线粒体钙单向转运体相关钙超载调控钙调蛋白对雨蛙肽诱导胰腺导管上皮细胞微丝骨架的影响

目的 通过体外细胞研究探讨线粒体钙单向转运体(MCU)相关钙超载通过调控钙调蛋白(CaM)对雨蛙肽诱导的胰腺导管上皮细胞微丝骨架的影响。方法 使用10^(-7)mol/L雨蛙肽及10^(-5)mol/L MCU抑制剂钌红(RR)干预人胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)24 h,将细胞分为:Control组、雨蛙肽组、RR组、雨蛙肽+RR组。Western blot法检测细胞内MCU及CaM蛋白表达,荧光探针法检测细胞内游离Ca^(2+),免疫荧光双标法检测细胞内线粒体Ca^(2+),微丝染色法观察细胞微丝骨架结构。结果 雨蛙肽组与Control组比较,MCU及CaM蛋白表达、细胞质及线粒体内Ca^(2+)含量升高(P<0.05),细胞微丝骨架破坏;雨蛙肽+RR组与雨蛙肽组比较,MCU及CaM蛋白表达、胞质Ca^(2+)及线粒体内Ca^(2+)含量降低(P<0.05),细胞微丝骨架破坏减轻。结论 MCU相关钙超载可能通过激活CaM促进雨蛙肽诱导的胰腺导管上皮细胞微丝骨架的破坏。

通过G418处理离体纯化小鼠胰腺上皮细胞

目的:探索一种能有效去除成纤维细胞,筛选有较强增殖能力上皮细胞的方法。方法:本研究利用成纤维细胞对G418敏感的特性,在成体小鼠胰腺细胞分离后,采用悬浮细胞直接接种到含30μg/mL G418的培养基中,或细胞贴壁生长汇合至50-70%后用30至100μg/mL之间不同浓度G418处理24h、48h或72h两种方案进行上皮细胞的纯化。结果:在直接接种法培养处理中,存活的大部分细胞为成纤维细胞,上皮细胞的生长受到抑制,无法得到纯化的胰腺上皮集落;而在细胞贴壁生长汇合至50-70%后经G418处理,成纤维细胞随着处理浓度的增加死亡率也在逐渐上升,其中50μg/mL G418处理72小时对去除成纤维细胞效果最佳。结论:G418处理能够有效去除成纤维细胞,分离纯化出一群在离体条件下具有强增殖能力、形成大上皮细胞集落的细胞。该分离纯化方法为今后进一步研究成体胰腺干/祖细胞增殖与分化调控机制等问题奠定基础。

氧化应激对胰腺上皮细胞骨架的影响及其机制

目的应用过氧化氢模拟体内氧化应激反应，观察活性氧对三维培养过程中胰腺上皮细胞形态变化及相关信号分子的表达。方法应用Mmigel构建胰腺上皮细胞的三维培养模型，用浓度分别为1或200μmol／L的H2O2处理15min，然后分别于15min、1h和4h后观察细胞形态的变化；上述细胞经过免疫荧光染色后，用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的变化；用酶联免疫吸附试验（EuSA）检测上述细胞核提取物中的核因子（NF）-κB含量变化。结果200μmol／LH H2O2可以在15min后诱导细胞收缩、1h后细胞形态有所恢复，但4h后钏胞收缩更加明坦。免疫荧光染色发现，细胞内微丝和微管结构存H2O2处理后快速消失，但1h后恢复正常结构。4h后，细胞骨架纤维变得模糊并最终解体。1μmol／LH2O2对胰腺上皮细胞的形态和细胞骨架未造成任何影响。随着时间的延长，200μmol/L过氧化氢处理组NnKB的活性逐渐升高，而1μmoL／L过氧化氢处理组NF—κB的活性变化不大。结论氧化应激可以诱导胰腺上皮细胞早期发生可逆性的细胞收缩和细胞骨架去极化现象，并且与NF—κB的活性升高相关。

