草鱼丝氨酸蛋白粗酶的提取、酶学特性及大豆胰蛋白酶抑制剂对其活性的影响

【目的】探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)粗酶的提取方法、酶学特性,以及大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对草鱼鱼糜凝胶品质的影响,为改善传统草鱼鱼糜制品品质提供理论基础。【方法】从草鱼背肌中提取MBSP粗酶液,探究提取过程中漂洗次数(1~5次)、热处理温度(35、40、45、50、55℃)、酸洗脱pH值(pH 4.0、pH 5.5)对提取液酶活性的影响,获得最佳提取条件;设置梯度实验探究所得酶的最适温度、pH、稳定性等酶学特性,最后探究大豆胰蛋白酶抑制剂对粗酶酶活性的影响及其对草鱼鱼糜凝胶性能的调控。【结果及结论】经3次漂洗、45℃热处理、pH 4.0酸洗脱后得到的草鱼MBSP粗酶液酶活性最高(P<0.05);所得MBSP最适pH值在9.0附近,最适温度为45℃,具有较好的温度稳定性(P<0.05),其活性可被Na^(+)在一定程度上抑制且被K+、Ca^(2+)激活(P<0.05);STI添加可以显著改善草鱼鱼糜质构,其对草鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶有可逆竞争性抑制作用,半抑制质量浓度为10.85μg/mL,抑制常数Ki=0.24μmol/L。

尿胰蛋白酶抑制剂分离纯化研究进展

尿胰蛋白酶抑制剂(Urinary Trypsin Inhibitor,UTI)是从人类尿液中分离纯化得到的一种具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的硫酸软骨素蛋白聚糖,其对胰蛋白酶、透明质酸酶、粒细胞弹性蛋白酶、纤溶酶等蛋白酶均具有良好抑制作用,被广泛用于临床治疗急性胰腺炎和作为急性循环衰竭的抢救辅助用药。本文主要综述了尿胰蛋白酶抑制剂的来源、结构、生理功能、传统分离纯化工艺以及基因工程技术生产新方法等,旨在为尿胰蛋白酶抑制剂的高质量生产以及应用提供参考。

大豆胰蛋白酶抑制剂对肉鸡生长和肠道健康的影响

近年来,随着我国畜禽养殖业向“限抗”“禁抗”“替抗”的转变,肉鸡的肠道因失去抗生素的保护而变得非常脆弱,肠道健康问题成为当前肉鸡养殖户关注的热点问题。豆粕作为肉鸡饲粮中主要的蛋白质来源,豆粕中同样含有抗营养因子—大豆胰蛋白酶抑制剂,可损害肉鸡肠道健康。因此,通过总结胰蛋白酶抑制剂的概念及其对肉鸡生长和肠道健康的影响,以期为合理利用豆粕及改善肉鸡肠道健康提供参考。

大豆胰蛋白酶抑制剂对家禽生长和肠道健康的影响

随着家禽养殖业的快速发展,饲料中常添加大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitors,SBTI)以提高家禽的生产效率。然而,大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)在促进家禽生长的同时,也可能对其肠道健康产生不利影响。本文分析了大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)的来源及作用机理,并系统评估了其对家禽生长性能和肠道健康的影响,提出了一套安全使用策略。

钠-葡萄糖协同转运蛋白-2抑制剂心肾保护作用机制的网络药理学研究

目的基于网络药理学研究钠-葡萄糖协同转运蛋白-2抑制剂(SGLT-2i)心肾保护的作用机制。方法通过相关数据库搜索SGLT-2i与疾病相关的靶点,应用STRING 11.5数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,使用CytoHubba插件得到关键靶点,利用Metascape数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,利用CB-Dock平台进行分子对接。结果共预测SGLT-2i靶点450个,获得疾病靶点1221个,交集靶点54个,关键靶点为丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生长因子受体(EGFR)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)等。KEGG结果显示,关键通路可能是糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物-糖基化终产物受体信号通路、酪氨酸蛋白激酶-信号转导和转录激活因子信号通路等。分子对接显示,SGLT-2i与关键靶点结合能力较好。结论本研究初步推测了SGLT-2i多靶点、多通路的心肾保护作用机制,这为该类药物心肾保护机制提供了新的认识。

