胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3限制性表位肽诱导的细胞毒性T淋巴细胞的体外免疫应答

目的探讨胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位诱导的CTL对肺癌细胞的作用。方法使用软件Net CTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB预测选取IGF2BP3的人类白细胞抗原A2(HLA-A2)限制性表位肽。T2A2与表位肽的亲和力实验检测候选表位与T2A2细胞表面HLA-A2分子的结合能力,酶联免疫斑点(ELISPOT)实验检测候选表位肽诱导CTL分泌γ干扰素(IFN-γ)的能力,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)荧光染色检测细胞诱导CTL的能力。结果P143、P199、P280、P409、P515具有较好的结合力。表位肽P409、P515诱导的CTL具有较好的分泌IFN-γ的能力,并且对靶细胞具有一定的杀伤作用。结论P409、P515有望用于肿瘤的过继免疫治疗,可以成为抗肿瘤多肽免疫治疗疫苗的候选表位。

胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3在CIN及宫颈癌患者中的表达及其在宫颈病变筛查中的意义

目的分析宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌患者胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IMP3)的表达情况及其在宫颈病变筛查中的意义。方法采用回顾性研究,收延安市宝塔区人民医院120例患者的宫颈组织标本,包括慢性宫颈炎18例,CINⅠ级31例,CINⅡ级20例,CINⅢ级24例,宫颈癌27例。以CIN I为低度鳞状上皮内病变(LSIL)组,CINⅡ、CINⅢ为高度鳞状上皮内病变(HSIL)组。检测低危型人乳头状瘤病毒(LR-HPV)与高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)分型,通过免疫组织化学法检测宫颈组织中IMP3蛋白表达水平。结果 120例患者中,LR-HPV与HR-HPV检出率分别为4. 17%(5/120)、68. 33%(82/120)。慢性宫颈炎组、LSIL组、HSIL组、宫颈癌组HR-HPV检出率逐渐增高,其中LSIL组、HSIL组、宫颈癌组HR-HPV检出率均显著高于慢性宫颈炎组(P <0. 01),而HSIL组与LSIL组、宫颈癌组HR-HPV检出率的比较,差异均无统计学意义(P> 0. 05)。120例患者中,IMP3蛋白表达阳性率为69. 17%(83/120)。LSIL组IMP3阳性率明显高于慢性宫颈炎组,宫颈癌组和HSIL组IMP3阳性率均明显高于LSIL组和慢性宫颈炎组(P <0. 05);宫颈癌组与HSIL组IMP3阳性率比较,无显著差异(P> 0. 05)。LR-HPV感染与IMP3阳性表达无密切关系(P>0. 05);HR-HPV感染与IMP3带状表达具有正相关关系(P <0. 05),而与IMP3阴性表达、点状表达均无密切相关性(P>0. 05)。结论随着宫颈病变程度的增高,IMP3蛋白表达阳性率亦随之升高,提示其对宫颈病变进展情况具有一定的预测价值,且IMP3带状表达与HR-HPV感染的发生密切相关,因此二者联合检测可作为临床早期筛查宫颈病变的一种可行方法。

肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定

目的构建胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体。方法用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达。所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白。将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定。结果成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90%以上。ELISA确定抗体效价在1∶50000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。结论成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体。

RNA干扰胰岛素样生长因子结合蛋白2基因治疗胶质瘤的体外实验研究

目的研究与胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGF-BP2)对胶质瘤的抑制作用。方法化学合成3条针对IGF-BP2的siRNA和1条阴性对照siRNA,采用小分子干扰RNA技术使胶质瘤U251细胞的IGF-BP2基因沉默。通过逆转录PCR和免疫组化的方法检测IGF-BP2的表达,用MTT法检测干扰后U251细胞的增殖活性变化。结果逆转录PCR检测表明转染后24hIGF-BP2的mRNA表达明显降低,空白对照、阴性对照、脂质体、siRNA1、siRNA2、siRNA3组中IGF-BP2mRNA水平分别为:0.88±0.02,0.87±0.03,0.84±0.02,0.65±0.03,0.55±0.04和0.64±0.02。48h分别为0.93±0.04,0.90±0.04,0.93±0.03,0.76±0.04,0.58±0.03和0.75±0.02,72h为0.95±0.04,0.95±0.03,0.94±0.02,0.78±0.05,0.60±0.02和0.76±0.03。3条siRNA中siRNA2作用最显著。免疫组织化学方法检测表明IGF-BP2的蛋白表达阳性率也由92.3%明显降低至24h的15%,至48h为52.5%,仍低于正常胶质瘤细胞。RNA干扰后胶质瘤细胞的MTT值虽在缓慢升高,于24h相对于对照组差异无统计学意义,但至48h和72h均低于对照组(P<0.05)。结论理想的IGF-BP2小分子干扰RNA序列能够抑制该基因的mRNA和蛋白的表达并能抑制胶质瘤细胞的增殖活性。

