无胰蛋白酶抑制剂大豆新品种中豆28号的选育及栽培技术研究

中豆２８号是采用未变性聚丙烯酞胺凝胶电泳（Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ）技术，对杂种后代胰蛋白酶抑制剂缺失检测进行多年辅助选择育成。其突出特点是早熟、高产、稳产、优质、抗病、综合性状优异。

家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分布

家蚕Bombyxmori的胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsininhibitor,CI)在家蚕发育过程中发挥着重要作用,具有丰富的多态性。为了进一步研究家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂在群体水平上的多态性分布,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,调查了425个家蚕品系的血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的分布情况。结果表明,基因IctA、IctD和IctE在所有家蚕品系中存在,暗示它们是家蚕正常生长发育必需的基因;相反,至少在9个家蚕品系中发现基因IctB和IctH都没有表达,而这些品系没有明显的生理缺陷。在中国品系和日本品系家蚕之间,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布规律基本一致。对52个纯品系家蚕的胰凝乳蛋白酶抑制剂分布进行的聚类分析结果表明,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布与其系统、眠性和化性都没有明显的相关性。所以家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂广泛存在于不同家蚕品系中,同时多态性的分布特征也表明其生理功能在进化过程中发生了明显的分化。

家蚕不同品种与个体的血液胰凝乳蛋白酶抑制剂差异研究

胰凝乳蛋白酶抑制剂 (Chymotrypsininhibitor,CI)是家蚕血液中主要的蛋白酶抑制因子 ,为其正常生长发育所不可缺少 ,研究CI对阐明家蚕正常生理以及害虫防治等都具有重要意义。采用pH 8 3、4 0聚丙烯酰胺凝胶电泳和CI活性染色法 ,对 6个家蚕品种血液中的蛋白质含量和CI活性进行了测定 ,并对各品种CI活性的个体差异性进行了分析。结果表明 :结合pH 8 3和pH 4 0的电泳条件 ,可检测出Ict D ,Ict E ,Ict A ,Ict B ,Ict H基因所支配的 15种CI;6个品种中有 3个具有CI个体差异性 ,而且Ict E和Ict B在有的品种或个体无活性 。

胰凝乳蛋白酶抑制剂在蓖麻蚕主要组织中的分布及血液中的含量和活性

【目的】蓖麻蚕Samia cynthia ricini属于鳞翅目昆虫,其体内存在的胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)对蓖麻蚕的正常生长发育和自身防御能力有重要的作用。获得蓖麻蚕的CI种类分布信息,以及研究各种CI的功能,可以为鳞翅目害虫的生物防治提供理论依据。【方法】本实验通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)和CI活性染色技术,对18个蓖麻蚕品系的主要组织器官中胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分布进行了调查,并对各品系血液中的蛋白含量和CI活性进行了测定。【结果】在p H 8.6电泳下,各品系血液中共检测到7条CI活性带,在p H4.0电泳下,各品系血液中可检测到3条CI活性带;血液中的CI含量从5龄第3天幼虫期到化蛹当天一直维持着很高的含量;头、体壁和脂肪体中的CI都不如血液中的CI含量高,而丝腺中未检测到任何CI。【结论】与家蚕Bombyx mori血液中的含量相比,蓖麻蚕血液中的CI含量更高,CI种类多态性分布不仅体现在不同品系的同一组织,还体现在同一品系的不同组织。

家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂基因SCI-SB的原核表达、纯化及活性检测

为进一步研究家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂基因SCI-SB的功能和作用机理,利用RT-PCR技术,从家蚕总RNA中扩增到家蚕SCI-SB基因片段,构建了含有GST标签的融合表达质粒pGEX4T-1-SCI-SB。采用pGEX融合蛋白表达系统,在大肠杆菌BL21中得到以包涵体形式存在的重组GST融合蛋白质,表达量可占菌体蛋白的15%。将包涵体变性、复性处理以后,进一步利用GSTTrapFF亲合层析一步获得了重组蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰纯种大白兔,获得效价高的多克隆抗体。胰凝乳蛋白酶活性抑制实验结果表明该重组蛋白具有一定的酶活抑制作用。

家蚕血液中胰凝乳蛋白酶抑制剂研究——品种间的多态型

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和胰凝乳蛋白酶抑制剂 (CI)活性染色 ,对 9个家蚕品种血液中CI种类的分布进行了调查。结果 :在碱性电泳条件下可检测出 12种以上的CI,品种间CI分布存在多态型 ,根据结果筛选出作为分离纯化家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的理想品种材料。

