黄河鲤胰岛素诱导基因1(INSIG1)序列特征、SNP位点及其与生长性状的关联分析

为探究胰岛素诱导基因1(insulin-induced gene,INSIG1)在黄河鲤(Cyprinus carpio haematoperus)生长发育过程中的作用,采用候选基因法对黄河鲤生长候选基因INSIG1进行了序列特征分析、组织表达及SNP与生长性状的关联分析。结果表明:黄河鲤INSIG1基因全长为4853 bp,包含5个外显子和4个内含子,其中cDNA全长为1530 bp,蛋白编码区(CDS)全长为756 bp,可编码251个氨基酸;INSIG1在不同物种间序列保守性较高,黄河鲤INSIG1与金线鲃、斑马鱼和鲫等鲤科鱼类聚为一支;预测黄河鲤INSIG1蛋白相对分子质量为27674.25,理论等电点为8.09,属于稳定的疏水性蛋白,该蛋白无信号肽,包含6个跨膜结构,蛋白三级结构包含6个α-螺旋和部分无规则卷曲;qRT-PCR分析显示,INSIG1基因在黄河鲤肝、脾、肾、肠、心脏、鳃、脑、肌肉和皮肤等组织中均有表达,其中在肠和肝组织中表达量较高,在鳃组织中表达量最低;黄河鲤INSIG1基因共鉴定到10个SNP位点,其中g.1854T>C和g.1982A>T 2个SNP位点的不同基因型与黄河鲤肥满度性状显著相关(P<0.05),其他位点的不同基因型与生长性状未表现出显著关联性。研究表明,INSIG1基因参与了黄河鲤的生长发育过程,其突变位点g.1854T>C和g.1982A>T显著影响了黄河鲤的肥满度,该结果为黄河鲤生长性状的分子标记辅助育种提供了可用的分子标记,对于选育具有优良性状的黄河鲤具有重要的实践意义。

牛科物种胰岛素诱导基因1(INSIG1)研究进展

胰岛素诱导基因1编码蛋白(INSIG1)定位于内质网膜上,是调控脂代谢的重要因子。INSIG1主要通过调控固醇调控元件结合蛋白(SREBP)和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)来影响脂质代谢。越来越多的研究结果揭示了INSIG1在生物体内作用的复杂性。本文综述了INSIG1与SREBP和HMGR之间在脂代谢调控过程中的相互作用机制、INSIG1的结构及表达调控、INSIG1对牛科动物泌乳、生长等性状的影响。

胰岛素诱导基因及其在猪育种中应用的研究进展

胰岛素诱导基因(INSIG)有2种亚型,即INSIG-1和INSIG-2,其主要功能是调控脂肪代谢,在细胞内固醇的参与下,影响固醇调节元件结合蛋白(SREBP)活化,对脂肪的形成具有重要作用。主要介绍了INSIG基因的定位与结构、功能、表达调控及其在猪育种中的应用。

胰岛素诱导基因2基因多态性rs7566605与肥胖及血脂关系的10年纵向研究

目的：探索不同基因遗传模型下，胰岛素诱导基因2（INSIG2）基因多态性rs7566605在中国老年人群中与肥胖及血脂代谢的关系。方法纵向分析2001年和2010年参加并完成两次北京市老年人健康问卷调查、具有重复测量资料的742例样本。观察参与者体质量指数（BMI）、空腹血糖及血脂指标随年龄变化趋势及年龄因素对血脂代谢遗传效应的影响，并分析不同遗传模型下，rs7566605基因型与肥胖及血脂代谢异常疾病之间的关联。结果10年间两组人群（男性及女性）除BMI值降低以外，空腹血糖，甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及收缩压都有所增加；血清总胆固醇水平在男性人群中增加而在女性人群中降低；此外，2001年资料显示，带有C位点的男性血清空腹血糖及TG水平高于野生GG型，携带C等位基因女性HDL-C水平则表现为下降趋势。rs7566605基因多态性在4个遗传模型下均未发现与肥胖存在统计学关联。在显性及杂合共显性遗传模型下，rs7566605 C等位基因可增加低高密度脂蛋白胆固醇血症的患病风险（显性模型：P＝0.011， OR＝1.726；杂合共显性模型：P＝0.002，OR＝1.890），而对高胆固醇血症存在保护作用（显性模型：P＝0.008，OR＝0.601；加性模型：P＝0.040，OR＝0.753；杂合共显性模型：P＝0.015，OR＝0.634）。结论在中国老年人群中，INSIG2基因上游基因多态性rs7566605 C等位基因与血清脂类代谢可能存在关联，显性或杂合共显性模型或为其主要遗传模式。