大鼠胰腺β肿瘤细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白-2和3的表达调控

目的:研究大鼠胰腺β肿瘤细胞(INS-1)中,生长激素(GH)、催乳素(PRL)、葡萄糖和胰岛素对胰岛素样生长因子结合蛋白-2和3(IGFBP-2、3)的表达调控,探索IGFBP-2和3对维持正常β细胞生理功能的作用。方法:RNA印迹法检测INS-1细胞中IGFI3P-2和3的mRNA表达情况及蛋白免疫印迹法分析INS-1细胞中IGFBP-3和2蛋白表达。结果:在INS-1细胞中,GH和PRL调控IGFBP-3 mRNA和蛋白表达。葡萄糖对IGFBP-2 mRNA调节作用不同:高浓度(10 mmol/L)葡萄糖条件下,IGFBP-2 mRNA表达被抑制;低浓度(1.0～5.6 mmol/L)葡萄糖条件下,IGFBP-2 mRNA有表达。葡萄糖浓度为5.6 mmol/L时,加入GH孵育16 h,IGFBP-2 mRNA表达被抑制。外源胰岛素抑制 IGFBP-2 mRNA的表达。结论:GH和PRL可以调控IGFBP-3的mRNA和蛋白表达,IGFBP-2 mRNA表达主要通过胰岛素调控。

胰岛素样生长因子和胰岛素样生长因子结合蛋白-3与胎儿生长受限的关系

目的检测胰岛素样生长因子-1、2(IGF-1、2)和胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)水平,分析IGF-1、2和IGFBP-3的含量变化与胎儿生长受限(FGR)的关系。方法选取2011年1月至2013年12月在苏北人民医院妇产科住院,诊断为FGR的孕妇36例及同期住院的正常妊娠妇女30例作为受试对象。采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测36例FGR孕妇(试验组)和30例正常妊娠女性(对照组)外周血和脐静脉血中IGF-1、2和IGFBP-3的浓度,并比较两组新生儿体重。结果试验组孕妇血清及新生儿脐血IGF-1、2和IGFBP-3水平均低于对照组(P<0.05)。孕妇血清IGF-1、2和IGFBP-3水平均高于新生儿脐血IGF-1、2和IGFBP-3水平(P<0.05)。试验组的新生儿体重明显小于对照组(P<0.05)。结论IGF-1、2和IGFBP-3这三个因子可能是导致FGR发生发展的重要因素之一,可作为判断胎儿生长发育的一项客观指标。

胰岛素样生长因子结合蛋白3增强子元件(IEE)的生物学特征

背景:在细胞水平,胰岛素样生长因子结合蛋白3竞争性地与胰岛素样生长因子结合阻止了胰岛素样生长因子与其受体结合,从而抑制了胰岛素样生长因子的活性。目的:观察衰老细胞中调节性蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白3的生物学特征。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-09在西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室完成。材料:人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)购于中国生物制品研究所。方法:用Northern的方法显示胰岛素样生长因子结合蛋白3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异;聚合酶链反应扩增出人类胰岛素样生长因子结合蛋白3上游包括5'-UTR区的2kb的序列,并用酶切得到4组不同长短的胰岛素样生长因子结合蛋白3启动子片段并确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件-IEE(IGFBP-3enhancer element)及其与蛋白结合的碱基序列等;用DNase I Footprinting法确定了IEE中与蛋白结合的核心序列。主要观察指标:①胰岛素样生长因子结合蛋白3基因在年轻和衰老细胞中的表达差异。②通过重叠寡核苷酸确定增强子元件。③通过凝胶阻滞试验证实该复合物结合活性与衰老相关的。④通过凝胶阻滞试验确定IEE与蛋白结合的碱基序列。⑤用DNase I Footprinting法确定IEE中与蛋白结合的核心序列。⑥判断与IEE结合蛋白的相对分子质量。结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3基因的表达升高;5'-cca gcc tgc caa gca gcg tgc ccc ggt tgc-3'是胰岛素样生长因子结合蛋白3的增强子元件;该元件与蛋白结合的核心序列是CTG CCA和GCG TGC CCC G,而且这种结合是与衰老相关的;结合蛋白的相对分子质量大约在27000。结论:在2BS细胞中发现了一个新的转录增强子,它与蛋白结合的核心序列是CTG CCA和GCG TGC CCC G,可与一个大约27000的蛋白结合;在衰老细胞中可选择性地促进胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达。

衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3的表达

目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)表达增加的影响因素。方法:用Northernblot的方法显示IGFBP-3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异;PCR扩增出人类IGFBP-3上游包括5′-UTR区的2kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP-3启动子片段;将各片段用Effectene Transfection Reagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中IGFBP-3基因的表达升高;在IG-FBP-3启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点;5′-ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc-3′是IGFBP-3的增强子元件。结论:在衰老的2BS细胞中IGFBP-3基因上游-37到-8的30bp序列存在一个新的增强子元件IEE(IGFBP-3enhancerelement),对IGFBP-3的表达起到调控作用。

微小RNA-124-3p靶向胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

目的探讨微小RNA-124-3p(miR-124-3p)靶向胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响。方法选取2015年1月—2021年1月磐石市医院保存的子宫内膜癌组织及癌旁组织20例,分析miR-124-3p在癌组织、癌旁组织中的表达及与患者临床病理特征的关系。用子宫内膜癌MFE-280细胞进行miR-124-3p沉默和过表达转染,分为空白组、miR-124-3p-inhibitor组、miR-124-3p-mimic组,分析调控miR-124-3p表达对子宫内膜癌MFE-280细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响。采用双荧光素酶报告实验预测miR-124-3p的靶基因,分析miR-124-3p对子宫内膜癌MFE-280细胞IGF2BP1表达量的影响。结果子宫内膜癌组织miR-124-3p表达量(1.01±0.09)低于癌旁组织(1.89±0.25),差异有统计学意义(t=14.810,P<0.05)。miR-124-3p与FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移、肌层浸润深度有关,miR-124-3p在Ⅳ期、G3分级、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2的患者中表达降低(均P<0.05)。miR-124-3p-inhibitor组72 h细胞增殖率[(52.31±3.44)%vs.(40.12±2.32)%]、迁移率[(57.63±7.89)%vs.(45.65±6.72)%]、细胞穿膜数[(348.97±40.76)个vs.(245.63±24.53)个]高于空白组,差异均有统计学意义(t=9.290、3.655、6.869,均P<0.05),miR-124-3p-inhibitor组凋亡率[(20.12±1.12)%vs.(31.45±6.49)%]低于空白组,差异有统计学意义(t=6.394,P<0.05)。miR-124-3p-mimic组72h细胞增殖率[(17.89±1.54)%vs.(52.31±3.44)%]、迁移率[(16.87±1.12)%vs.(57.63±7.89)%]、细胞穿膜数[(55.64±6.91)个vs.(348.97±40.76)个]低于miR-124-3p-inhibitor组,差异均有统计学意义(t=28.880、16.170、22.440,均P<0.05),凋亡率[(77.16±10.25)%vs.(20.12±1.12)%]高于miR-124-3p-inhibitor组,差异有统计学意义(t=17.490,P<0.05)。双荧光素酶报告实验发现:miR-124-3p可抑制WT-IGF2BP1的3’-UTR荧光素酶活性,对MUT-IGF2BP1的3’-UTR荧光素酶活性无影响,且相关性分析显示miR-124-3p与IGF2BP1在子宫内膜癌中呈负相关(r=-0.409,P<0.05)。miR-124-3p-inhibitor组IGF2BP1表达量(2.31±0.19 vs.1.34±0.14)高于空白组,差异有统计学意义(t=13.000,P<0.05);miR-124-3p-mimic组IGF2BP1表达量(0.68±0.10 vs.2.31±0.19)低于miR-124-3p-inhibitor组,差异均有统计学意义(t=24.010,P<0.05)。结论miR-124-3p在子宫内膜癌中低表达,过表达处理后经靶向调控IGF2BP1表达而影响子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭,促进凋亡。