正常大鼠胰腺上皮细胞来源类胰岛样细胞簇的实验研究

目的 观察大鼠胰腺上皮细胞来源类胰岛样细胞簇的胰岛素分泌功能及移植至糖尿病模型大鼠的效果。方法 将传代培养6个月以上的大鼠胰腺上皮细胞经高糖、10mmol／L尼克酰胺、10μg/L肝细胞生长因子和10μg／L成纤维细胞生长因子分化诱导后，分化成类胰岛样细胞簇，应用双硫腙染色法进行鉴定；应用放射免疫法检测培养液中胰岛素和C肽分泌水平；收集成熟的类胰岛样细胞簇，移植到糖尿病鼠的肾被膜下，检测糖尿病鼠血糖水平。结果诱导后1周，自单层的扁平上皮细胞以出芽的方式生长出三维的类胰岛样细胞簇，双硫腙染色后呈桔红色。随着类胰岛样细胞簇的成熟和数量的增加，培养液中的胰岛素水平逐渐升高，并对高糖刺激有反应性。移植实验表明大鼠胰腺上皮细胞来源的类胰岛样细胞簇移植可以将糖尿病鼠的血糖从（22．43±0．23）mmol／L^-1（28．96±1．52）mmol／L逆转至（9．60±0．34）mmol／L^-1（11．80±0．98）mmol／L之间。结论大鼠胰腺上皮细胞来源的类胰岛样细胞簇具有胰岛素分泌功能，移植后可以逆转糖尿病大鼠的高血糖状态。

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的:建立能够在体外长期培养胰腺导管上皮细胞的方法。方法:成年昆明小鼠,颈椎脱臼法处死,取胰腺组织,以Ⅴ型胶原酶消化,400目滤网过滤,分离胰腺导管上皮细胞,用添加有各种生长因子的DMEM/F12培养基培养,待细胞达到90%以上汇合时以胰酶消化传代。在不同时间点取样,于普通光镜和相差显微镜下观察细胞形态学变化;采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白-19(CK-19)的表达情况;并行双硫腙(DTZ)染色。结果:原代及传代培养的细胞具有上皮样细胞的典型特征,CK-19染色阳性,DTZ染色阴性,可初步鉴定为胰腺导管上皮细胞。结论:所建立的原代和传代培养方法,适宜于小鼠胰腺导管上皮细胞的体外生长。

角质细胞生长因子促进大鼠胰腺导管上皮细胞体外增殖

目的探讨不同浓度的角质细胞生长因子(KGF)对大鼠胰腺导管上皮细胞增殖的影响,寻求最佳浓度。方法免疫细胞化学染色及RT-PCR方法鉴定SD大鼠胰腺导管上皮细胞;不同浓度的KGF刺激胰腺导管上皮细胞增殖,寻求最佳浓度。结果大鼠胰腺导管上皮细胞表达Nestin和CK19,不表达Insulin及Glucagon;不同浓度KGF刺激胰腺导管上皮细胞2 d后,细胞均有不同程度增殖,20μg/L KGF作用2 d时,细胞数为0.35±0.03,显著高于对照组的0.27±0.02(P<0.01)。结论 KGF在本实验的剂量范围内可促进胰腺导管上皮细胞增殖,20μg/L为促进增殖的最佳浓度。

大鼠骨髓间充质干细胞与大鼠胰腺岛管上皮细胞间接共培养向胰岛细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在适当条件下体外分化胰岛素分泌细胞的可能性。方法分离大鼠BMSCs及大鼠胰腺导管上皮细胞分别培养,在大鼠BMSCs培养过程中加入大鼠胰腺导管上皮细胞培养基中的上清部分,双硫腙(DTZ)染色观察诱导后的细胞着色情况,培养7d后进行了反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因的表达情况。结果将BMSCs进行分离和纯化,培养至第4代第6天时细胞形态一致,呈"水草"样排列,大鼠胰腺导管上皮细胞表达CK-19;混合培养基诱导的BMSCsDTZ染色阳性,RT-PCR检测有胰腺-十二指肠同源盒基因(PDX-1)及胰岛素(Ins)表达。结论适当的培养环境下,大鼠BMSCs具有向胰岛素分泌细胞分化的能力。