Mobocertinib治疗非小细胞肺癌的药理学研究

肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一,包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌两种病理类型,其中,对于部分晚期非小细胞肺癌患者存在有意义的突变靶点,可首选靶向药物治疗。EGFR20号外显子插入(exon 20 insertion,ex20ins)突变是非小细胞肺癌罕见突变,通常对现有的靶向药物耐药,目前缺乏有效的靶向治疗药物。Mobocertinib是一种靶向EGFR ex20ins的新型小分子口服药物,2021年9月15日经美国FDA批准上市用于具有EGFR ex20ins突变的局部晚期或转移性NSCLC成年患者的治疗。本文对该药物的作用机制、药物效应动力学、药物代谢动力学、临床疗效及安全性等方面进行综述总结,为临床使用该药提供一定的参考。

基于网络药理学与体外实验探讨淫羊藿素抗非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药的分子机制

目的基于网络药理学与体外实验探讨淫羊藿素抗非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体-酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKIs)耐药的分子机制。方法利用PubChem和化合物靶点预测(Swiss Target Prediction)数据库下载淫羊藿素的简化分子线性输入规范(SMILES)号及作用靶点,通过人类基因(GeneCards)和在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库收集NSCLC耐药疾病靶点,将药物与疾病交集靶点导入STRING数据库分析蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)情况,运用Cytoscape 3.9.1软件内置插件计算节点拓扑参数值并筛选核心靶点,采用生物信息学分析平台(DAVID)数据库进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因本体(GO)富集分析,构建“淫羊藿素-关键靶点-疾病-通路”图。使用Pymol和Autodock Tools 1.5.7软件进行分子对接。体外实验选用NSCLC耐药株PC9OR研究淫羊藿素对细胞增殖、集落形成、迁移、侵袭和凋亡能力的影响,并对富集得到的核心靶点及关键通路进行验证。结果共筛选到淫羊藿素治疗NSCLC耐药的潜在作用靶点1952个。通过PPI网络节点拓扑参数值筛选得到13个核心靶点,涉及蛋白激酶B(AKT1)、雌激素受体α(ESR1)、B淋巴细胞瘤2(BCL2)、表皮生长因子受体(EGFR)等基因。KEGG通路富集分析显示,癌症相关通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路、EGFR-TKIs耐药通路等可能在淫羊藿素治疗NSCLC EGFR-TKIs耐药的过程中起关键作用。GO富集分析显示,细胞功能涉及信号传导、凋亡过程的负调控、DNA转录的正调控等。分子对接显示淫羊藿素与各核心靶点均具有较强的结合能力。细胞实验表明,淫羊藿素抑制耐药细胞的增殖、集落形成、迁移、侵袭及促进细胞凋亡,并下调ESR1、AKT1、EGFR等mRNA表达水平以及PI3K-AKT通路磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的关键蛋白水平。结论淫羊藿素可能通过多靶点调控PI3K-AKT通路抑制EGFR-TKIs耐药细胞的增殖、集落形成、迁移、侵袭及促进细胞凋亡,从而发挥抗NSCLC EGFR-TKIs耐药的作用。

转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫甘蓝植株的获得

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)栽培品种“京丰”和“迎春”,并分别获得了转基因再生植株。对NPTⅡ的ELISA检测表明,标记基因NPTⅡ已在再生植株中得到有效表达。对转化植株进行Southern blot分子杂交实验进一步证明CpTI基因已整合到甘蓝的基因组。实验室内的叶片离体饲虫及盆栽饲虫试验表明,转基因甘蓝对菜青虫具有一定抗性。实验中还观察到,采用愈伤组织分化途径可以获得较高的转化频率,但嵌合体较多;而直接分芽的途径转化率低,但嵌合体较少。

胰蛋白酶抑制剂的结构与功能研究进展

胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,其生理功能与防病虫害有关。近年来胰蛋白酶抑制剂因其独特的生理功能,如抗癌、抗病毒等,引起了广泛关注。本文对胰蛋白酶抑制剂的分类、典型的结构、功能及其提取和研究方法进行阐述,并对其应用潜力和存在的问题进行讨论,以期为胰蛋白酶抑制剂的进一步研究提供一定的参考。

大白菜转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因获得抗虫植株

以大白菜 3d苗龄带柄子叶为外植体 ,经根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导 ,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (sck)导入大白菜自交系‘GP 1 1’和杂交种‘中白 4号’ ,并获得了卡那霉素抗性植株。PCR检测和Southernblot杂交证实 ,sck基因已整合进大白菜基因组中 ;豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明 ,大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性 ,对照未转化植株抑制活性很低。室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明 ,转基因植株对菜青虫 (PierisrapaeL.)具有一定抗性。