小鼠胰岛素诱导基因1 siRNA稳定表达细胞株的建立及其对细胞胆固醇代谢的影响

目的构建并筛选针对小鼠胰岛素诱导基因1(insulin induced gene 1,insig1)siRNA的特异性表达质粒,建立稳定转染细胞株,并观察其对小鼠巨噬细胞RAW264.7胆固醇代谢的影响。方法根据GenBank中登录的insig1基因序列及RNA干扰原则,设计3个阳性克隆及1个阴性克隆序列,定向克隆入pGenesil-1质粒,构建insig1 shRNA真核表达质粒,测序鉴定后,脂质体法转染RAW264.7细胞,筛选干扰效果最佳的质粒,将其转染入RAW264.7细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中insig1基因的转录水平及蛋白的表达水平,油红O染色观察转染细胞中胆固醇含量的变化。结果酶切及测序结果证实,insig1基因shRNA表达质粒构建正确,其中si-2为干扰效果最佳的质粒;在稳定转染的RAW264.7细胞中,si-2组insig1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平较阴性质粒组和未转染组明显降低(P<0.05),油红O颗粒含量最多。结论成功建立了insig1 siRNA稳定表达细胞株,体外模型证明了对insig1基因的干扰可促进细胞胆固醇摄取。

胰岛素诱导基因1和2在猪前体脂肪细胞分化过程的表达

为探讨胰岛素诱导基因1和2(Insig1,Insig2)在猪前体脂肪细胞中的表达规律,分离得到猪前体脂肪细胞,并诱导分化,利用油红O染色提取法测定了细胞中的甘油三酯含量,同时采用实时定量RT-PCR方法检测了脂肪细胞分化标志基因、胰岛素诱导基因1和2的表达。结果表明:在猪前体脂肪细胞诱导分化过程中,Insig1的mRNA表达显著增加(P<0.05);Insig2的mRNA表达量在诱导后24 h显著增加(P<0.05),而后降低。

奶牛胰岛素诱导基因1的克隆、组织分布及稳定表达细胞系的建立

为研究奶牛INSIG1基因的功能,本研究检测了8个组织中INSIG1基因的分布情况,PCR扩增得到INSIG1基因的编码区序列,采用嘌呤霉素筛选稳定表达INSIG1的肝脏细胞系并进行鉴定,结果表明INSIG1基因在奶牛肝脏、小肠、肌肉和脂肪组织的表达丰度较高,将构建的INSIG1-C31真核载体与phi C31整合酶共转染肝脏细胞,经过4μg/m L嘌呤霉素筛选后,获得完全表达绿色荧光蛋白的肝脏细胞系,鉴定表明INSIG1基因已经整合到细胞基因组中。本研究获得了稳定表达INSIG1基因的肝脏细胞系,为深入研究INSIG1基因功能提供了材料。