胰腺上皮细胞可能成为胰岛β细胞再生的新来源

促进β细胞再生,维持功能性β细胞的数量,是治疗糖尿病的根本.胰腺上皮细胞包括β细胞、导管细胞、腺泡细胞及α细胞.研究表明,与多能干细胞相比,这些成体细胞具有更明显的优势,可能通过不同途径重新生成β细胞从而实现β细胞的再生.已分化的β细胞可以被诱导增殖或者退回至祖细胞状态重新分化为β细胞.而在胰腺受损、代谢应激、基因操作等条件下,其他胰腺上皮细胞可能直接转分化为β细胞或者成为内分泌兼性祖细胞再分化为β细胞.

大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导分化

目的探讨上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺(NIC)、肝细胞生长因子(HGF)、葡萄糖(Glu)、角脘蛋白生长因子(KGF)和β细胞素在大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导分化的作用。方法采用健康SD大鼠胰腺导管上皮细胞,分于70个培养孔中,加入含有多种营养因子(不含血清)的PRMI1640培养液中培养。每个孔中6种诱导剂均进行随机组合。在胰岛样细胞团(ICCs)形成前后的不同天数进行细胞计数、电镜观察、胰岛素测定以及免疫细胞化学和荧光分析。结果胰腺导管上皮细胞培养7d后,单个贴壁上皮细胞分裂增殖,呈鹅卵石样细胞片,单层覆盖;加入诱导和促生长因子后,单层覆盖上皮细胞中逐渐产生一定数量类似胰岛样球状细胞团,直径为80～130μm。结论6种促生长和诱导因子中,Glu、NIC、KGF、EGF作用较强;在所设定的浓度范围内,其作用均随着浓度的增加而增强。

角脘蛋白生长因子与胰腺导管上皮细胞的体外增殖

背景:胰腺导管上皮细胞在体内外均能分化为胰岛素分泌细胞,但胰腺导管上皮细胞体外增殖潜能较差,限制了胰岛细胞移植治疗糖尿病的发展。目的:探讨不同质量浓度角脘蛋白生长因子对SD大鼠胰腺导管上皮细胞体外增殖活力的影响,并寻找最佳浓度,从而得到大量增殖的胰腺导管上皮细胞。方法:运用胶原酶逆行灌注法分离大鼠胰腺导管上皮细胞,密度梯度离心法纯化细胞,而后体外扩增,分别通过免疫细胞化学染色及RT-PCR进行鉴定。在培养基中加入不同质量浓度的角脘蛋白生长因子刺激胰腺导管上皮细胞增殖,通过细胞计数及MTT法测定细胞增殖能力。结果与结论:胰腺导管上皮细胞表达CK19蛋白;不同浓度的角脘蛋白生长因子培养基中胰腺导管上皮细胞形态正常,5μg/L角脘蛋白生长因子组比其他浓度组细胞数量少(P<0.01),而10,15与20μg/L角脘蛋白生长因子组的细胞数量相近(P>0.05)。提示不同浓度的角脘蛋白生长因子均可促进大鼠胰腺导管上皮细胞的增殖,10μg/L角脘蛋白生长因子可能是促进大鼠胰腺导管上皮细胞增殖的最佳培养剂量。