大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生理和生长发育的影响

本研究根据棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｕｂｎｅｒ）幼虫中肠蛋白酶在离体条件下对蛋白酶抑制剂的反应，选择具有较强抑制作用的大豆胰蛋白酶抑制剂，以０．２１—４．２％（干重）的浓度配入幼虫人工饲料，测定了幼虫短期和长期取食这些饲料引起的中肠类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力的变化和生长抑制效应。短期取食抑制剂的幼虫，中肠弱碱性类胰蛋白酶活力显著增高，在４．２％浓度下比对照高出２１％强碱性类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低，生长发育受到明显抑制。长期取食低浓度（０．８４％）抑制剂的幼虫，弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力显著增高，强碱性类胰蛋白酶活力显著降低．总蛋白酶活力变化不显著；长期取食高浓度（４．２％）抑制剂的幼虫，强碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低，其它酶活力变化不显著。抑制剂随浓度的增高对幼虫生长的抑制作用加强，但浓度高于０．８４％后，抑制强度的变化减小。据此作者认为，蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用，从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏，昆虫消化过程受阻，影响生长发育。

根癌农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入苹果主栽品种

研究建立起一套简单、高效的苹果遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导的叶圆片转化法将高效启动子启动的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (CpTI)转入富士、乔纳金、王林、嘎拉等苹果主栽品种中 ,经卡那霉素抗性、PCR、点杂交、Southern杂交检测证明了 4个品种均获得转化再生植株 。

豇豆胰蛋白酶抑制剂cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达

从即将成熟的豇豆子叶中分离出总RNA,逆转录合成cDNA第一条链。参照已知的几种Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂基因序列,设计并合成了两段寡核苷酸引物,以单链cDNA为模板,进行PCR扩增,得到320bp的均一扩增产物,克隆到pBluescrip SK(+)的EcoRV位点上并转化大肠杆菌JM101。酶切图谱及DNA序列分析表明克隆到的片段含有编码完整80个aa的豇豆胰蛋白酶抑制剂结构基因和一段编码27aa的前导序列。利用限制酶NcoI对其前导序列进行缺失,只保留成熟蛋白结构基因上游第一个ATG密码子并克隆到大肠杆菌表达载体pKK233-2中进行表达研究,从转化细菌的提取物中检测到了外源CpTI基因表达产物对胰蛋白酶的抑制活力。

固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂的制备及其对大豆胰蛋白酶抑制剂的吸附性

通过反向悬浮交联法制备了壳聚糖树脂,采用环氧氯丙烷活化,对树脂固定胰蛋白酶进行研究。通过正交设计实验,优化了壳聚糖树脂的活化、偶联条件;结果表明,4.0g壳聚糖树脂,加入1.6mL环氧氯丙烷,8.0mL1.0mol/LNaOH,活化温度60℃、偶联温度30℃时,胰蛋白酶可达到较大偶联量,偶联量为24.63mg/g壳聚糖树脂;添加硼氢化钠4.0mg,1,4-二氧六环6.0mL时,可将壳聚糖树脂的活化效果分别提高2倍、1倍。固定化酶活性检测表明,胰蛋白酶已成功地偶联到壳聚糖树脂上,并具有亲和吸附胰蛋白酶抑制剂活性,对大豆胰蛋白酶抑制剂的清除率约为33.3%。此固定化胰蛋白酶树脂可作为一种新型、廉价的亲和载体材料。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探

从未成熟的大豆子叶中提取总RNA，利用RT－PCR方法扩增出大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段，克隆到pBluescriptKS（＋）SmaI位点上。序列分析表明，该基因与报导的序列高度同源：其核苷酸序列及推论的编码氨基酸序列的同源率分别为99．5％和98．2％。由此，构建了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的植物高效表达载体pBinSKTI。并采用农杆菌介导的叶盘法转化了烟草，获得的转基因烟草再生植株经抗虫测试表明：与对照烟草相比，具有明显的抗棉铃虫能力。

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的研究进展

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂属于典型丝氨酸蛋白酶抑制剂,其生理功能至少包括了保护储存蛋白、调节内源蛋白酶的活性、保护个体免受昆虫和病原体的侵害、抑制癌细胞侵袭扩散、抗炎、抗真菌等作用。并已经应用到了抗虫性转基因植物和临床疾病治疗中。