血管内皮生长因子受体2 可溶性fms样酪氨酸激酶受体1 胰岛素样生长因子结合蛋白3在胎儿生长受限孕妇中的表达及相关性分析

目的分析血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、可溶性fms样酪氨酸激酶受体1(sFlt-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)在胎儿生长受限孕妇中的表达及相关性。方法选取2018年1月—2021年6月厦门市妇幼保健院收治的胎儿生长受限孕妇88例为研究组,另外选取于该院进行正常产检的孕妇88例为对照组,采用酶联免疫法、实时荧光定量法检测VEGFR2、sFlt-1、IGFBP-3表达,分析VEGFR2、sFlt-1、IGFBP-3在胎儿生长受限中的表达变化及相关性。结果与对照组相比,研究组VEGFR2、IGFBP-3水平降低,sFlt-1水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGFR2、sFlt-1、IGFBP-3表达与孕妇年龄、产次、贫血、糖尿病无关,差异无统计学意义(P>0.05)。VEGFR2、sFlt-1、IGFBP-3表达与孕妇孕期体质量、妊娠期高血压、蛋白尿、羊水相关,孕期体质量增长不足、患有妊娠期高血压、有蛋白尿发生、羊水过少孕妇VEGFR2、IGFBP-3表达降低,sFlt-1表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGFR2、sFlt-1、IGFBP-3之间Pearson相关性分析显示,VEGFR2、sFlt-1之间负相关(r=-0.691,P<0.01);VEGFR2、IGFBP-3之间正相关(r=0.559,P=0.001);sFlt-1、IGFBP-3之间负相关(r=-0.673,P=0.001)。ROC曲线显示,与VEGFR2、sFlt-1、IGFBP-3单项诊断相比,三项联合对胎儿生长受限的预测价值较高(P=0.001)。结论VEGFR2、IGFBP-3在胎儿生长受限孕妇中表达降低,sFlt-1升高,其可能与孕妇孕期的体质量及妊娠期高血压相关,且VEGFR2、sFlt-1、IGFBP-3具有一定相关性,共同参与疾病的发展。

胰岛素样生长因子家族成员在早期自然流产中作用的研究

目的研究胰岛素样生长因子(IGF)家族成员在早期自然流产中的作用。方法采用荧光定量PCR方法检测正常早孕及自然流产绒毛组织中IGF2基因、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)基因和胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)基因mRNA表达,并比较各指标间的相关性。结果自然流产绒毛组织中IGF2、IGFIR mRNA表达明显低于正常绒毛组织(P<0.01);两种绒毛组织中IGFBP3 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。正常绒毛组织中IGF2 mRNA表达量与IGF1R mRNA表达量呈正相关(r=0.345,P<0.01),与IGFBP3 mRNA表达量无相关性(r=0.22,P=0.292);自然流产绒毛组织中IGF2 mRNA表达量与IGF1R和IGFBP3 mRNA表达量间均无相关性(P>0.05)。结论 IGF家族成员IGF2和IGF1R mRNA表达的降低可能与早期自然流产发生有关。

胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1在动脉粥样硬化中的作用与机制

胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白(insulinlike growth factor-2 m RNA-binding proteins,IGF2BPs)属于进化上保守的RNA结合蛋白家族,包括人类基因组中的IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3^([1-5])。IGF2BPs在胚胎组织中高表达,在成人组织中低表达,在正常和应激条件下参与多种生物过程,如胚胎发生,细胞迁移、增殖和侵袭等^([6-8])。其中IGF2BP1,简称IMP1,是一种N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)结合蛋白,具有超过3 000个m RNA转录靶点,可影响m RNA的稳定性、可翻译性或定位,在癌症和心脏代谢疾病中发挥重要作用^([9-13])。

