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重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析
被引量:
2
1
作者
杨敏
黄潇
+3 位作者
张一唯
平宪卿
龙军
曹荣月
《药物生物技术》
CAS
2015年第4期283-287,共5页
胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键。胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物。所以研...
胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键。胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物。所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值。以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(Tg M)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体。将Tg M基因插入到表达载体p ET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒p ET28a-Tg M并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含Tg M基因的工程菌株并诱导表达。14%SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在。包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/m L,比活力为1 566.27 U/mg。将最终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少。
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关键词
胰蛋白酶突变体
蛋白
表达
包涵体
蛋白
复性
胰岛素
离子交换层析
原文传递
表面电荷突变与胰蛋白酶底物专一性的改造
被引量:
3
2
作者
文华
张庭芳
张龙翔
《生物化学杂志》
CSCD
1997年第6期649-654,共6页
分别利用酶切重组和“3+1”引物PCR定点突变的方法构建了三个胰蛋白酶表面电荷双突变体:R62D+K97E、R62D+K175E和K97E+K175E.对三者在E.coliX-90菌中的表达产物进行了动力学测定,分别...
分别利用酶切重组和“3+1”引物PCR定点突变的方法构建了三个胰蛋白酶表面电荷双突变体:R62D+K97E、R62D+K175E和K97E+K175E.对三者在E.coliX-90菌中的表达产物进行了动力学测定,分别得到了三种双突变体在两种pH条件下,水解TAME、TLME两种底物的动力学数据.结果表明,R62D+K175E和K97E+K175E在pH6.85时,对两种底物的催化活性与野生型相比下降了2~3个数量级,当pH升高至8.85时,它们的活性基本丧失;双突变体R62D+K97E虽然催化活性也有所降低,但随着pH的升高,它对Lys底物的特异性(选择性系数25倍于Arg底物)转变为对Arg底物略高的特异性,基本符合分子设计.实验结果还表明,各种双突变体催化活性的降低主要是由于酶和底物的亲和力降低引起的.
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关键词
胰蛋白酶突变体
底物专一性
表面电荷
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职称材料
题名
重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析
被引量:
2
1
作者
杨敏
黄潇
张一唯
平宪卿
龙军
曹荣月
机构
中国药科大学
江苏未名生物医药有限公司
南京中医药大学
出处
《药物生物技术》
CAS
2015年第4期283-287,共5页
基金
国家级大学生创新创业训练计划项目(No.J1030830)
江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)
+2 种基金
mi R-26a靶向TET酶在胰腺成体干细胞分化过程中的作用及机制研究(中央高校基金杰出人才引导项目)
国家自然科学基金(No.81172973
No.81373232)
文摘
胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键。胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物。所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值。以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(Tg M)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体。将Tg M基因插入到表达载体p ET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒p ET28a-Tg M并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含Tg M基因的工程菌株并诱导表达。14%SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在。包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/m L,比活力为1 566.27 U/mg。将最终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少。
关键词
胰蛋白酶突变体
蛋白
表达
包涵体
蛋白
复性
胰岛素
离子交换层析
Keywords
Trypsin mutant
Protein expression
Inclusion body
Renaturation
Insulin
Ion exchange chromatography
分类号
R576 [医药卫生—消化系统]
原文传递
题名
表面电荷突变与胰蛋白酶底物专一性的改造
被引量:
3
2
作者
文华
张庭芳
张龙翔
机构
北京大学生命科学学院
出处
《生物化学杂志》
CSCD
1997年第6期649-654,共6页
基金
国家863计划基金
文摘
分别利用酶切重组和“3+1”引物PCR定点突变的方法构建了三个胰蛋白酶表面电荷双突变体:R62D+K97E、R62D+K175E和K97E+K175E.对三者在E.coliX-90菌中的表达产物进行了动力学测定,分别得到了三种双突变体在两种pH条件下,水解TAME、TLME两种底物的动力学数据.结果表明,R62D+K175E和K97E+K175E在pH6.85时,对两种底物的催化活性与野生型相比下降了2~3个数量级,当pH升高至8.85时,它们的活性基本丧失;双突变体R62D+K97E虽然催化活性也有所降低,但随着pH的升高,它对Lys底物的特异性(选择性系数25倍于Arg底物)转变为对Arg底物略高的特异性,基本符合分子设计.实验结果还表明,各种双突变体催化活性的降低主要是由于酶和底物的亲和力降低引起的.
关键词
胰蛋白酶突变体
底物专一性
表面电荷
Keywords
Mutant trypsin,Substrate specificity,pH dependence,Surface charge
分类号
Q555.9 [生物学—生物化学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析
杨敏
黄潇
张一唯
平宪卿
龙军
曹荣月
《药物生物技术》
CAS
2015
2
原文传递
2
表面电荷突变与胰蛋白酶底物专一性的改造
文华
张庭芳
张龙翔
《生物化学杂志》
CSCD
1997
3
下载PDF
职称材料
已选择
0
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引证文献
统计分析
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