壳聚糖-胰蛋白酶抑制剂复合可食性膜的制备及抗黄曲霉活性

为探索新型生物膜材料的制备方法及抗黄曲霉活性,以壳聚糖和大豆胰蛋白酶抑制剂(TI)提取物为原料,甘油为增塑剂,利用溶液共混流延法制备壳聚糖-TI-甘油复合可食性膜,测试其厚度、表观结构、力学性质、透光率、水蒸气透过率及抗黄曲霉侵染活性。结果表明,当壳聚糖浓度为18mg/mL、TI浓度2mg/mL、甘油浓度12mg/mL和干燥温度45℃时,制备复合膜具有优良抗黄曲霉活性,且综合理化性能最佳。制备壳聚糖-TI-甘油复合膜液涂膜于花生上,接种黄曲霉培养后发现,复合膜对于黄曲霉侵染具有较强的抵抗和抑制作用。

豆奶蛋白组分和胰蛋白酶抑制剂活性的热变化

目的 : 研究热处理对豆奶蛋白组分、巯基含量及胰蛋白酶抑制剂活性的影响。方法 : 以 95℃、1 2 0℃、1 40℃处理鲜豆奶 ,用 SDS- PAGE(十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺薄板凝胶电泳 )分析经热处理和 β-巯基乙醇处理后豆奶蛋白组分的变化 ;研究豆奶胰蛋白酶抑制剂活性的热变化 ;用 Ellman试剂法测定巯基含量。结果 : 鲜豆奶中 7,8,1 1 ,1 2 ,1 3,1 4,1 5,1 6号蛋白组分经热处理后逐步消失 ,出现分子量为 1 0 4 62 0的 1 7号蛋白质新组分 ,β-巯基乙醇处理证明此蛋白组分的出现与 1 2 ,1 3,1 4,1 5,1 6号蛋白组分的消失具有相关性 ,这些组分的次级结构主要靠二硫键结合 ;热处理使豆奶巯基含量急剧下降 ;热处理失活 90 %的胰蛋白酶抑制剂 ,95℃处理需要 35min,1 2 0℃需 7min,而 1 40℃只需 60 s左右。结论 : 热处理导致豆奶蛋白巯基的变化从而引起蛋白组分的变化 ;胰蛋白酶抑制剂的热致死时间曲线表明 ,在 95～ 1 40℃范围内 ,温度增加 30℃ ,钝化90 %胰蛋白酶抑制剂的热处理时间缩短为原来的 1 /1

花生胰蛋白酶抑制剂的纯化及钝化研究

目的：从花生种子中提取纯化胰蛋白酶抑制剂，研究其聚合形式及热稳定性等性质，并采用各种巯基还原剂和蛋白酶钝化其胰蛋白酶抑制活性。方法：采用５０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸溶液提取，５０％～９０％丙酮分级沉淀分离及ＥＡＥＤ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０离子交换色谱从花生（ＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａＬ．）种子中提取并纯化了胰蛋白酶抑制剂（ＰＴＩ）；并以ＢＡＰＮＡ为底物测定其抑制活性、热稳定性及巯基还原剂对抑制剂的钝化作用；用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法测定其分子量及蛋白酶水解敏感性。结果：ＰＴＩ是由等电点约４．３，分子量约５０００～８０００的两个多肽组成的二聚体；高度耐热、耐酸且不易被蛋白酶降解。各种巯基还原剂可不同程度地增加ＰＴＩ的热敏感性及蛋白酶水解敏感性，以二硫苏糖醇（ＤＴＩ），β－巯基乙醇（β－ＭＥ）及Ｎａ２ＳＯ３较佳。枯草杆菌蛋白酶可部分水解氧化态的ＰＴＩ，并彻底水解还原态的ＰＴＩ；而木瓜蛋白酶不能水解还原态的ＰＴＩ。结论：ＰＴＩ的热稳定性与二硫键的存在有关，还原态的ＰＴＩ增加了对热和蛋白酶水解的敏感性，巯基还原剂结合枯草杆菌蛋白酶水解可在常温下彻底钝化ＰＴＩ的活性。

永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究

目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂，并探讨其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料，经脱脂，酸性溶液提取，硫酸铵沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经Sephadex G-75凝胶层析得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，以纯化的胰蛋白酶抑制剂给糖尿病小鼠灌胃并观察其降血糖活性。结果从豆豉里分离出的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率为30％～40％；用抑制剂提取液给四氧嘧啶糖尿病模型小鼠连续灌胃4d，发现其血糖值明显低于模型组；观察小鼠的胰组织病理切片，与糖尿病小鼠比较，灌胃后的小鼠胰组织明显得到修复。结论豆豉提取液有较明显的降糖作用。