胰岛素铁硒传递蛋白促进组织工程软骨形成的作用

目的研究胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)对组织工程软骨形成的影响。方法第2代猪关节软骨细胞单层培养或离心形成细胞聚集体,根据培养液不同分为2组:常规培养组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清)和ITS组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清+体积分数1%ITS),噻唑蓝(MTT)法评估2组软骨细胞增殖;细胞聚集体培养1、2、3、4周后取材,比较2组细胞聚集体大体形态、湿质量、组织学、Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组织化学染色和软骨特异基因表达。结果 MTT检测显示第5、6、7天ITS组光密度值显著高于常规培养组(P<0.01);ITS组软骨细胞聚集体体积在培养3周和4周时明显大于常规培养组;ITS组湿质量培养4周时为(7.91±1.49)mg,明显高于常规培养组的(5.37±1.31)mg(P<0.05)。ITS组细胞聚集体甲苯胺蓝染色和ColⅡ免疫组织化学染色明显强于常规培养组;2组软骨特异基因SRY相关高迁移组盒子基因9、ColⅡ表达相当,ITS组Ⅹ型胶原表达减弱,核心蛋白和Ⅰ型胶原表达增强。结论 ITS通过促进软骨细胞增殖和细胞外基质分泌可更好地促进组织工程软骨形成。

培养基或水凝胶球添加胰岛素铁硒转运蛋白对软骨细胞去分化的影响

目的在负载软骨细胞的海藻酸钠水凝胶球和/或含血清的培养液中添加胰岛素铁硒转运蛋白(ITS)成分,观察其对软骨细胞去分化的影响。方法用Ⅱ型胶原酶消化法获取2周龄SD大鼠膝关节原代软骨细胞,体外培养传代至P2。实验组分为4组:(1)复合细胞的2%海藻酸钠水凝胶球在常规培养液中进行3D培养,即M-B-组(M:medium,常规培养液;B:Beads,水凝胶球;+和-分别指含与不含ITS成分);(2)复合细胞的2%海藻酸钠水凝胶球在含1%ITS的培养液进行3D培养,即M+B-组;(3)复合细胞的2%海藻酸钠+1%ITS的水凝胶球在常规培养液中进行3D培养,即M-B+组;(4)复合细胞的2%海藻酸钠+1%ITS的水凝胶球在含1%ITS的培养液中进行3D培养,即M+B+组。培养14 d后,各组取水凝胶球进行光镜下直接观察;活死细胞染色观察细胞存活状态;CCK-8试剂检测细胞活力;包埋切片,采用HE染色观察细胞形态;采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测软骨细胞Ⅱ型胶原(ColⅡ)和Sox 9基因的表达情况。结果活死细胞染色的实验结果显示,4组水凝胶球负载的软骨细胞均具有良好的生长状态,只在镜下见到少量死亡细胞;CCK-8实验结果显示培养液中添加ITS比海藻酸钠水凝胶球内增加ITS更能促进软骨细胞增殖;qRT-PCR结果显示,无论在培养液还是水凝胶球内添加ITS,软骨细胞ColⅡ和Sox 9的表达均无显著差异。结论 ITS可以提高海藻酸钠水凝胶球3D培养的软骨细胞的增殖能力,且在培养液中添加ITS对此表现更为显著;但在3D培养体系中,ITS尚不能在特异性软骨细胞相关基因表达上表现出强有力的抑制去分化作用。

以ITS为主要成分的无血清培养基对软骨细胞增殖和表型的影响

目的观察以ITS为主要成分的无血清培养基对软骨细胞增殖和表型的影响。方法培养猪耳软骨细胞,分为无血清组和含血清组,无血清组应用包含胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、地塞米松及维生素C为主要成分的无血清培养基;含血清组应用包含10%血清的常规培养基。观察平面和三维培养状态下无血清培养基对软骨细胞增殖、基质分泌和软骨表型维持的作用。结果平面培养条件下,无血清组的细胞增殖率出现下调,细胞表型不能维持。在三维培养情况下无血清组可以保持软骨细胞存活和软骨细胞的表型,Ⅱ型胶原和蛋白多糖组织学染色结果与含血清组无明显差异,软骨特异基因ColⅡ、Aggrecan的表达与含血清组无明显差异,并能够形成较好的软骨样组织。结论以ITS、地塞米松及维生素C为主要成分的无血清培养基,在三维培养条件下能基本保持软骨细胞的存活和表型,可用于软骨细胞的体外三维培养。