体外胰腺导管上皮细胞与胰腺腺体培养对比分析

目的:比较以胰腺导管上皮和腺细胞培养获取胰岛细胞的差别,以探寻获取胰岛细胞的可靠途径。方法:用胶原酶消化法,获取胰腺导管上皮细胞和胰岛细胞,进行体外培养,观察其细胞形态、细胞纯度和胰岛素分泌量,比较两种细胞来源获取胰岛细胞的差异性。结果:在光镜下见胰腺导管上皮细胞组(Ⅱ组)具有较强的增殖能力,能够产生胰岛样细胞团;硫腙(DTZ)染色阳性细胞团纯度记数高于腺体细胞组(Ⅰ组) (87.6 % 73.7% ) ;胰岛素分泌量明显高于后者(2 37.2 3±5 2 .4 1 5 6 6 .0 7±5 5 .6 6 ;16 2 .87±38.17 4 31.2 2±5 7.5 9;10 5 .89±31.4 7 35 9.6 8±6 2 .2 7;P <0 .0 1) ,但组内则无统计学意义的差别(P >0 .0 5 ) ,Ⅰ、Ⅱ组胰岛素分泌量随时间延长而衰减,其第4、6天分泌量分别为第2天的6 8%、4 4 %和75 %、6 3%。结论:胰腺导管上皮细胞具有较强的转分化为胰岛细胞的能力,在胰岛细胞培养取材过程中,不能忽视或丢弃,它可能是可转分化为胰岛细胞的胰腺干细胞之一。

昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞向胰岛样细胞的诱导分化

目的研究正常昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞向胰岛样细胞分化的诱导条件。方法取正常成年昆明小鼠胰腺导管上皮进行原代培养,利用细胞贴壁时间的差异在培养24、48、72 h连续换液除去腺体细胞,在含2%胎牛血清的培养条件下除去成纤维细胞,使可以在无血清培养基中生长的胰腺导管上皮样细胞形成优势生长。在此条件下培养并传代。取第三代细胞以无血清诱导培养基促使其分化。取诱导后3、5、7、14 d的细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。ELISA检测诱导生成的胰岛样细胞在高糖刺激下分泌胰岛素的功能。结果经过无血清诱导培养基诱导7 d后,胰腺导管上皮样细胞开始向胰岛素分泌细胞分化,胰岛素抗体染色阳性。14 d胰岛素抗体染色阳性细胞明显增多。该细胞在高糖刺激下可以分泌胰岛素。结论昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞经过无血清培养基诱导可以向胰岛样细胞方向分化。并且该胰岛样细胞在高糖刺激下具有分泌胰岛素的功能。

氧化应激对人胰腺导管上皮细胞增殖的影响

目的探讨氧化应激对人胰腺导管上皮细胞增殖的影响。方法不同浓度过氧化氢(H2O2)作用于人胰腺导管上皮细胞6～48 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞光密度(OD),绘制细胞生长曲线,计算细胞存活率;采用碘化丙啶(PI)单染色法检测细胞周期,计算细胞增殖指数(proliferation index,PI’)。结果细胞处理6 h,H2O2300μmol/L组存活率下降[(79.10±9.21)%vs.(100.00±14.84)%,P<0.05]。12 h H2O2300μmol/L组OD值降低(0.277±0.022 vs.0.309±0.015;P<0.05),存活率明显下降[(56.90±29.91)%vs.(100.00±20.91)%,P<0.01]。24h H2O2100、200、300μmol/L组OD值明显降低(0.493±0.011,0.434±0.029,0.373±0.014 vs.0.529±0.011;P<0.01),存活率明显下降[(87.95±3.73)%,(67.61±9.87)%,(46.84±4.76)%vs.(100.00±3.85)%;P<0.01],PI’明显降低[(25.50±1.81)%,(25.20±1.80)%,(21.11±1.78)%vs.(32.20±2.33)%;P<0.01]。48 h H2O225μmol/L组OD值明显升高(0.683±0.014 vs.0.587±0.024,P<0.01),存活率明显升高[(127.39±3.99)%vs.(100.00±6.72)%;P<0.01],H2O225、50μmol/L组PI’明显升高[(44.20±4.75)%,(40.50±2.67)%vs.(35.40±1.25)%;P<0.01];而H2O2100、200、300μmol/L组OD值明显降低(0.533±0.011,0.440±0.018,0.376±0.003 vs.0.587±0.024;P<0.01),存活率明显下降[(84.74±3.08)%,(58.20±5.10)%,(39.87±0.71)%vs.(100.00±6.72)%;P<0.01],PI’明显降低[(24.30±1.83)%,(21.97±1.82)%,(16.94±3.55)%vs.(35.40±1.25)%;P<0.01]。结论低浓度H2O2显著促进人胰腺导管上皮细胞增殖,呈时效及量效关系;反之,高浓度H2O2抑制细胞增殖。