胰岛素诱导基因-2启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建与鉴定

目的构建胰岛素诱导基因-2(Insulin induced gene-2,Insig-2)启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其转录活性。方法从人基因组DNA中扩增Insig-2基因转录起始位点上游1 389 bp的启动子片段,插入pGL3-basic质粒中,构建重组质粒pGL3-Insig-2,将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染HEK293、HepG2和3T3-L1细胞,采用双荧光素酶法检测Insig-2启动子活性。结果重组质粒pGL3-Insig-2经双酶切和DNA测序,证实构建正确;pGL3-Insig-2质粒在HEK293、HepG2和3T3-L1细胞中均具有启动子活性,分别为阴性对照组(pGL3-basic空载体)的28、40和214倍、阳性对照组(pGL3-SV40)的2.6、5.5和30倍,呈现出强启动子活性。结论成功构建了Insig-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,为后续Insig-2基因的深入研究奠定了基础。

猪胰岛素诱导1基因的cDNA克隆和差异表达及蛋白质序列分析

克隆猪胰岛素诱导1(INSIG1)基因,并对其蛋白质序列进行分析。根据人INSIG1基因的保守序列设计1对引物,以猪总RNA为模板,经RT–PCR获得INSIG1基因序列,通过相对荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达量;将INSIG1基因序列连接到pMD19–T Simple载体上,用PCR检测阳性克隆后测序,并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明,INSIG1基因在肺中的表达量最高,其次是在肝脏,再次是在脾脏,在心脏中的表达量最低;通过克隆,获得了一段999 bp的序列,其中831 bp的开放阅读框编码276个氨基酸;该蛋白不含信号肽序列,与其他动物INSIG1基因氨基酸序列的一致性在71%以上。

α-亚麻酸对胰岛素抵抗HepG2细胞脂类合成基因表达的影响

目的分析在α-亚麻酸(ALA,C18:3)干预后,胰岛素抵抗Hep G2(insulin resistance Hep G2,IR-Hep G2)细胞模型脂类合成关键基因表达水平的变化。方法 Hep G2细胞造模期分为两组,由无血清培养基培养的对照组(normal control group,NC)以及含有0.25 mmol/L软脂酸的无血清培养基培养的软脂酸组(palmitic acid,PA),培养24 h后鉴定细胞胰岛素敏感性并测定细胞内胆固醇(total cholesterol,TCH)、甘油三酯(Tryglyceride,TG)水平,然后用ALA替代20%的PA培养12 h,再次鉴定细胞胰岛素敏感性并检测细胞内TCH、TG水平,real time q PCR检测TG、TCH合成关键基因mRNA水平,Western blot检测TG、TCH合成关键基因蛋白表达量。结果 IR-Hep G2细胞模型建立成功,并且PA组TCH水平显著高于NC组(P=0.0016),出现了脂代谢紊乱;ALA干预IR-Hep G2细胞12 h后,细胞活性有所恢复,与PA组相比,ALA组胰岛素诱导基因(insulin induced genes,INSIGs)及脂类合成关键蛋白的mRNA表达无明显变化;与基因表达结果不一致的是,ALA干预后可以特异性提升细胞内INSIG-2蛋白相对表达量,但对INSIG-1蛋白相对表达量没有明显影响。同时,ALA可以显著抑制55k Da固醇调节元件结合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2)、HMG-Co A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coen-zyme A reductase,HMGCR)及脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)蛋白的表达,且ALA组细胞内TG水平显著降低(P=0.0119)。结论 0.05 mmol/L ALA干预IR-Hep G2细胞后,通过提升INSIG-2蛋白的表达,抑制SREBP-2从内质网到高尔基体的剪切成熟活化,降低细胞内55k Da SREBP-2水平及HMGCR的表达,并且抑制FASN表达,从而抑制了TG/TCH的合成。

