重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析

胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键。胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物。所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值。以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(Tg M)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体。将Tg M基因插入到表达载体p ET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒p ET28a-Tg M并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含Tg M基因的工程菌株并诱导表达。14%SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在。包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/m L,比活力为1 566.27 U/mg。将最终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少。

表面电荷突变与胰蛋白酶底物专一性的改造

分别利用酶切重组和“３＋１”引物ＰＣＲ定点突变的方法构建了三个胰蛋白酶表面电荷双突变体：Ｒ６２Ｄ＋Ｋ９７Ｅ、Ｒ６２Ｄ＋Ｋ１７５Ｅ和Ｋ９７Ｅ＋Ｋ１７５Ｅ．对三者在Ｅ．ｃｏｌｉＸ－９０菌中的表达产物进行了动力学测定，分别得到了三种双突变体在两种ｐＨ条件下，水解ＴＡＭＥ、ＴＬＭＥ两种底物的动力学数据．结果表明，Ｒ６２Ｄ＋Ｋ１７５Ｅ和Ｋ９７Ｅ＋Ｋ１７５Ｅ在ｐＨ６．８５时，对两种底物的催化活性与野生型相比下降了２～３个数量级，当ｐＨ升高至８．８５时，它们的活性基本丧失；双突变体Ｒ６２Ｄ＋Ｋ９７Ｅ虽然催化活性也有所降低，但随着ｐＨ的升高，它对Ｌｙｓ底物的特异性（选择性系数２５倍于Ａｒｇ底物）转变为对Ａｒｇ底物略高的特异性，基本符合分子设计．实验结果还表明，各种双突变体催化活性的降低主要是由于酶和底物的亲和力降低引起的．