穿心莲内酯衍生物抗H2O2诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究

采用蛋白组学方法筛选穿心莲内酯衍生物（AL-1）抗过氧化氢诱导胰岛RIN—mβ细胞凋亡的差异蛋白质分子并探讨其作用分子机制。结果显示：AL-1浓度依赖性地提高H2O2处理的胰RIN-mβ细胞的存活率。经蛋白组学研究分析，成功地鉴定了18个与凋亡、应激等相关的蛋白，包括Prohibitin、Shmt2、RhoGDP-dissociation inhibitor-1、Galectin-1、Cytb5、Hsps等；与对照组（H202）相比，处理组（AL-1＋H2O2）中，有9个表达上调的蛋白和9个表达下调的蛋白。AL-1过调控与细胞凋亡、应激等相关的蛋白发挥其抗H2O2诱导的凋亡作用。

银杏叶提取物对H_2O_2诱导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡的影响

目的:探讨银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,EGb761)对过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)诱导的胰岛RIN-mβ细胞株凋亡的影响。方法:以500μmol/L H2O2作用于胰岛RIN-mβ细胞6 h建立凋亡模型;分别设空白对照组(Control)、阴性对照组(H2O2)、阳性对照组(槲皮素Que 100μmol/L)、EGb 761单用对照组(EGb 761100μmol/L),EGb 761给药组(EGb 761 10、30、100μg/ml);采用MTT检测细胞存活率,Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞形态变化,PI单染色法和Annexin V-PI双染色法流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果:与空白对照组比较,阴性对照组500μmol/L H2O2作用6 h后,细胞存活率明显降低、细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。与阴性对照组相比,EGb 761显著降低H2O2诱导的细胞凋亡(P<0.01),且呈剂量依赖性。结论:过氧化氢可诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡,EGb 761对H2O2诱导的RIN-mβ细胞损伤和凋亡具有明显的保护作用。

肝癌HepG2细胞株胰岛素样生长因子1和表皮生长因子受体基因沉默后放疗增敏及机制

目的：探讨同时沉默胰岛素样生长因子1（IGFl）和表皮生长因子（EGF）二受体基因的抗瘤放疗增敏及机制。方法：分别构建靶向EGFR、IGFlR及两受体的小分子干扰RNA（siRNA-EGFR、siRNA-IGFIR、siRNA-EGFR＆IGFlR），构建与任何基因无同源的阴性对照质粒（siRNA-HK），分别转染48照射肝癌HepG2细胞株。成克隆实验测定细胞存活分数，采用单击多靶模型和线性二次函数模型拟合细胞存活曲线，求出放射生物学参数D0、Dq、N和cc、口、SFa值。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化，细胞周期及相关蛋白、细胞凋亡及相关蛋白采用蛋白印迹。结果：同时沉默EGFR和IGFlR组与对照组及单基因干扰组相比抑制了细胞增殖、诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期G1／S期的进程，bcl-2和cdk2表达明显下调，而p21和bax表达增加。且同时沉默EGFR和IGFlR组和对照组细胞的D。值分别为0．588、2．0704Gy；Dq值分别为0．5625、2．0307Gy；a值分别为0．515、0．0216Gy^-1。；SF2值分别为0．22、0．619。同时沉默EGFR和IGFIR组Do、Dq和SF2值均减小，a值增大。结论：同时沉默EGFR和IGFlR基因具有更有效地干扰肝癌HepG2细胞株增殖、诱导细胞凋亡，其机制可能与bcl-2和cdk2表达下调和p21与bax表达增加有关，结合干扰多个受体分子可能是一种十分有前途的新的肝癌治疗途经。

胰岛素样生长因子1稳定表达CHO细胞株的建立

目的建立稳定的高效表达胰岛素样生长因子1(IGF-1)的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),以便于大量生产纯化IGF-1蛋白。方法采用脂质体将IGF-1的表达载体pSec-IGF-1导入CHO-K1细胞中。转染后用含潮霉素B(hygromycinB)的选择性培养液进行筛选,挑取耐药克隆,收集细胞培养上清,用Westernblot法及ELISA法进行检测,并用免疫组化法对阳性克隆进行分析。结果转染细胞在选择性培养液中生长出多个耐药克隆,Westernblot检测示8个克隆表达上清出现与预计值相符的约7·7kDa的特异性条带;ELISA结果显示有2株表达量在2·0μg/ml以上;免疫组化检测,筛选到的阳性克隆细胞有IGF-1的表达。结论建立了稳定的高效表达IGF-1的CHO细胞株。