乌药醇提物对酒精联合高脂饮食诱导的脂肪肝防治作用研究

目的观察乌药醇提取物(LREE)对酒精性脂肪肝模型小鼠的保护作用,探讨其可能的作用机制。方法32只雄性ICR小鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、易善复组(0.2736 g/kg)和乌药组(1 g/kg),每组8只。采用饮食高脂饲料复合梯度浓度白酒连续灌胃8周复制酒精性脂肪肝模型小鼠,造模的同时给予易善复、LREE进行干预;于第2、4、6、8周采血,全自动生化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性及总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平;实验期末,解剖,取肝脏,油红O染色检测肝组织脂肪病变程度,RT-PCR检测肝组织低密度脂蛋白受体(LDLR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-α)、胰岛素诱导基因1(Insig1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)mRNA表达水平。结果LREE和易善复能抑制高脂饮食+酒精诱导的小鼠体质量增加[(38.6±2.9)g、(39.4±2.3)g比(42.3±1.9)g,P<0.05],实验期末,乌药组及易善复组小鼠血清ALT、AST活性显著降低[ALT:(37.5±8.2)U/L、(41.4±17.5)U/L比(64.3±14.7)U/L,P<0.05;AST:(67.3±23.0)U/L、(67.4±23.9)U/L比(96.3±11.5)U/L,P<0.01],肝组织脂质沉积改善;RT-PCR结果显示,LREE与易善复能上调肝组织LDLR[(0.6±0.1)、(0.8±0.1)比(0.3±0.1),P<0.01]和PPAR-α[(0.8±0.1)、(0.7±0.1)比(0.5±0.1),P<0.05或P<0.01]mRNA表达水平,下调Insig1[(1.6±0.1)、(1.6±0.1)比(3.1±0.4),P<0.01]、SCAP[(1.8±0.2)、(1.3±0.1)比(2.3±0.1),P<0.05]和SREBP-1[(1.5±0.3)、(1.2±0.1)比(2.5±0.1),P<0.01]mRNA表达水平。结论LREE对高脂联合酒精诱导的酒精性脂肪肝具有良好的保护作用,其机制可能与抑制Insig1-SCAP-SERBP1通路活化有关。

山羊INSIG1基因超表达对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响

本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG1)的重组腺病毒(Adenovirus,Ad)超表达载体,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响,从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础。根据GenBank(登录号:JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物,PCR扩增得到其CDS区序列。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒,将该质粒PmeⅠ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁,利用LaSRT法测定其滴度。将获得的重组腺病毒AdINSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞,利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况,利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量。结果表明,成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度(2×108 U·mL-1)的超表达腺病毒Ad-INSIG1;Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48h后,与Ad-GFP组相比,INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍,固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白(SCAP)的mRNA表达量无明显变化,参与脂肪酸从头合成(ACCα、FASN)及去饱和(SCD1)基因的mRNA表达量均显著下降(P<0.05);参与甘油三酯合成的3个关键基因中,GPAM及DGAT2的mRNA表达量显著下降(P<0.05),AGPAT6的表达无显著变化;同时,催化甘油三酯分解(ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降(P<0.05);细胞内甘油三酯含量无显著变化。综上所述,在山羊原代乳腺上皮细胞中,INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂质合成具有调控作用。

INSIG2稳定表达细胞系的建立及该基因对脂肪代谢的影响

目的建立胰岛素诱导基因2(INSIG2)稳定表达细胞系,观察过表达INSIG2后对脂肪代谢的影响。方法构建INSIG2真核表达质粒,经脂质体转染3T3-L1细胞,RT-PCR、免疫细胞化学法鉴定INSIG2阳性细胞株及检测胰岛素诱导基因1(INSIG1)、脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表达;ELISA检测细胞培养液中游离脂肪酸(FFA)的含量;油红"O"染色检测脂肪细胞的分化。结果pcDNA3.1(+)I-NSIG2成功转染3T3-L1细胞,过表达INSIG2后,INSIG1、FASmRNA表达均下调,细胞培养液中游离脂肪酸含量降低,脂肪细胞分化明显抑制。结论获得了INSIG2稳定表达细胞系,过表达INSIG2对脂肪代谢具有抑制作用。

