人胰淀素受体和烟碱乙酰胆碱受体在大鼠大脑神经元上的功能偶联作用(英文)

人胰淀素(hAmylin)是由分泌胰岛素的胰岛B细胞释放,作用于靶组织,维持细胞的兴奋性和葡萄糖在体内的稳态。hAmylin分泌异常会引起人类的疾病,特别是阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)。目前对于hAmylin通过激活什么样的受体从而产生脑神经元的神经毒性仍然不清楚。已知烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是引发多种神经性疾病的关键因素。本研究通过记录hAmylin和烟碱对基底前脑神经元的全细胞电流和膜电位的影响,来确定hAmylin受体和烟碱受体两者之间的相互作用。在酶解分离的基底前脑Broca区(diagonal band of Broca,DBB)胆碱能神经元上进行全细胞膜片钳记录,结果显示,hAmylin或烟碱单独应用,均引起剂量(1nmol/L^20μmol/L)依赖性膜电位的去极化和DBB神经元放电频率增加。hAmylin受体拮抗剂AC253,不仅阻断hAmylin的兴奋作用,而且也阻断烟碱对神经元的兴奋作用;同样,使用nAChR竞争性拮抗剂二氢-β-刺桐啶碱(dihydro-β-erythroidine,DHβE),可以阻断烟碱和hAmylin对DBB神经元的兴奋作用。以上结果提示,hAmylin受体和nAChRs受体在DBB神经元可能是功能偶联的,协同影响DBB神经元的兴奋性。

胰淀素受体在大鼠胰岛β细胞中的表达及其参与胰淀素细胞毒作用的研究

目的：鉴定三种胰淀素受体在大鼠胰岛β细胞中的表达，探讨其在人胰淀素对β细胞的毒性作用中的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应，免疫荧光方法检测大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1和正常大鼠胰岛β细胞中胰淀素受体表达。人胰淀素孵育INS-1细胞24 h，实时定量逆转录聚合酶链反应及免疫荧光法检测胰淀素孵育对受体活性修饰蛋白（RAMP）mRNA转录及细胞表面表达的影响。在细胞毒性试验中，首先用胰淀素、胰淀素受体拮抗剂AC253单独或二者联合孵育INS-1细胞24～48 h，再用不同浓度RAMP1抗体与胰淀素联合孵育24 h，检测细胞存活率变化。组间数据比较采用t检验。结果逆转录聚合酶链反应、免疫荧光染色均证实三种胰淀素受体在大鼠胰岛β细胞中的表达。胰淀素孵育24 h使INS-1细胞RAMP2和RAMP3的mRNA分别下降至0.77±0.10（t=2.546，P〈0.05）和0.66±0.09（t=4.559，P〈0.05），而RAMP1的mRNA有轻度升高趋势，升至1.25±0.17（t=-3.084， P〈0.05），并且RAMP1在细胞表面分布增加。细胞毒性实验中，人胰淀素孵育24 h组细胞存活率为70%±13%，较对照组（100%±14%）明显下降（t=4.409，P〈0.05），胰淀素受体拮抗剂AC253与人胰淀素同时作用24 h组细胞存活率为94%±16%，较胰淀素单独孵育24 h组明显升高（t=-3.341，P〈0.05）。但对胰淀素作用48 h诱导的细胞死亡未有明显缓解。RAMP1受体在1∶500和1∶1000稀释度下与人胰淀素同时孵育24 h组的细胞存活率分别为94%±12%和96%±11%，较胰淀素单独作用组也有明显升高（t=-4.904、-5.565，P〈0.05），也可抑制人胰淀素的毒性作用，而同型IgG对人胰淀素作用无影响。结论本研究证实了三种胰淀素受体均在大鼠胰岛β细胞中表达，并发现胰淀素受体尤其是RAMP1蛋白可能参与人胰淀素对β细胞的毒性作用。

胰淀素受体在胰淀素抑制胰岛β细胞功能中的作用

目的分析胰淀素受体在胰淀素抑制胰岛β细胞功能中的作用。方法胰淀素、胰淀素受体拮抗剂AC253单独及联合短时间作用于大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞后,ELISA及RT-PCR检测葡萄糖刺激胰岛素分泌及mRNA转录情况,共聚焦显微镜下观察高糖、磺脲类药物及KCl刺激下细胞内Ca2+浓度的变化,RT-PCR检测胰淀素短时间作用对胰淀素受体成分受体活性修饰蛋白(RAMP)mRNA表达的影响。结果胰淀素短时间孵育高糖刺激下胰岛素分泌由(2.08±0.35)ng/ml降至(0.73±0.24)ng/ml(P<0.01),mRNA转录由(1.00±0.12)降至(0.39±0.09)(P<0.01),加用AC253后胰岛素分泌升至(1.41±0.32)ng/ml,mRNA转录升至(0.62±0.08),与单用胰淀素组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。AC253可缓解胰淀素对高糖刺激下Ca2+升高的抑制作用,Ca2+总体变化水平和峰值由(650.155±4.818)和(1.154±0.011)升至(769.795±4.956)和(1.589±0.013)(P均<0.01),同样AC253也可缓解胰淀素对磺脲类药物及KCl刺激下细胞内Ca2+升高的抑制作用。胰淀素短时间孵育未改变RAMP mRNA的表达。结论胰淀素受体可能参与了胰淀素抑制胰岛β细胞的胰岛素分泌、合成及对细胞内Ca2+浓度的调节。

人胰淀素和烟碱诱导相同离子通道的激活

目的:观察人胰淀素和烟碱对大鼠脑乙酰胆碱能神经元膜上受体通道活动的影响。方法:在急性分离的大鼠基底前脑神经元上,采用细胞贴附式和全细胞膜片钳技术进行检测。结果:人胰淀素或烟碱单独应用可以分别诱导相同通道的激活。烟碱与人胰淀素诱导的37 pS电导单通道电流幅度分别为(-3.6±0.4)和(-3.5±0.3)pA,65 p S电导单通道电流幅度分别为(-6.0±0.2)和(-6.1±0.3)pA,两电导水平的单通道电流比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。在电流钳记录模式,人胰淀素或烟碱单独应用可引起神经元膜电位去极化并诱发动作电位的产生。DHβE完全阻断烟碱和人胰淀素的作用,应用人胰淀素受体拮抗剂AC253也观察到类似的效果。结论:人胰淀素受体和烟碱受体在中枢神经元存在功能性协同作用。

海绵状脑病致病朊蛋白对胆碱能神经元兴奋性和膜受体的影响

目的探讨致病海绵状朊蛋白(PrP)肽段(PrP106-126)对大鼠基底前脑胆碱能神经元兴奋性和膜受体的影响。方法采用全细胞膜片钳技术,记录急性分离的大鼠基底前脑胆碱神经元的动作电位发生频率。用AC253检查朊蛋白作用的细胞膜受体。结果PrP106-126(10nmol/L)对基底前脑胆碱能神经元具有兴奋作用。在电流钳模式下,PrP106-126肽段诱发的动作电位频率增加,由(2.2±1.9)Hz增加到(58.0±18.0)Hz(n=32,P<0.001)。使用胰淀素受体竞争性拮抗剂AC253(10nmol/L),可以阻断PrP106-126的作用。结论PrP106-126对中枢神经元细胞膜兴奋性的影响,是通过胰淀素受体介导的。