选择自2016年2月至2017年3月在我院接受治疗的274例PCOS患者作为病例组,同时选择同期250名体检健康者作为对照组,经静脉取血后收集血清后,采用自动生化分析仪分析测定相关糖脂代谢指标,包括空腹胰岛素(FINS)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),同时采用ELISA实验检测黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH),并计算体重指数(BMI);采用PCR-RFLP法分析IGF-1基因位点G201A、T455C的多态性;同时经Logistic回归分析讨论PCOS的危险因素。结果 PCOS组患者的BMI为(24.63±3.71)kg/m2,LDL-C为(2.23±0.38)mmol/L,FPG为(5.43±0.64)mmol/L,FINS为(9.35±1.96)m IU/L,LH为(6.49±1.23)IU/L,显著高于对照组(P<0.05);PCOS组患者的HDL-C为(1.39±0.21)mmol/L,FSH为(5.68±1.14)IU/L,显著低于对照组(P<0.05)。病例组的T455C位点TT基因型、CT基因型、CC基因型与对照组分布差异有统计学意义(P<0.05)。病例组G201A位点AA基因型、AC基因型、CC基因型与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。经多因素Logistic回归分析,发现IGF-1基因T455C、G201A位点多态性和血清中高水平FINS是PCOS的危险因素(P<0.05)。结论 IGF-1基因多态性与PCOS发生密切相关,为患者临床治疗提供实验依据。

胰岛素样生长因子1基因转染骨髓基质干细胞治疗裸鼠骨缺损

背景:众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用,并参与调节骨改建及修复的一系列过程。目的:观察人胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨,提高骨缺损修复质量。设计、时间及地点:对比观察,实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成。材料:体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞,并与具有良好生物学活性的脱钙骨基质材料复合。方法:BalB/C裸鼠15只制备颅骨8mm缺损模型,随机数字表法分为3组,每组5只。胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位,空白对照组仅造模,不进行任何干预。造模后4周处死动物,取出颅骨进行组织学观察。主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应检测转染细胞胰岛素样生长因子1mRNA的表达。同时收集转染后细胞上清,用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达。②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3,6d后的生长情况。③颅骨缺损模型大体观察。④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况。结果:①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测,胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1mRNA及蛋白的表达。②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入;6d时脱钙骨基质表面黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维;而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少。③造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应,胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密;而空载体细胞组植入物可推动;空白对照组骨缺损处无新骨形成。④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密,骨折缺损区有新骨及血管形成;空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少;空白对照组缺损未见修复。结论:胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能。

胰岛素样生长因子1基因多态性与食管癌遗传易感性的关系

目的:研究中国汉族人群中胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)基因多态性与食管癌发生危险因素的关系。方法:采用病例-对照研究方法,以高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)小片段扩增子法分析260例食管癌患者和384例非肿瘤患者的IGF-1基因多态性,计算各种基因型的食管癌发生风险及其95%可信区间。结果:IGF-1 rs7965399 T>C多态三种基因型TT,TC,CC在食管癌组的频率分别为44.2%(TT),48.8%(TC),6.9%(CC),在非肿瘤组的频率为55.7%(TT),38.0%(TC),6.3%(CC);与携带IGF-1 rs7965399 TT基因型的个体相比较,IGF-1 rs7965399 TC等位基因型可以增加食管癌发病风险(调整后OR=1.63,95%CI=1.17～2.28)。结论:IGF-1 rs7965399 T>C基因多态性TC基因型可能是食管癌发生的危险因素,需要进一步研究证实。