Obestatin抑制胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流

目的观察obestatin对胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流的影响。方法应用穿孔全细胞膜片钳技术研究obestatin对培养的胰岛β细胞株INS-1细胞膜L型电压敏感钙通道电流(L-type calcium ion channel current,ICa,L)的影响。结果胰岛β细胞株INS-1细胞钳制膜电位为-20 mV时,分别给予胰岛β细胞株INS-1细胞0nM(对照组)和1、10、100nM obestatin灌流5min后,ICa,L峰值呈浓度依赖性降低,各组为给药前的(97±8)%、(91±7)%、(60±9)%和(45±6)%。其中,10nM和100nM obestatin灌流5 min后ICa,L峰值与对照组相比显著减小(P<0.01,n=5)。胰岛β细胞株INS-1细胞钳制膜电位分别为-30、-20、-10和0mV时,给予10nM obestatin之前,其ICa,L峰值分别为(-5.48±0.69)、(-5.70±0.68)、(-5.58±0.61)和(-3.90±0.44)pA/pF,灌流10nM obestatin 5 min后,ICa,L峰值分别下降至(-3.11±0.68)、(-3.60±0.99)、(-3.26±1.03)和(-2.28±0.71)pA/pF,均明显低于obestatin给药前(P<0.01,n=5)。结论 obestatin可抑制胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流。

人胰岛素原基因转染绵羊成纤维细胞及细胞株的建立

从动物耳皮肤组织采样 ,采用将组织块剪碎后直接贴附于培养瓶底部的方法进行原代培养 ,该方法使原代细胞出现率及可传代率均达到 10 0 %。根据上皮样细胞和成纤维样细胞贴壁紧实程度的不同 ,用 0 .0 5 %的胰蛋白酶-EDTA对其进行消化 ,可将两种不同类型的细胞进行分离和纯化。通过脂质体介导 ,以BLG -hINS(含乳球蛋白调控基因的人胰岛素原基因 )基因作为目的基因、GFP(绿色荧光蛋白 )基因作为标记基因共转染绵羊成纤维细胞 ,经G - 4 18筛选后 ,得到转染细胞。对转染的细胞分别用单细胞显微操作法和有限稀释法进行细胞克隆 ,两种方法均可得到克隆细胞。选形态正常、生长均匀的 5个细胞克隆进行PCR检测 ,结果 5个克隆均转有GFP基因 ,其中两个转有BLG -hINS基因。高代培养细胞、转染细胞和克隆细胞经核型分析后 ,染色体数目均为 2 7对 ,表明绵羊耳的成纤维细胞建立细胞株后 ,可以作为外源基因转染的有效供体细胞。

葡萄糖、胰岛素和尿酸对猪近端肾小管上皮细胞株血红素氧合酶-1的影响

目的观察不同浓度葡萄糖、胰岛素和尿酸的培养条件下猪近端肾小管上皮细胞株(LLC-PK1)血红素氧合酶(HO-1)活性的改变,以探讨代谢相关因素在细胞水平对肾小管上皮细胞的影响。方法以LLC-PK1为研究对象,观察葡萄糖浓度为5、10、22、33 mmol/L,胰岛素浓度为0、10-9、10-8、10-7mol/L,尿酸浓度为0、0.1、0.2、0.4 mmol/L培养48 h条件下,LLC-PK1细胞HO-1活性的改变。结果0.1 mmol/L0、.2 mmol/L和0.4 mmol/L尿酸刺激48 h后,LLC-PK1的HO-1活性增加,并呈剂量依赖关系,而上述浓度的葡萄糖和胰岛素刺激48 h对LLC-PK1的HO-1活性无影响。结论一定浓度的尿酸可使LLC-PK1的HO-1活性升高,提示尿酸在细胞水平对肾小管上皮细胞的氧化应激过程产生影响。