2型糖尿病合并甲状腺功能亢进患者血清Sema 5A、IGFBP-3水平与糖代谢指标的相关性分析

目的分析2型糖尿病合并甲状腺功能亢进(以下简称甲亢)患者血清信号素5A(Sema 5A)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)水平与糖代谢指标的相关性。方法选取2021年6月至2022年6月邯郸市中心医院收治的73例2型糖尿病合并甲亢患者作为合并组,56例单纯2型糖尿病患者作为糖尿病组,另选取同期在邯郸市中心医院体检的68例健康者作为对照组。比较对照组、糖尿病组、合并组血清Sema 5A、IGFBP-3水平,比较糖尿病组、合并组临床资料[体质量指数、糖尿病病程、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2 h PG)、胰岛素(FIN)、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)、三碘甲腺原氨酸(T_(3))、甲状腺素(T_(4))、游离三碘甲腺原氨酸(FT_(3))、游离甲状腺素(FT_(4))、促甲状腺素(TSH)、促甲状腺激素受体抗体(TRAB)及甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAB)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)]。采用多因素Logisitic回归分析2型糖尿病并发甲亢的危险因素,采用Pearson相关分析2型糖尿病合并甲亢患者血清Sema 5A、IGFBP-3水平与糖代谢指标的相关性,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Sema 5A、IGFBP-3对2型糖尿病合并甲亢的诊断价值。结果合并组血清Sema 5A、IGFBP-3水平高于对照组和糖尿病组,且糖尿病组高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。合并组糖尿病病程长于糖尿病组,血清HOMA-IR、FIN、HbA1c、T_(3)、T_(4)、FT_(3)、FT_(4)、TRAB、TPOAB水平高于糖尿病组,TSH水平低于糖尿病组,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logisitic回归分析结果显示,HOMA-IR、TPOAB、Sema 5A、IGFBP-3水平升高,TSH水平降低为2型糖尿病并发甲亢的危险因素(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,2型糖尿病并发甲亢患者血清Sema 5A、IGFBP-3水平与HOMA-IR、FBG、2 h PG、FIN、HbA1c、HDL-C水平均呈正相关(P<0.05)。2型糖尿病并发甲亢患者血清Sema 5A、IGFBP-3水平与LDL-C水平呈负相关(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清Sema 5A、IGFBP-3诊断2型糖尿病合并甲亢的曲线下面积(AUC)分别为0.854、0.804,2项指标联合诊断的AUC为0.900,且2项指标联合诊断的AUC高于Sema 5A、IGFBP-3单独诊断的AUC(Z联合-Sema 5A=2.156,P=0.043;Z联合-IGFBP-3=2.873,P=0.004)。结论2型糖尿病合并甲亢患者血清Sema 5A、IGFBP-3水平升高,且二者与糖代谢指标密切相关。

胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3在胃癌组织中的表达及其意义

胰岛素样生长因子IImRNA结合蛋白3（insulin—likegrowthfactorⅡmRNA—bindingprotein3，IMP3）足胰岛素样生长因子IImRNA结合蛋白家族的一员。该家族成员在胚胎形成早期的RNA运输、稳定、细胞生长和迁移中起肴重要作用。本研究收集110例胃癌患者的临床病理学资料进行分析，探讨IMP3蛋白表达与胃癌预后之间的关系。

缺氧诱导因子-1α、胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3、增殖细胞核抗原和P53蛋白在反流性食管炎、Barrett食管及食管腺癌组织中的表达

目的观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、胰岛素样生长因子Ⅱm RNA结合蛋白3(insulin-like growth factor-Ⅱm RNA-binding protein 3,IBMP3)、增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA)和P53蛋白在反流性食管炎(ruflex esophagitis,RE)、barrett食管(Barrette esophagus,BE)、食管腺癌(esophageal edenocarcinoma,EAC)组织中的表达情况,分析HIF-1α、IMP3、PCNA和P53的表达在EAC发生过程中的意义。方法采用免疫组化法,检测50份RE、100份BE和100份EAC样本中HIF-1α、IMP3、PCNA和P53蛋白的表达,并取无反酸、烧心等症状,无免疫疾病、感染疾病病史及胃镜下食管下段黏膜无明显病变的功能性消化不良患者样本30份作为对照。结果 HIF-1α蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为14%、54%和92%,与对照组相比,差异有统计学意义(P均<0.05);P53蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为8%、31%和84%,EAC和BE组与对照组相比,差异有统计学意义(P均<0.01);IMP3蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为10%、45%和74%,EAC和BE组与对照组相比,差异有统计学意义(P均<0.01);PCNA蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为22%、47%和74%,EAC和BE组与对照组相比,差异有统计学意义(P均<0.01);EAC与BE组及BE与RE组比较,HIF-1α、P53、IMP3、PCNA蛋白的表达差异有统计学意义(P均<0.01),4种蛋白在RE、BE和EAC组中的表达逐渐增强。HIF-1α表达与IMP3、P53、PCNA表达均呈正相关(P<0.01)。结论 HIF-1α、IMP3、PCNA和P53蛋白的表达与BE、EAC的发生发展密切相关,可用作监测BE、EAC早期发生的指标,为今后BE及EAC的治疗提供新的途径。