人胰岛素样生长因子1基因转染对大鼠骨骼肌成肌细胞缺血再灌注损伤的影响

目的:探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对大鼠骨骼肌成肌细胞体外缺血再灌注损伤的影响及机制。方法:分别用pLghIGF-1SN质粒(IGF组)和对照质粒pLgGFPSN(GFP组)转染大鼠成肌细胞。未转染的成肌细胞(control组)作为细胞对照。转染后用免疫细胞化学、RT-PCR及ELISA检测基因表达。转染后3～14 d检测各组细胞的扩增率。转染的细胞接受缺血再灌注损伤后7 d,TUNEL法检测各组细胞的凋亡百分数,RT-PCR检测各组细胞的bax和bcl-2 mRNA的表达,Western blotting检测各组细胞caspase-3的表达。结果:基因转染后免疫细胞化学和RT-PCR检测发现IGF组细胞有hIGF-1表达,GFP组和control组细胞未见hIGF-1表达;IGF组细胞上清中可检测到hIGF-1的蛋白表达,control组和GFP组细胞上清中未检测到hIGF-1蛋白表达。转染后14 d,IGF组细胞的扩增率显著大于control组和GFP组(P<0.05);细胞经缺血再灌注损伤后,TUNEL染色检测结果显示:与GFP组相比,IGF组细胞的凋亡百分比显著降低(P<0.05);RT-PCR检测结果显示:与GFP组相比,IGF组细胞的bax mRNA表达显著降低,bcl-2 mRNA的表达显著增加(P<0.05);Westernblotting检测结果显示:与GFP组相比,IGF组细胞caspase-3蛋白表达显著降低。结论:IGF-1基因转染可增加成肌细胞的抗凋亡能力,其机制可能和降低Bax和caspase-3表达,增加Bcl-2的表达有关。

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景:人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。目的:验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。方法:构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果与结论:测序及酶切证实真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6h检测到有EGFP的表达,至60h达到高峰,转染效率为(16±3)%。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60h达到22.65μg/L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。

腺病毒介导鼠胰岛素样生长因子1基因对胰岛β细胞的保护作用

背景:研究表明自身高表达胰岛素样生长因子1的小鼠对药物诱导糖尿病有一定的预防作用。目的:观察腺病毒介导鼠胰岛素样生长因子1基因对胰岛β细胞损伤的保护作用。方法:①体外实验:以Ad-rIGF-1、Ad-eGFP直接感染鼠胰岛β细胞标准细胞株-R1Nm5F细胞,然后两组再分别加入0,1.5mmol/L链脲佐菌素。②体内预防实验:将60只昆明小鼠随机分为空白对照组(不做任何处理)、糖尿病对照组(制作糖尿病模型)、空载体对照组(仅腹腔注射Ad-eGFP重组腺病毒液)、Ad-rIGF-1组(于糖尿病模型制作前2周腹腔注射Ad-rIGF-1重组腺病毒液)。③体内治疗实验:将75只昆明小鼠随机分组:空白对照组(不做任何处理)、糖尿病对照组、胰岛素组、Ad-rIGF-1组、Ad-rIGF-1联合胰岛素组。后3组制作糖尿病模型后给予相应干预。结果与结论:①鼠胰岛素样生长因子1在胰岛β细胞有效表达,并具有抑制链脲佐菌素诱导胰岛β细胞凋亡的作用。②Ad-rIGF-1组糖尿病发病率低,平均血糖水平低,胰腺炎症浸润程度轻。③与糖尿病对照组、胰岛素组相比,Ad-rIGF-1组和Ad-rIGF-1联合胰岛素组胰腺炎症浸润程度轻,鼠胰岛素样生长因子1在胰岛局部高表达;胰岛素组、Ad-rIGF-1组、Ad-rIGF-1联合胰岛素组血清C-肽水平低,组间比较无明显差别(P>0.05)。表明胰岛β细胞局部表达鼠胰岛素样生长因子1能够保护胰岛β细胞功能,提高细胞存活率,预防和减轻链脲佐菌素诱导的昆明小鼠1型糖尿病。但鼠胰岛素样生长因子1基因转导与胰岛素皮下注射联合应用对糖尿病早期残存胰岛细胞功能的保护效果不明显。