胰岛素对人乳腺癌细胞株化疗增效作用的体外研究

目的：探讨用胰岛素提高癌细胞生长代谢水平及其对化疗敏感性的影响。方法：选用人乳腺癌细胞株（MDA—MB-543）为靶细胞，以胰岛素为细胞生长代谢促进剂，采用MTT比色法，分析细胞活力及细胞代谢。结果：MTT比色分析法发现，胰岛素（4．0～32．0mU／ml，8～18小时）使MDA—MB-543细胞株的细胞总数，细胞活力增加，可增加5-Fu（28．0μg／ml）及阿霉素（O．36μg／ml）的细胞毒作用。结论：初步证实提高癌细胞的生长代谢水平，继之给予化疗，可提高化疗药物的细胞毒作用。

人肺腺癌A549细胞株胰岛素受体与放射敏感性的实验研究

目的研究人肺腺癌A549细胞放射治疗组与对照组的胰岛素受体(IR)的表达,探讨胰岛素受体与放射敏感性的关系。方法将随机分为对照组(0 Gy)和放射治疗组(剂量为2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy、12 Gy 6 MV X线)人肺腺癌A549细胞进行放射治疗,放疗后培养25天后用免疫组化S-P法测定肺腺癌A549细胞株各标本的胰岛素受体表达情况。结果胰岛素受体(IR)主要分布于A549细胞膜上。小剂量(2 Gy、4 Gy)组与对照组(0Gy)胰岛素受体表达强阳性率差异无统计学意义。6 Gy、8 Gy、10 Gy、12 Gy放射治疗组与对照组相比,胰岛素受体强阳性率与对照组差异有统计学意义(P<0.005),其中12 Gy剂量组强阳性率最高。结论胰岛素受体与放射敏感性负相关,ISR强阳性的肿瘤细胞对射线抗拒。胰岛素受体有可能成为预测肺癌放射敏感性的分子标志物。

血管紧张素Ⅱ对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响及其分子机制研究

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响及其相关分子机制。方法:常规培养大鼠胰岛素瘤RIN-m细胞,分为3组:空白对照组、100 nmol·L^(-1)AngⅡ组和氯沙坦预处理组,干预24h,采用RTPCR法检测胰岛素基因表达,流式细胞仪检测2',7'-二氯荧光素(DCF)的平均荧光强度,RT-PCR法检测胰十二指肠同源盒-1(PDX-1)及肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)mRNA表达,Western-blot法检测PDX-1及MafA蛋白表达。结果:100nmol·L^(-1)AngⅡ组与空白组和氯沙坦预处理组间的胰岛素mRNA表达、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、PDX-1、MafA mRNA及蛋白表达均有显著差异(P<0.05),后两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:AngⅡ可能通过氧化应激途径下调β细胞的PDX-1及MafA活性,进而抑制β细胞胰岛素基因表达。氯沙坦预处理可以拮抗AngⅡ对β细胞的氧化应激损伤,从而在胰岛素基因表达方面对β细胞起到保护作用。

氯通道阻断剂对H_2O_2诱导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡的影响

目的观察氯通道阻断剂对H2O2诱导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡的影响,探讨氯通道在RIN-mβ细胞凋亡中的作用。方法采用H2O2诱导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡模型,观察氯通道阻断剂(DIDS、NPPB和NFA)对细胞存活率、形态学变化、凋亡的影响。结果氯通道阻断剂单用时对胰岛RIN-mβ细胞活力无明显影响,但能明显提高H2O2处理的胰岛RIN-mβ细胞的存活率。与模型对照组相比,氯通道阻断剂DIDS、NPPB和NFA对抗组细胞存活率明显增加(P<0.01),细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。结论氯通道阻断剂对H2O2诱导的RIN-mβ细胞损伤和凋亡具有明显的保护作用。

胰岛素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-543生长的增殖作用

目的探讨胰岛素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-543生长的增殖作用。方法将胰岛素直接作用于体外培养的人乳腺癌细胞株(MDA-MB-543),采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期分布。结果胰岛素在1～10 mU/mL浓度范围内和作用时间2～16 h范围内,对MDA-MB-543增殖作用逐步增强,反映增殖活性的S期和G2/M期细胞比例逐渐增多,其中S期细胞比例与对照组比较有显著性差异(均P<0.05或0.01)。结论胰岛素能加快诱导MDA-MB-543细胞进入细胞周期S期增殖,呈剂量和时间依赖关系,但是短暂和可逆的。