METTL3通过IGF2BP2依赖性方式参与m6A修饰调控HBV复制的机制

目的探究胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2,IGF2BP2)协助甲基转移酶样3(methytransferase like 3,METTL3)通过N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰调控HBV复制的分子机制。方法以HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15及其亲本细胞HepG2为模型,斑点杂交分析m6A修饰水平,RT-qPCR和Western blot检测METTL3、IGF2BP2表达。生物信息学及免疫共沉淀分析METTL3与m6A阅读蛋白及其相互作用。将METTL3质粒、METTL3 siRNA和(或)IGF2BP2 siRNA转染至HepG2.2.15细胞,分别记为OE-METTL3、si-METTL3、si-IGF2BP2、OE-METTL3+si-IGF2BP2、si-METTL3+si-IGF2BP2、Control组;qPCR检测HBV DNA、HBV rcDNA、HBV cccDNA拷贝数,RT-qPCR或Western blot检测HBV pgRNA、METTL3、IGF2BP2表达。结果与HepG2细胞相比,在HepG2.2.15细胞中m6A修饰富集,METTL3、IGF2BP2表达水平升高(P<0.05)。与Control组相比,在OE-METTL3组中m6A修饰富集增强,IGF2BP2表达水平升高(P<0.05),HBV复制相关指标(HBV DNA、HBV rcDNA、HBV cccDNA、HBV pgRNA)升高(P<0.01);在si-METTL3组中则相反。生物信息学分析及免疫共沉淀显示METTL3与IGF2BP2为互作蛋白。与Control组相比,在si-IGF2BP2组中m6A修饰富集减弱,METTL3表达水平降低(P<0.01),HBV复制相关指标降低(P<0.01)。在OE-METTL3+si-IGF2BP2组中,HBV复制相关指标较OE-METTL3组降低(P<0.001)。在si-METTL3+si-IGF2BP2组中,HBV复制相关指标较si-METTL3组、si-IGF2BP2组降低(P<0.05)。结论METTL3依赖IGF2BP2富集m6A通过增强HBV rcDNA转化为cccDNA,进而增强pgRNA逆转录复制病毒。

泛素特异性蛋白酶21对胆管癌细胞增殖及迁移的影响及机制

目的:探究泛素特异性蛋白酶21(USP21)在胆管癌(CCA)中的表达及其对CCA细胞增殖与迁移的作用及其机制。方法:通过生物信息学方法和免疫组化及WB法检测CCA组织及细胞中USP21的表达情况。利用体外克隆形成、EdU及Transwell实验检测敲低USP21对CCA细胞QBC939和RBE增殖及迁移的影响。通过RNA测序、质谱、免疫共沉淀(Co-IP)及WB法探究USP21的促癌机制。结果:TCGA等数据库分析结果显示,USP21 mRNA在CCA组织中呈高表达(均P<0.05)。USP21蛋白在CCA组织和细胞中呈高表达(P<0.05或P<0.001或P<0.0001)。敲低USP21后,QBC939和RBE细胞的增殖和迁移能力均显著降低(P<0.01或P<0.001)。RNA测序结果表明,敲低USP21可以通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制CCA细胞的增殖和迁移能力(P<0.05)。质谱鉴定发现,USP21与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)相结合。Co-IP和WB实验结果表明,USP21与IGF2BP1结合并通过泛素化途径调控IGF2BP1的蛋白表达(P<0.001或P<0.0001)。结论:USP21在CCA组织和细胞中均呈高表达,其通过IGF2BP1/PI3K/AKT信号通路增强CCA细胞的增殖及迁移能力。