蓖麻蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调查

胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)为昆虫体内重要的调控因子,是昆虫体内免疫系统的重要组成部分。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色方法,对20个蓖麻蚕品种血液CI的种类进行了调查。在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测到7种CI,定名为E-CI1、E-CI2、E-CI3、E-CI4、E-CI5、E-CI6、E-CI7;在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测到2种CI,定名为E-CIa、E-CIb。对同一蓖麻蚕品种不同发育时期血液CI的调查显示,CI 5的活性有随5龄期经过而递增的趋势。

剪叶及昆虫取食对兴安落叶松蛋白酶抑制剂的影响

植物蛋白酶抑制剂是植物重要的防御物质之一。为了研究不同程度剪叶及昆虫取食诱导与兴安落叶松Larixgmelinii针叶内蛋白酶抑制剂活性变化的关系,分别以剪叶及落叶松毛虫Dendrolimus superans取食处理兴安落叶松幼苗,用紫外分光光度法测定不同处理后针叶内胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)活性变化。结果表明:落叶松毛虫取食及剪叶可诱导兴安落叶松产生系统性防御反应,处理后的1～20天,苗木针叶内TI和CI两种抑制剂活性产生显著变化,诱导产生的TI和CI的活性与损伤程度无显著相关性。相同损伤程度下,虫害诱导的TI活性高于剪叶损伤诱导的活性,但二者差异不显著;3种取食程度诱导的CI活性,只在第5天同时显著高于剪叶损伤诱导的抑制剂的活性。由此可见,可以通过适当的损伤处理取得与昆虫取食相似的植物抗性反应,这为林木病虫防治提供了新的思路。

机械损伤和茉莉酸甲酯对烟株蛋白酶抑制剂的诱导作用研究

为了进一步研究蛋白酶抑制剂对昆虫生长发育的影响,选取机械损伤和茉莉酸甲酯作为信号路径的激发子,研究了它们在不同条件下诱导烟株局部和系统性的胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂的表达。结果显示:机械损伤或茉莉酸甲酯处理后,烟株处理叶和系统叶中胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂含量都有不同程度升高;施用2.4mmol/L茉莉酸甲酯时两者的增加量最为显著;机械损伤能明显抑制2.4mmol/L茉莉酸甲酯的诱导作用,对1.2mmol/L茉莉酸甲酯具有协同作用。

棉铃虫部分组织中蛋白酶抑制剂的调查与分析

蛋白酶抑制剂在鳞翅目昆虫的生长、发育以及免疫过程中发挥了重要作用.该文采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-polyacrylamide gel electrophoresis Native-PAGE）结合胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymotrypsin inhibitor,CI）和胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor,TI）活性染色的方法,调查了棉铃虫部分组织中胰凝乳蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂的分布情况.结果表明：在碱性非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下,血液中可检测到5条CI活性带,分别命名为H-CI1~H-CI5.同样能检测到几条迁移率很近且难以分开的TI活性带,而在头、丝腺、脂肪体、体壁、中肠和生殖腺等组织器官中没有检测到CI和TI活性带.在酸性非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下,血液中检测到一条CI活性带,命名为H-CIb1;两条TI活性带,命名为H-TI1和H-TI2.其他组织与碱性电泳的结果一致,未检测到CI和TI的存在.

6个山黧豆品种的β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性及其关系分析

山黧豆(Lathyrus spp.)种质资源评价与筛选长期聚焦于获得低β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionicacid,β-ODAP)含量或低蛋白酶抑制剂活性的品种。为了研究β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性之间的潜在关系,该研究利用SDS-PAGE、酶活检测和相关性分析等方法对家山黧豆(L.sativus)、扁荚山黧豆(L.cicera)等6个山黧豆品种的蛋白酶抑制剂活性、β-ODAP含量及二者之间的关系进行了分析。结果表明:(1)不同山黧豆品种的醇溶蛋白和可溶蛋白电泳图谱呈现出显著的差异。(2)不同山黧豆种子的胰蛋白酶抑制剂活性介于100~190 TIU之间,胰凝乳蛋白酶抑制剂活性介于5~9 CIU之间。(3)β-ODAP含量与丝氨酸乙酰基转移酶活性的皮尔逊相关系数可达0.76,呈显著正相关关系。(4)山黧豆转录组数据(SRP145030)中的β-ODAP生物合成关键基因与Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(Bowman-Birk inhibitor, BBi)基因表达水平呈显著负相关关系。该研究结果为进一步探讨分析山黧豆β-ODAP和BBi生物合成的调控与平衡,改善山黧豆的含硫氨基酸水平等奠定了基础。