稳定表达RFP-GFP-LC3的大鼠胰岛β细胞株的构建

为了简便自噬相关机理药物在胰岛β细胞上的高通量筛选,实验通过慢病毒转染技术,将RFP-GFP-LC3质粒转入大鼠胰岛β细胞株(RIN-m5f),用G418对感染细胞进行筛选,激光共聚焦进行活细胞拍摄验证,得到100%表达RFP-GFP-LC3质粒的细胞株。无血清饥饿处理细胞,结果显示:饥饿组GFP/RFP荧光点比值较对照组下降, P62蛋白表达量以及S6K磷酸化水平降低,加入10μmol/L氯喹部分抑制自噬后, GFP/RFP荧光点比值回升。以上结果表明稳定表达RFP-GFP-LC3的RIN-m5f构建成功,并能够以简单的检测方式准确表达自噬全过程,为自噬在糖尿病药物机理方面的研究奠定了基础。

琼脂糖/聚苯乙烯磺酸微囊化胰β细胞株MIN6体外胰岛素释放反应的研究

本研究应用琼脂糖/聚苯乙烯磺酸(PSSa)微囊化胰β细胞株MIN6作为一种新型人工生物胰岛,采用静态培养胰岛素释放试验和灌流实验,探讨其在体外糖刺激时胰岛素的释放反应.静态培养胰岛素释放试验结果显示,低糖浓度(3.3mmol/L)时胰岛素的分泌释放量为8.824±0.698μU/(100microbeads·h);高糖浓度(16.7mmol/L)刺激时胰岛素的分泌释放量为28.045±4167μU/(100microbeads·h),约为低糖浓度时的3.2倍,有显著性差异(P<0.05).灌流实验结果显示,用16.7mmol/L糖浓度刺激,胰岛素的释放量逐渐增加,约在高糖刺激后50分钟时胰岛素的释放量达到高峰,约为38.66μU/(100microbeads·h);将糖浓度改变为3.3mmol/L,胰岛素的释放量逐渐下降.实验结果表明,琼脂糖/聚苯乙烯磺酸免疫隔离膜微囊化胰β细胞株MIN6作为一种新型人工生物胰岛,具有良好的糖刺激胰岛素释放反应,为进一步进行实验及临床移植的深入研究提供了基本的实验依据.

双益方剂及其有效成分对胰岛素抵抗小鼠胰岛β细胞株胰岛素分泌、增殖、凋亡的影响

目的观察双益方及其有效成分对胰岛素抵抗的小鼠胰岛β细胞株Min6胰岛素分泌水平和细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法培养Min6细胞并分为正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组、双益方组方单味中药组(山茱萸、黄芪、黄连、葛根、桑白皮、佩兰)及双益方有效成分组(1-脱氧野尻霉素、小檗碱、黄芪甲苷、熊果酸、马钱苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素)。正常组加入无酚红培养液正常培养;其余各组加入葡萄糖和棕榈酸制作胰岛素抵抗的Min6细胞模型。二甲双胍组加入100μg/L的二甲双胍。双益方组、山茱萸组、黄芪组、黄连组、葛根组、桑白皮组、佩兰组、葛根素组、1-脱氧野尻霉素组、小檗碱组、黄芪甲苷组、马钱苷组、熊果酸组、毛蕊异黄酮葡萄糖苷组分别加入50、100、200μg/L的相应药物。各组于给药24 h后进行胰岛素分泌实验,检测胰岛素分泌水平。各组分别于给药24、48 h采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。于给药24 h后采用双染法检测正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组的凋亡细胞,计算细胞凋亡率;采用Western blotting法检测细胞中的ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白。结果 IR模型组细胞高糖、低糖刺激下胰岛素分泌水平均低于正常组(P均<0.05)。二甲双胍组、黄芪组、葛根组、双益方组、黄芪甲苷组、山茱萸组、1-脱氧野尻霉素组、葛根素组、小檗碱组胰岛素分泌水平高于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞增殖能力低于正常组(P均<0.05);二甲双胍组、双益方组、黄芪组、黄芪甲苷组、1-脱氧野尻霉素组、山茱萸组细胞增殖能力高于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞凋亡率高于正常组,双益方各组细胞凋亡率均低于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞中MEK1/2、ERK1/2、pERK1/2蛋白相对表达量低于正常组(P均<0.05);二甲双胍组及双益方组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量高于IR模型组(P均<0.05)。结论双益方及其黄芪、葛根、黄芪甲苷、山茱萸、1-脱氧野尻霉素、葛根素、小檗碱等成分可有效提高胰岛素抵抗的Min6细胞的胰岛素分泌水平,促进细胞增殖并抑制其凋亡,作用机制可能与ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表达上调有关。

