棕榈酸诱导胰岛素瘤细胞MIN6细胞凋亡

目的探讨蛋白激酶B及其磷酸化在棕榈酸诱导的胰岛素瘤细胞MIN6凋亡中的作用。方法胰岛素瘤细胞MIN6分别在含有不同棕榈酸浓度(0～0.5 mmol/L)的DMEM高糖培养基中孵育,培养基中加或不加PI3K/PKB的阻断剂LY294002;TUNEL法观察凋亡并计数凋亡率;透射电镜观察MIN6细胞超微结构;Western blot检测蛋白激酶B(PKB)及其磷酸化蛋白p-PKB(Ser473)的表达;RT-PCR法检测BAX、BCL-2mRNA的表达。结果MIN6细胞凋亡随着培养基中棕榈酸浓度的增加而增加,LY294002可增强其凋亡程度;棕榈酸抑制MIN6细胞的PKB在473位丝氨酸位点的磷酸化,抑制BCL-2mRNA的表达并促进BAXmRNA的表达。结论棕榈酸可能通过抑制PKB磷酸化的激活而诱导糖尿病时胰岛β细胞的凋亡。

琼脂糖/聚苯乙烯磺酸微囊化胰β细胞株MIN6体外胰岛素释放反应的研究

本研究应用琼脂糖/聚苯乙烯磺酸(PSSa)微囊化胰β细胞株MIN6作为一种新型人工生物胰岛,采用静态培养胰岛素释放试验和灌流实验,探讨其在体外糖刺激时胰岛素的释放反应.静态培养胰岛素释放试验结果显示,低糖浓度(3.3mmol/L)时胰岛素的分泌释放量为8.824±0.698μU/(100microbeads·h);高糖浓度(16.7mmol/L)刺激时胰岛素的分泌释放量为28.045±4167μU/(100microbeads·h),约为低糖浓度时的3.2倍,有显著性差异(P<0.05).灌流实验结果显示,用16.7mmol/L糖浓度刺激,胰岛素的释放量逐渐增加,约在高糖刺激后50分钟时胰岛素的释放量达到高峰,约为38.66μU/(100microbeads·h);将糖浓度改变为3.3mmol/L,胰岛素的释放量逐渐下降.实验结果表明,琼脂糖/聚苯乙烯磺酸免疫隔离膜微囊化胰β细胞株MIN6作为一种新型人工生物胰岛,具有良好的糖刺激胰岛素释放反应,为进一步进行实验及临床移植的深入研究提供了基本的实验依据.

小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长

目的建立一过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞株，研究其在低葡萄糖环境中的生长特性。方法将全长Reg3α cDNA插入到质粒载体pcDNA3．1中，并将Reg3α-pcDNA3．1和pcDNA3．1空载体用脂质体法转染胰岛MIN6细胞，分别获得Reg3α cDNA过表达和空载体pcDNA3．1MIN6细胞。应用Real—time PCR和Western blot方法检测这两种细胞在低葡萄糖培养基中Reg3α的表达，并用MTT法测定Reg3α过表达对MIN6细胞生长的影响。结果有三株Reg3α转染的细胞株显示Reg3α的高表达，在空载体转染的MIN6细胞株中未检测到Reg3α的表达，Reg3α mRNA和蛋白水平分别平均升高6～10倍。用Western blot检测发现Reg3α蛋白释放到培养液。采用MTT法测定，与空载体转染的MIN6细胞株相比，三株Reg3α稳定转染细胞株，7d后细胞数目升高2倍。结论本研究结果表明已成功地建立了过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞。Reg3α可能具有内分泌作用，促进胰岛细胞生长。

腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白A2基因过表达及其对细胞增殖的影响

目的探讨腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白A2(cyclin A2)基因过表达及其对细胞增殖的影响。方法将对数生长期的小鼠胰岛素瘤MIN6细胞分为实验组、空病毒对照组及空白对照组,实验组及空病毒对照组分别给予腺病毒介导的cyclin A2基因及空腺病毒载体转染MIN6细胞,空白对照组不给予处理。检测3组MIN6细胞cyclin A2mRNA及蛋白的表达情况,以及细胞增殖活性。结果转染后24 h,实验组cyclin A2 mRNA及蛋白表达水平均高于空病毒对照组及空白对照组(P<0.05);转染后24 h、36 h、48 h、60 h及72 h,实验组的吸光度值均高于空病毒对照组及空白对照组(均P<0.05)。结论腺病毒介导的cyclin A2基因成功转染MIN6细胞,并可促进MIN6细胞增殖。

猪胰岛素启动子调控EGFP表达载体的优化及体外验证

目的获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础。方法利用猪胰岛素启动子(PIP,包含5'调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5 kb)构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-Hind IIIEGFP。鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化:将Hind III酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3'端的内含子剪接受体位点(splicing acceptor site,SA)突变为Hind III内切酶识别位点,命名为PIP-SA(M)-EGFP。三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48 h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Western blot检测,验证载体的表达效率。结果转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光。RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异:载体PIP-Hind III-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA(M)-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Western blot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高。结论通过突变胰岛素启动子第一内含子的3'端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪。

糖化终末产物对MIN6细胞活力及活性氧（ROS）水平的影响

探讨糖化终末产物（AGE）对小鼠胰岛细胞株MIN6细胞活力及活性氧（ROS）水平的影响。制备BSA—AGE，用不同浓度AGE（100、200、400mg／L）干预MIN6细胞不同时间后，MTT比色法检测细胞活力变化。以活性氧捕获剂双氢一乙酰乙酸二氯荧光黄（DCFH—DA）孵育细胞，通过流式细胞仪检测细胞内二氯荧光黄（DCF）的荧光强度而测得细胞内活性氧水平，并测定胰岛素分泌的变化。随着AGE浓度的升高和作用时间的延长，细胞活力明显下降（P〈0．05）。经DCFH．DA孵育后流式细胞仪检测显示，AGE处理组细胞内DCF平均荧光强度较对照组明显升高（P〈0．05）。胰岛素分泌量随着AGE浓度的增高和时间的延长，呈下降趋势（P〉0．05）。提示BSA-AGE抑制MIN6活力，使细胞内活性氧生成增加，诱导MIN6细胞氧化应激。

Wnt3a对小鼠beta细胞株增殖的影响

目的分析wnt3a蛋白对小鼠胰腺beta细胞株增殖的影响。方法培养MIN6细胞株,并用不同浓度的wnt3a蛋白或者相同浓度wnt3a蛋白在不同时间点刺激MIN6细胞,用Western blot的方法检测MIN6细胞内的信号分子改变。培养MIN6细胞株,并用wnt3a蛋白刺激,分别在第0、1、2、3、4 d分裂并数细胞个数,比较有wnt3a刺激组与无wnt3a刺激组细胞个数有无区别。结果不同浓度wnt3a刺激,对于MIN6细胞内beta-catenin以及Pitx2的表达有影响,当wnt3a浓度为1:8时,beta-catenin以及Pitx2的表达最高。用1:8的wnt3a蛋白浓度刺激MIN6细胞,分别设置0 min、10 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h。结果显示6 h时,beta-catenin表达量最高。比较控制组与wnt3a刺激组细胞增殖的区别,wnt3a蛋白刺激组细胞增殖程度明显高于控制组。结论wnt3a可以促进胰腺beta细胞的增殖,表明wnt信号通路对于胰腺beta细胞有重要的调控作用。