胰岛细胞自身抗原IA-2及其自身抗体在1型糖尿病研究中的意义

IA-2是近年来发现的1型糖尿病的一种主要自身抗原,它不仅是体液性自身免疫反应的靶蛋白,而且可能也是细胞免疫反应的靶分子。对IA-2及其自身抗体的研究,在1型糖尿病发病机制、预测及防治等方面均具有重要的意义。

国人胰岛细胞自身抗原ICA69原核表达型质粒的构建

目的：应用基因工程技术生产适用于I型糖尿病早期诊断的试剂盒打下基础。方法：从中国人胰岛细胞瘤组织总RNA中，经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）克隆了胰岛细胞自身抗原69KD蛋白（ICA69）基因的cDNA，双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定后，将此编码483个氨基酸、全长1449bp的cDNA重组入表达型质粒中。结果：核苷酸序列分析证实重组质粒接口处读码框架正确。结论：为ICA69重组基因的表达及表达产物在临床诊断中的应用奠定了基础。

体外培养人胰岛素瘤细胞的特性

目的分离培养人胰岛素瘤细胞,并研究它的功能特性。方法原代分离人胰岛素瘤细胞,经多次筛选培养进行纯化。通过荧光显微镜观察细胞特有的自发荧光;RT-PCR方法检测胰岛素mRNA的表达和胰岛细胞自身抗原IA-2、IAR和ICAp69的表达;应用MTT方法检测抗人IA-2抗体对胰岛素瘤细胞的杀伤。结果分离的人胰岛素瘤细胞经传40代,在悬浮培养条件下可自发聚集成胰岛样结构,并有自发荧光。该细胞表达胰岛素mRNA并合成胰岛素,但明显低于大鼠胰岛素瘤细胞INS-1。该细胞也表达人胰岛细胞自身抗原IA-2、IAR和ICAp69,并且用抗人IA-2抗体与之孵育后可出现抗体剂量依赖性的细胞杀伤。结论此分离培养的人胰岛素瘤细胞表达人胰岛素和人胰岛细胞自身抗原,因此可以作为研究人Ⅰ型糖尿病发病机制的细胞模型。

国人ICA69基因cDNA的克隆及序列分析

目的 :克隆国人胰岛细胞自身抗原69kD蛋白基因(hiICA69)并经序列分析予以确证。方法 :采用聚合酶链式反应技术 ,从中国人胰岛细胞瘤cDNA文库中扩增出hiICA69编码序列cDNA ,将基因片段插入 pSPORT1质粒 ,进一步亚克隆到 pUC18载体中 ,经蓝白斑和限制性酶谱分析得以初步筛选后 ,双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定。结果 :证实了hiICA69基因全长为1449bp、编码483个氨基酸。与Pietropaolo等报道的序列比较 ,仅在编码第139位氨基酸的密码子由CAA→CTA ,即由谷氨酰胺→亮氨酸 ,其余均与文献报道和EMBL核酸数据库提供的序列相同。结论 :这一基因的获得和定征 ,为后续研究打下基础。

Preparation of Recombinant Islet Cell Autoantigen 69 kD Fusion Protein

To get recombinant antigen (Is/et Cell Autoantigen 69)ICA69 which was expressed in Escherichia coli strains (E.coli) by means of the gene engineering technique so that it can be used for early diagnosis of and screening in type Ⅰ diabetes mellitus, the cDNA fragment of human ICA69 was amplified by PCR, and then cloned into pSPORT 1 vector. After DNA sequencing, it was inserted into pGEX-2T between the sites of EcoR Ⅰ and Sma Ⅰ, then recombinant plasmid p2T-ICA69 was constructed and introduced into E.coli. The GST-ICA69 fusion protein was expressed by the induction of IPTG. The recombinant ICA69 proteins were used to detect the antibodies against hICA69 in 100 healthy subjects and type Ⅰ diabetic serum by the use of indirect ELISA. The sequence analysis showed that the amplified fragments contained 1449 bp, encoded 483 amino acids, and had been correctly inserted into pGEX-2T vector. The recombinant proteins expressed in the prokaryotic cells had immunogenicity and could be used to detect antibodies against ICA69 in type Ⅰ diabetic serum. Finally it can be concluded in this paper that the expression products obtained by the method of gene engineering are recombinant ICA69 antigen and may be used to improve the forecast rate and the diagnostic rate of type Ⅰ diabetes in combination with other tests.

人ICA69基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达与应用初探

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达国人胰岛细胞自身抗原69kd蛋白（hICA69)，获得足量的、可供实验研究的ICA69抗原，用于I型糖尿病的早期诊断和联合筛查。方法：用PCR法扩增出编码hICA69的cDNA片段，直接克降到pSPORT1质粒上，经DNA序列测定后，再插入到GST融合蛋白表达载体pGEX-2T的EcoRI和SmaI位点之间，构成重组质粒p25-hICA69,将此质粒导入大肠杆菌，经IPIG诱导后获得GST-hICA69融合蛋白的表达产物，用间接ELISA法检测100例正常人和30例I型糖尿病人血清中抗ICA69抗体。结果：所获PCR产物经序列分析确证为1449bp，编码483个氨基酸，并正确地重组到pGEX-2T表达型质粒中，其在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性，并能应用于I型糖尿病病人血清中抗ICA69抗体的检测。结论：运用基因工程技术获得的表达产物的重组ICA69抗原。这一抗原的获得，将有助于提高I型糖尿病的预报率和确诊率。