Bmi-1基因诱导人胰腺导管上皮细胞恶性转化

目的探讨原癌基因B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(Bmi-1)过表达对人正常胰腺上皮细胞株h TERT-HPNE恶性转化的影响。方法采用逆转录病毒介导转染方法将携带原癌基因Bmi-1的质粒或空质粒稳定转染h TERT-HPNE,通过Real-time PCR及Western blot在m RNA及蛋白水平鉴定转染效果。采用MTS法、Traswell小室法、软琼脂克隆形成试验检测稳定转染Bmi-1对h TERT-HPNE细胞增殖、迁移、侵袭和软琼脂克隆形成能力的影响。结果 Real-time PCR及Western blot结果均表明成功建立稳定转染Bmi-1基因的h TERT-HPNE细胞株。过表达Bmi-1基因使h TERT-HPNE细胞增殖、迁移、侵袭和软琼脂克隆形成能力明显增高。结论在细胞水平过表达Bmi-1基因恶性转化h TERT-HPNE细胞。

SD大鼠胰腺导管上皮细胞培养技术的研究

目的分离纯化SD大鼠胰腺导管上皮细胞,为将其转分化为胰岛细胞提供细胞来源。方法用酶消化法培养SD大鼠胰腺导管上皮细胞,观察细胞增殖动态,用CK-19进行免疫组化鉴定。结果胰腺导管上皮细胞可在体外有效扩增,有效去除成纤维细胞是扩增的关键。结论低血清培养和反复贴壁法可获得较纯的胰腺导管上皮细胞。

大鼠胰腺导管上皮细胞及转分化胰岛样细胞免疫学特性研究

目的:通过对大鼠胰腺导管上皮细胞、转分化的胰岛样细胞与天然胰岛细胞进行免疫原性比较,了解胰腺导管上皮细胞及转分化胰岛样细胞的免疫学特性。方法:大鼠胰腺导管上皮细胞,转分化胰岛样细胞和天然胰岛在体外与淋巴细胞共培养,检测淋巴细胞MHCⅠ、MHCⅡ抗原决定簇,IFN-γ和IL-2、IL-4水平。将三组细胞分别植入到大鼠糖尿病模型皮下,流式细胞技术检测外周血MHCⅠ、MHCⅡ表达、ELISA检测IL-2、IL-4水平和机体对其反应的病理学变化。结果:三组细胞与淋巴细胞共培养,MHCⅠ的表达未见明显差异(P<0.05),MHCⅡ的表达胰岛样细胞(29.5%±3.1%)和天然胰岛细胞(32.6%±3.6%)较胰腺导管上皮细胞(10.8%±0.9%)明显升高(P<0.05)。淋巴细胞分泌IL-2水平和Elispot检测分泌IFN-γ的细胞数,胰腺导管上皮细胞较胰岛样细胞和天然胰岛细胞组显著性降低(P<0.01)。植入糖尿病大鼠模型的外周血IL-2水平和淋巴细胞MHCⅡ表达均随着植入时间逐渐升高,胰岛样细胞和天然胰岛细胞组较胰腺导管上皮细胞组升高明显,IL-4水平在三组细胞无明显差异。病理结果显示胰腺导管上皮细胞组淋巴细胞浸润较胰岛样细胞和天然胰岛细胞组为轻。结论:胰腺导管上皮细胞具有低免疫原性,转分化的胰岛样细胞免疫原性近似天然胰岛。