胰岛素样生长因子1基因转染胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞移植治疗心肌梗死

目的：探讨经逆转录病毒载体介导的胰岛素样生长因子1（IGF-1）基因转染胚胎干细胞（ESC）诱导分化的心肌细胞IGF-1的表达及移植于大鼠慢性心梗模型后对心功能的影响。方法：建立大鼠心梗模型后将心梗大鼠随机分为3组，分别注射移植转染心肌细胞（心肌细胞组）、转染IGF-1基因（IGF-1基因组）和DMEM培养基（DMEM组）。取心标本作H-E染色及免疫组织化学检测，并计数血管密度。结果：IGF-1基因转染的心肌细胞表达IGF-1增高，与对照组比较差异有统计学意义；免疫组织化学检测显示，移植细胞在移植区存活；H-E染色血管计数显示转染心肌细胞组有更多的新生血管形成。结论：IGF-1基因转染心肌细胞后表达分泌IGF-1增加，可促进梗死区新生血管形成，有利于移植细胞的存活，能更好地改善心功能。

外源性胰岛素样生长因子1基因在大鼠骨髓基质细胞中的表达及对其生物学行为的影响

目的:观察人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染大鼠骨髓基质细胞(BMSC)后产物的表达及对BM-SC特征的影响。方法:构建hIGF-1逆转录病毒载体并转染BMSC,嘌呤霉素筛选,RT-PCR和ELISA法检测hIGF-1表达,MTT及美蓝、碱性磷酸酶钙钴、苏丹Ⅲ染色观察转染后BMSC增殖、集落形成及分化,并分析药物筛选对其增殖的影响。结果:转染BMSC经筛选后,IGF-1表达的增幅高于未经筛选者(10.7倍∶6.7倍)。与空质粒转染组比较,未经筛选的BMSC增殖加快,而经筛选者增殖和集落形成能力降低,向脂肪及成骨细胞分化增强。结论:基因修饰可成功构建高表达IGF-1的BMSC,并促进其增殖和自然分化,但嘌呤霉素筛选对其自我更新能力有负面作用。

动态压力对负载胰岛素样生长因子1基因兔脂肪间充质干细胞增殖能力和机械性能的影响

背景:脂肪间充质干细胞是目前公认的较为优秀的组织工程软骨种子细胞,基因转染技术可以有效诱导其成软骨分化,应用生物反应器模拟体内力学环境,是目前广大学者探索体外构建组织工程软骨的新思路。目的:探讨周期性动态压应力联合胰岛素样生长因子1基因转染对种植于壳聚糖/明胶支架中的兔脂肪间充质干细胞增殖能力和弹性模量的影响。方法:在脂质体介导下应用pcDNA3.1-IGF-1基因转染兔脂肪间充质干细胞,G418筛选,获得稳定转染的细胞株;将负载或不负载胰岛素样生长因子1基因的脂肪间充质干细胞以5×10^10 L^-1的密度接种于壳聚糖/明胶支架中培养2 d,然后分别于动态压力(2%形变,1 Hz,4 h/d)环境中或静态培养条件下培养7 d;扫描电镜、Masson三色染色及阿尔新蓝染色观察细胞/支架复合物的形态学变化,MTT法绘制细胞增殖曲线,CM-Dil荧光染料标记细胞计数评估细胞增殖效率,DMMB定量测定软骨特异性细胞外基质糖胺聚糖含量,Real time PCR法检测软骨特异性基因Ⅱ型胶原的相对表达,应用BioDynamicTM mechanical tester测量各组细胞/支架复合物不同形变时的轴线压应力,计算对应的弹性模量。结果与结论:动态压力联合胰岛素样生长因子1转染可显著提高脂肪间充质干细胞的增殖能力,细胞分布更为均匀,软骨特异性细胞外基质糖胺聚糖及胶原分泌增多,上调Ⅱ型胶原基因的表达,机械性能显著改善。单纯胰岛素样生长因子1组的细胞增殖能力和弹性模量均优于单独动态压力组,但动态压力条件下细胞在支架中分布更为均匀。结果表明,动态压力与胰岛素样生长因子1基因转染均可显著提升兔脂肪间充质干细胞的增殖能力和机械性能,二者呈协同作用。