马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂活力的测定

胰凝乳蛋白酶抑制剂的活力测定对于马铃薯块茎蛋白研究非常重要,特别是对于马铃薯蛋白的分离纯化,本文将会详细阐述马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂的活力测定方法。本文所描述的方法是以酪蛋白为底物,在275 nm检测波长下采用分光光度法,在存在和不存在抑制剂的情况下,用一定量胰凝乳蛋白酶水解酪蛋白,测定酪蛋白分解产物的生成量。检测结果表明,从马铃薯块茎中提取的粗蛋白溶液其胰凝乳蛋白酶抑制剂活力为98.31 CUI/mg,按另外一种表达方式为82.11μg/mg,即每毫克胰凝乳蛋白酶抑制剂能抑制82.11μg胰凝乳蛋白酶。理论上,每100 g马铃薯块茎所含的胰凝乳蛋白酶抑制剂能抑制147.43 mg胰凝乳蛋白酶的活力。该方法不仅适用于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂的活力测定,对其他所有来源的胰凝乳蛋白酶抑制剂活力测定同样适用。

南美斑潜蝇为害对黄瓜叶片中蛋白酶抑制剂活性及葫芦素B含量的影响

【目的】蛋白酶抑制剂和葫芦素是两类在植物中具有抗虫活性的化合物，在植食性昆虫与其寄主植物相互作用中起着重要的作用。本文在室内研究了南美斑潜蝇Liriomyzahuidobrensis（Blanchard）为害对黄瓜叶片中蛋白酶抑制剂活性及葫芦素B含量的影响，以期揭示南美斑潜蝇与其寄主植物相互作用的机理以及为利用诱导抗性控制南美斑潜蝇的为害奠定必要的基础。【方法】用分光光度法和高效液相色谱法，分别测定了南美斑潜蝇幼虫为害后黄瓜叶片中蛋白酶抑制剂活性和葫芦素B含量的变化。【结果】在南美斑潜蝇幼虫为害期间（1-9d），黄瓜叶片中胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性及葫芦素B含量与健康对照相比显著上升，但上升幅度并不与为害强度和为害持续时间相一致，其中对胰蛋白酶抑制剂具有系统诱导作用，而对胰凝乳蛋白酶抑制剂和葫芦素B的系统诱导作用不明显。【结论】南美斑潜蝇幼虫为害可诱导寄主植物体内蛋白酶抑制剂活性和葫芦素B含量上升，培育蛋白酶抑制剂或葫芦素含量高或易诱导的黄瓜品种可能是控制南美斑潜蝇为害的有效途径。

一个新的家蚕kunitz类型CI基因的克隆和序列分析

家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)的多个编码基因位于多个染色体位点上,是家蚕CI具有丰富多态性的原因之一。根据Gene Bank中登录的家蚕CI基因Sci-sb的mRNA,设计引物克隆了一个家蚕kunitz类型的CI基因,命名为CI-fb。CI-fb基因有3个外显子,开放阅读框长度为255 bp,编码85个氨基酸残基,具有一个典型的kunitz结构域。CI-fb基因与其他已知的kunitz类型的CI基因相比,在基因序列和结构、蛋白序列和结构上高度相似,但在已知的CI基因家族中序列最短。RT-PCR分析表明,CI-fb基因在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、气管和中肠6个组织中表达,而在丝腺、血细胞和体壁中没有表达,是一个组织特异性表达的基因。研究结果为进一步研究家蚕CI的多态性和功能提供了新的线索。

家蚕CIb1基因启动子活性分析

用PCR方法从家蚕基因组DNA扩增了家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂b1基因(CIb1)4个不同长度的启动子片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在脂质体介导下转染家蚕BmN细胞,体外分析了该基因启动子的活性。结果表明,家蚕CIb1基因启动子在BmN细胞中有微弱的转录活性；野生型BmNPV感染能增强启动子活性；hr3增强的不同长度CIb1基因启动子片段的活性有显著差异,提示转录起始位点上游-74～-1nt包含了启动子的基本元件,而在-687～-465nt、-465～-317nt和-317～-74nt存在着主要的顺式元件。试验结果有助于阐明CIb1的表达调控机理和对家蚕天然性免疫的理解。

朱砂叶螨刺吸胁迫对玉米自交系化学防御物质的系统诱导效应

为了探明朱砂叶螨刺吸胁迫对玉米体内化学防御的系统诱导效应,以玉米抗螨性自交系‘H1014168’和感螨性自交系‘H1014591’幼苗为材料,在叶螨刺吸第1叶7 d后,测定了未被刺吸部位(第2叶和根系内)的丁布、总酚、胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)含量.结果表明:H1014168第2叶和根内的丁布、总酚、TI和CI含量均显著高于健康植株;H1014591第2叶内4种化学防御物质含量显著高于健康植株,根内TI含量显著高于健康植株,丁布和CI含量与健康植株差异不显著,总酚含量显著低于健康植株.朱砂叶螨刺吸胁迫对玉米体内的丁布、总酚、胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂的诱导具有系统性,对玉米抗螨性自交系的系统诱导效应强于感螨性自交系.