水飞蓟宾对高脂饮食小鼠胰岛β细胞的保护作用

目的:研究水飞蓟宾对高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠胰岛β细胞的保护作用及其可能的机制。方法:18只3周龄雄性C57BL/6J小鼠分为普通饮食组(n=6)、高脂饮食组(n=6)及水飞蓟宾干预高脂饮食组(n=6),干预10周后观察各组小鼠空腹血糖、胰岛素、血脂、谷丙转氨酶、肌酐、尿素氮变化及胰岛β细胞的脂质含量、抗氧化水平及凋亡情况,并检测胰腺组织胰岛素诱导基因-1(insulin-induced gene-1,Insig-1)、固醇调节原件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)的m RNA,以及Insig-1和SREBP-1c蛋白的表达水平。结果:与高脂饮食组相比,水飞蓟宾干预高脂饮食组小鼠胰岛分泌功能明显改善,血糖水平降低(P<0.05),胰岛组织脂质含量、氧化应激水平及凋亡水平均降低(均P<0.05);水飞蓟宾能促进胰岛组织Insig-1的表达,抑制SREBP-1c和FAS的表达(均P<0.05)。三组间谷丙转氨酶、肌酐、尿素氮功能差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:水飞蓟宾对高脂饮食小鼠的胰岛β细胞具有保护作用,其机制可能与调节Insig-1/SREBP-1c途径及增加抗氧化活性有关,且长期口服水飞蓟宾安全性良好。

INSIG1基因SNP rs9769506位点的多态性与2型糖尿病的关系

目的探讨胰岛素诱导基因1(INSIG1)单核苷酸多态性(SNP)rs9769506位点的多态性与2型糖尿病(T2DM)的相关性,以期为T2DM的防治提供潜在的分子靶点。方法选择河南省南阳市中心医院2013年1月至2014年3月收治的T2DM患者98例,另选取体检中心的健康体检者90例作为对照组,INSIG1基因SNP rs9769506位点多态性检测使用实时荧光定量PCR(RT-PCR)Taqman分析。结果 T2DM组rs9769506位点A等位基因频率为54.1%,G等位基因频率为45.9%,对照组A等位基因频率为47.8%,G等位基因频率为52.2%,两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。T2DM组患者rs9769506位点A/A、A/G和G/G基因型频率分别为41.8%、24.5%和33.7%,对照组rs9769506位点A/A、A/G和G/G基因型频率分别为32.2%、31.1%和36.7%,A/A基因型频率在对照组和T2DM组之间差异有统计学意义(P<0.05),而A/G和G/G基因型频率在对照组和T2DM组之间差异则无统计学意义(P>0.05)。T2DM患者中三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)表达水平在A/A、A/G、G/G基因型患者之间差异有统计学意义(P<0.05),而A/G、G/G基因型患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 INSIG1基因SNP rs9769506位点A/A基因型在T2DM患者中检出率高,对T2DM早期筛查及基因治疗具有临床指导意义。

猪INSIG2基因cDNA克隆、序列特征分析及差异表达

为了克隆猪胰岛素诱导2(INSIG2)基因,并对其进行序列特征分析和组织差异表达规律研究,试验提取猪总RNA,反转录c DNA后进行PCR反应,对克隆得到的INSIG2序列进行生物信息学分析,并用实时荧光定量PCR检测INSIG2在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃、肾脏、肌肉7个器官/组织中的表达情况。结果表明:试验获得1段998 bp的序列,该片段编码区序列长度为678 bp,编码225个氨基酸。INSIG2蛋白分子质量为24.730 9 ku,理论等电点为8.64,不含信号肽;INSIG2蛋白有较强的疏水性,具有5个跨膜螺旋结构。与其他动物的INSIG2基因氨基酸序列一致性在92%以上。INSIG2基因在7个被检测器官/组织中均有表达,且肺脏中表达量最高,肝脏次之,再次是胃,心脏和肌肉的表达量最低。