Smad4静默对K-ras突变小鼠胰腺PanIN细胞增殖及转移能力的影响

背景与目的:由己建立的小鼠基因打靶模型证实,K-ras突变启动了胰腺癌前病变—胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN),p53、p16失活均可单独促进小鼠PanIN发展为浸润性胰腺癌。作为人胰腺癌中另一失活频率高发的抑癌基因Smad4,本课题组前期研究提示,应用RNA干扰技术沉默PanIN细胞株中内源性Smad4表达,促使PanIN细胞恶性转化。基于此目的,本研究进一步探讨siRNA干扰Smad 4基因对PanIN细胞体内外增殖及转移能力的影响,从而有助于阐明PanIN恶性转化的新机制。方法:构建和筛选能特异性静默PanIN细胞中Smad4表达的最佳siRNA稳定表达质粒,稳定转染最佳siRNA表达质粒进入PanIN细胞,用Zeocin筛选稳定转染克隆,挑选阳性克隆、扩增,稳定转染后细胞命名为PanIN-S。本研究运用细胞计数、克隆形成实验等分别比较两组在活细胞率和体外增殖能力的影响,同时为进一步验证Smad 4基因静默对PanIN细胞体外迁移、侵袭能力的影响,本研究采用Transwell和Mitigel assay检测其干扰前后体外运动、侵袭能力。动物实验中,建立PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型,并应用免疫组化方法检测并比较两组PCNA、VEGF和MMP-9的表达及其差异。结果:成功构建了Smad4基因siRNA体系;体外实验中与PanIN组相比,PanIN-S组细胞增殖、侵袭能力明显增强,差异有统计学意义(P<0.05);动物模型免疫组化结果显示,与PanIN组相比,PanIN-S组PCNA、VEGF和MMP-9表达显著增高(P<0.05)。结论:K-ras突变基础上小鼠PanIN细胞Smad4基因静默促使PanIN细胞的恶性转化;PanIN基础上Smad4静默促使小鼠PanIN细胞体内外增殖及转移能力的增强,其增殖及转移可能与PCNA、VEGF和MMP-9高表达有关。

胰腺发育相关maf基因在胰腺导管和胰岛的表达

为探讨胰岛功能和发育相关maf基因在胰腺导管上皮中的表达情况,对新鲜小鼠胰腺组织切片进行显微切割,分离纯化胰腺组织中的导管和胰岛,以及外分泌腺组织细胞作为对照,利用荧光实时定量PCR的方法完成对目的基因的相对定量.结果显示,mafamRNA,mafbmRNA水平在胰岛及导管中非常接近,无统计学差异.而c-maf在导管的表达高于胰岛(P<0.05),外分泌腺则无上述基因的表达.胰腺导管中mafa,mafb,cmaf均有表达,肯定了导管上皮细胞向内分泌细胞分化的潜能,而c-maf在导管中的表达高于胰岛,提示导管上皮c-maf的下调可能有助于导管上皮细胞向内分泌细胞的分化成熟.

胰腺导管系统对内分泌的功能影响及其可能机制

胰腺的内、外分泌系统在形态学和功能上存在密切联系。胰腺导管腔内的成分可能作用于一些直接开口于管腔的内分泌细胞,并通过内分泌细胞之间的缝隙连接,最终对更大量的内分泌细胞产生特殊的刺激。胰腺导管上皮细胞主要分泌富含碳酸氢钠(NaHCO3)的胰液,故胰液中NaHCO3可能对内分泌胰岛产生功能影响。研究表明囊性纤维化跨膜转导因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)在胰腺导管上皮细胞大量表达,对分泌碳酸氢根(HCO3-)至关重要;但CFTR是否在内分泌胰岛表达仍有争议,在内分泌胰岛的作用更是鲜有研究。深入研究胰腺导管系统对内分泌胰腺功能上的影响及其机制,对糖尿病的防治及新药的开发具有积极意义。

体外诱导细胞转化为胰岛细胞的研究进展

巢素蛋白(nestin)阳性细胞、成体干细胞(包括间充质干细胞和胰腺导管上皮细胞)和胚胎干细胞是常用的体外诱导转化为胰岛细胞的种子细胞,本文就这三类细胞的来源、实验方法及实验结果的研究进展进行综述。