棕榈酸诱导胰岛素瘤细胞MIN6细胞凋亡

目的探讨蛋白激酶B及其磷酸化在棕榈酸诱导的胰岛素瘤细胞MIN6凋亡中的作用。方法胰岛素瘤细胞MIN6分别在含有不同棕榈酸浓度(0～0.5 mmol/L)的DMEM高糖培养基中孵育,培养基中加或不加PI3K/PKB的阻断剂LY294002;TUNEL法观察凋亡并计数凋亡率;透射电镜观察MIN6细胞超微结构;Western blot检测蛋白激酶B(PKB)及其磷酸化蛋白p-PKB(Ser473)的表达;RT-PCR法检测BAX、BCL-2mRNA的表达。结果MIN6细胞凋亡随着培养基中棕榈酸浓度的增加而增加,LY294002可增强其凋亡程度;棕榈酸抑制MIN6细胞的PKB在473位丝氨酸位点的磷酸化,抑制BCL-2mRNA的表达并促进BAXmRNA的表达。结论棕榈酸可能通过抑制PKB磷酸化的激活而诱导糖尿病时胰岛β细胞的凋亡。

胰岛素样生长因子结合蛋白7基因在胃癌细胞中的表达及甲基化调控

目的研究胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)mRNA在胃癌细胞中的表达及其甲基化调控。方法分别培养胃癌细胞株高分化MKN-28、中分化SGC-7901和AGS、低分化MKN-45以及胃黏膜正常上皮细胞(GES-1)。提取细胞RNA,采用RT-PCR法检测IGFBP7mRNA在各细胞株中的表达。提取细胞基因组DNA,甲基化修饰后采用甲基特异性PCR(MSP)分析其CpG岛甲基化状态。采用不同浓度去甲基化药物5’-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶(5-aza-dc)处理细胞株后,经Real-timePCR定量药物处理前后各细胞株IGFBP7mRNA的相对表达量。结果各肿瘤细胞株中IGFBP7mRNA表达较GES-1降低或消失。MSP检测IGFBP7mRNA表达降低和消失的细胞株均有CpG岛不同程度的甲基化。不同浓度5-aza-dc处理细胞后,IGFBP7mRNA的表达量呈剂量依赖性增高。结论IGFBP7mRNA在胃癌细胞株中低表达或不表达,其表达下调与其CpG岛甲基化有关。5-aza-dc可使IGFBP7mRNA表达降低的胃癌细胞株重新表达IGFBP7mRNA,提示IGFBP7基因CpG岛甲基化可能是IGFBP7在胃癌细胞系中表达缺失的分子机制。

胰岛素对人乳腺癌细胞影响的体外实验研究

目的：探讨胰岛素能否促进人乳腺癌细胞增殖。方法：将胰岛素直接作用于体外培养的人乳腺癌细胞株（MDA—MB-543），运用四氮唑盐，直接细胞计数及流式细胞仪测定等方法观察胰岛素对MDA—MB-543细胞株活力，细胞总数，细胞周期等的影响。结果：胰岛素（0．5～16mu／ml，8．18小时）使MDA—MB-543细胞株活力，细胞总数增加，呈明显的量效关系，流式检测证实胰岛素（7．5mu／ml）使S期细胞增多。结论：在体外，胰岛素可诱导人乳腺癌细胞株MDA—MB-543增殖。