短发夹RNA靶向沉默大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞胰岛素样生长因子结合蛋白-3的研究

目的 筛选靶向抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMC）中胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）基因表达最有效的短发夹RNA（shRNA）,为基因沉默IGFBP-3治疗大鼠勃起功能障碍提供依据.方法 构建4对靶向IGFBP-3的短发夹RNA（shRNA）质粒和阴性对照,体外原代培养CCSMC,分6组：空白对照组、转染pGPU6/GFP/Neo-IGFBP-3 （611）组、转染pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP-3 （526）组、转染pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP-3 （866）组、转染pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP-3 （710）组和转染pGPU6/GFP/Neo-shNC阴性对照组;转染48h后各组分别用实时定量聚合酶链反应（PCR）和Western blot方法检测靶向沉默IGFBP-3的效果.结果 CCSMC转染后实时定量PCR和Western blot检测发现,pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-526、pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-611、pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-866均有明显的沉默效果,与空白对照组和转染pGPU6/GFP/Neo-shNC组比较差异有统计学意义,而其中pGPU6/GFP/Neo-shIGFBP3-526沉默效果最明显,实时定量PCR和Western blot结果显示分别可以抑制72%和79%.结论 靶向IGFBP-3基因的shRNA能够高效抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中靶基因的表达,为进一步体内实验奠定基础.

胰岛素样生长因子结合蛋白-3通过细胞外信号调节激酶1/2信号通路调控多胶母细胞瘤增殖的机制

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)在胞内高表达及胞外刺激促进胶质母细胞瘤U87MG增殖的机制。方法培养胶质母细胞瘤U87MG细胞株,构建的pCMV/IGFBP-3质粒转染U87MG细胞,分为未处理组(Control)、转染pcDNA3.1(+)、空载体组(NC1)、转染pCMV-Myc空载体组(NC2)、转染pCMV-IGFBP-3组(Ⅰ)、转染pcDNA3.1(+)/ pCMV-Myc组(NC1+NC2),采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、Western blot检测IGFBP-3、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、B细胞淋巴瘤/白血病-XL(bcl-XL)的表达;采用噻唑蓝(MTT)比色法分析IGFBP-3细胞因子对U87MG细胞的增殖作用,U87MG细胞经IGFBP-3于0、5、10、30 min时间段刺激后,提取的各时间段细胞总蛋白,定量后进行蛋白印迹分析,观察ERK1/2、bcl-XL蛋白的表达及ERK1/2磷酸化的变化。结果Real-time PCR显示ERK1、ERK2、bcl-XL的mRNA相对表达量为(1.32±0.45)、(1.19±0.14)、(2.83±0.56),ERK1的mRNA表达有升高趋势(P<0.01),ERK2的mRNA表达无明显变化(P>0.05),bcl-XL的mRNA明显升高(P<0.01);Western blot发现ERK1/2的灰度值(178.86±4.89,188.19±5.07)蛋白表达量无变化,但其磷酸化水平明显增强,bcl-XL的灰度值(151.85±5.71,214.37±4.71)蛋白表达量明显升高。MTT比色法检测结果表明IGFBP-3浓度的增加,细胞株呈明显增殖效应,其中500 ng/ml的IGFBP-3细胞因子刺激作用较大(P<0.01);刺激U87MG细胞株培养,蛋白印迹实验显示0、5、10、30 min、1、2 h时间段表达量,ERK1/2为163.18±4.45、159.36±5.67、161.27±3.23、172.41±4.01、177.41±2.42、169.11±1.45没有变化;pERK1/2(27.51±2.34、52.25±3.56、51.75±3.67、57.55±5.01、66.75±3.67、47.49±2.76)随时间延长而逐渐增加,2 h后出现减弱;bcl-XL(18.77±2.78、46.14±3.29、52.43±3.62、82.87±2.71、60.02±0.18、56.94±2.16)随时间延长而先增加后降低,在1 h出现下降。结论IGFBP-3胞内高表达和从胞外刺激U87MG细胞后均能增加ERK1/2下游调控基因bcl-XL的表达,进一步促进胶质母细胞瘤瘤细胞的增殖。