西农萨能奶山羊INSIG-1编码区的克隆、序列特征分析和组织表达

【目的】克隆西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG-1)编码区,并对其进行序列特征分析和组织表达规律研究。【方法】提取西农萨能奶山羊总RNA,反转录cDNA后进行PCR反应,对克隆得到的INSIG-1序列进行生物信息学分析。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测INSIG-1在皮下脂肪、胸部肌肉、乳腺、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏、瘤胃、小肠10个组织中的表达情况。【结果】获得西农萨能奶山羊INSIG-1基因1 014bp序列(Gen-Bank登录号JQ665439),其中编码区序列长度为831bp,编码276个氨基酸。西农萨能奶山羊INSIG-1编码区与牛(GenBank登录号NM_001077909)的亲缘关系最近,相似性达97%,编码氨基酸序列的相似性达90%,而与小鼠(GenBank登录号NM_025836)的亲缘关系较远。预测INSIG-1蛋白质分子量为29.70ku,理论等电点为8.99;IN-SIG-1蛋白质具有5个跨膜螺旋结构,且有较强的疏水性,不含信号肽。RT-qPCR检测结果表明,在西农萨能奶山羊10个组织中INSIG-1均有表达,其中在肝脏中的相对表达量最高,皮下脂肪、胸部肌肉、肺次之,在心脏中的相对表达量最低。【结论】克隆得到了西农萨能奶山羊的INSIG-1基因,并探明了其组织表达规律。

Scap-Insig-2-25HC复合物与细胞内胆固醇水平的调控

固醇调节原件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein,SREBP)是调节细胞内固醇类物质水平的重要细胞核转录因子,通过负反馈机制维持细胞内固醇稳态.SREBP裂解激活蛋白(SREBP-cleavage activating protein,Scap)和胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene-2,Insig-2)、25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol,25HC)对SREBP激活、成熟及核转位具有重要调节作用.最近研究揭示了Scap-Insig-2-25HC复合物的分子结构,这对细胞内胆固醇代谢研究具有重要的意义.

青少年肥胖及代谢异常与INSIG2基因多态性

目的研究胰岛素诱导基因2（INSIG2）rs7566605多态性与我国儿童青少年肥胖和代谢异常的相关性。方法在北京市海淀区选择1 103名7～18岁儿童青少年进行身体和代谢指标测量,并进行rs7566605多态性的基因型鉴定。结果1 103名儿童青少年rs7566605的突变率（G〉C）为35.56%～37.06%,与欧美人群接近。体重正常、超重和肥胖组基因型及等位基因频率差异无统计学意义（P〉0.05）。分层分析发现,超重组CC基因型携带者的皮褶厚度和体脂百分比高于GG/GC基因型者（P〈0.05）;肥胖组CC基因型携带者的甘油三酯（TG）平均比GG/GC基因型者高0.21 mmol/L（P=0.014）。结论ISNIG2基因rs7566605多态性与我国儿童超重或肥胖的发生无相关性,但是该多态性对超重和肥胖儿童青少年体脂含量及TG蓄积可能有一定影响。

使用phiC31整合酶构建奶牛INSIG1基因乳腺恒定表达细胞系

为了使用phiC31整合酶建立奶牛胰岛素诱导基因1(INSIG1)的稳定表达乳腺细胞系,首先从奶牛乳腺组织中克隆得到INSIG1基因的编码区,然后将克隆片段与phiC31载体进行BamHⅠ和KpnⅠ双酶切构建INSIG1-C31真核表达质粒;将其与phiC31整合酶质粒共同转染到小鼠乳腺细胞中,采用嘌呤霉素筛选细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,PCR鉴定细胞基因组中INSIG1基因的表达,荧光定量PCR检测细胞中INSIG1基因的表达。结果表明,试验成功构建INSIG1-C31真核载体,与phiC31整合酶共转染小鼠乳腺细胞,经过8mg/L嘌呤霉素筛选后获得完全表达绿色荧光蛋白的乳腺细胞系;对细胞系鉴定表明INSIG1基因已经整合到细胞基因组中,与对照组相比,INSIG1基因的mRNA表达丰度增加了597.98倍(P<0.001)。本研究获得了稳定表达奶牛INSIG1基因的乳腺细胞系,为深入研究INSIG1基因功能打下基础。