比较羊水细胞原位培养法和胰酶消化法在产前诊断染色体检查中的应用价值

目的比较载玻片-原位培养法(以下简称原位法)和胰酶消化法在羊水细胞染色体检查中的应用价值。方法选取2020年7—12月来该院进行产前诊断的1105例孕妇的羊水标本,分别采用原位法和胰酶消化法进行培养、收获及制片,成功制片后用GSL-120扫描、捕获核型,对两种方法的羊水细胞培养成功率、培养时间、分裂相、核型结果等进行比较分析。结果1105例羊水标本同时采用原位法、胰酶消化法两种方法进行培养,这两种方法的培养成功率的差异无统计学意义(χ^(2)=0.33,P>0.05)。原位法和胰酶消化法羊水需求量分别为5、10 mL,培养基用量分别为7、8 mL。与胰酶消化法相比,原位法羊水细胞培养时间短,分裂相及优质分裂相数目多,差异均有统计学意义(Z=-31.83,P<0.001;Z=-2.937,P=0.003;Z=-2.943,P=0.003)。两种方法的羊水染色体核型分析均检出972例正常核型、128例异常核型,其中染色体数目异常真嵌合7例,染色体核型结果符合率为100%。结论与胰酶消化法相比,原位法具有培养时间短、培养基用量少、羊水需求量少、操作步骤简单、优质分裂相多,以及可以有效诊断真假嵌合等优点,但胰酶消化法相较于原位法具有制片可重复性相对较高且耗材相对经济的优势,结合原位法和胰酶消化法的优缺点,羊水细胞培养可以采用原位法为主、胰酶消化法为辅的培养模式,提高产前诊断的效率、准确率与成功率。

机械吹打法、胰酶消化法分离新生大鼠脑组织神经干细胞效果观察

目的对比观察机械吹打法、胰酶消化法分离培养新生大鼠脑组织神经干细胞(NSCs)的效果。方法取出生3天的新生SD大鼠大脑皮质,分别用机械吹打法、胰酶消化法分离培养(分别记为机械吹打组和胰酶消化组),通过免疫荧光法对NSCs进行鉴定和诱导分化;分别于培养第2、5、7天计数细胞球直径及数目;通过MTT法检测两组原代及第3亚代细胞的克隆增殖能力;选取第3亚代细胞进行冻存、复苏,计算细胞复苏后的存活率。结果两组均可从新生SD大鼠大脑皮质分离得到NSCs,并均可诱导分化为神经元、神经胶质细胞。培养5、7天时,机械吹打组获得的细胞球数量和直径均高于相同培养时间的胰酶消化组(P均<0.05)。机械吹打组原代细胞培养2、5、7天细胞克隆增殖能力均高于相同培养时间的胰酶消化组(P均<0.05),第3亚代细胞培养2、5天细胞克隆增殖能力均优于相同培养时间的胰酶消化组(P均<0.05)。两组第3亚代细胞冻存、复苏后存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论机械吹打法、胰酶消化法均可成功分离培养、诱导分化新生大鼠NSCs,机械吹打法分离培养的NSCs克隆增殖能力高于胰酶消化法。

胰酶消化法纯化诱导不同年龄段SD大鼠骨髓破骨细胞的体外培养

目的用胰酶消化法纯化获取大量高纯度破骨细胞,为进行相关分子生物学研究奠定基础。方法以1,25-(OH)2D3/地塞米松诱导培养不同年龄段(1、12、24、36d)SD大鼠的骨髓破骨细胞,采用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸纯化。通过倒置相差显微镜观察细胞形态,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色和扫描电镜观察鉴定破骨细胞,并计数分析。结果1、12、24、36d组大鼠骨髓破骨细胞均培养成功,经Trap染色和扫描电镜观察证实为体外有噬骨能力的破骨细胞,纯化率达到90%。1d和12d组破骨细胞出现较早且数量较多,细胞计数两组间无统计学差异(P>0.05),但它们与其余各组均有统计学差异(P<0.05)。结论采用胰酶消化法纯化1,25-(OH)2D3/地塞米松诱导培养的大鼠骨髓破骨细胞,纯度较高;选用大鼠以10—12d龄较为适宜。

机械分离与胰酶消化分离对长期培养的神经干细胞神经发生能力的影响

目的探讨神经干细胞（NSCs）培养的分离传代技术及其在长期培养条件下的神经发生能力。方法取孕14d的Wistar胎鼠大脑皮层，消化分离后，以1×10^5／ml浓度进行NSCs原代培养。分别采用机械分离与胰酶消化法进行NSCs传代培养，台盼蓝活细胞计数测定分离后细胞存活率，计算细胞倍增时间和细胞增殖率。取第4、8、12、20、30代机械分离传代培养的NSCs球接种到24孔培养板中的盖玻片上，加入分化培养液，观察长期培养条件下NSCs的神经发生能力的变化。结果与胰酶消化法进行的NSCs球传代相比，机械分离的NSCs球为小细胞球和单细胞传代，传代后细胞存活率高，细胞倍增时间短，增殖能力强（P均〈0．05）。体外长期培养条件下，随着培养时间的延长，NSCs分化为神经元的比例逐渐降低，星形胶质细胞的比例逐渐增高；在4—12代NSCs分化为神经元的能力表现出下降的趋势，但仍较为稳定；12代后，神经元的分化比例迅速下降，星形胶质细胞的比例迅速上升。结论与胰酶消化法相比，逐步减小吸管口径的机械分离传代法，减少了传代对细胞的损伤，保证了大部分细胞间连接的完整性，显著增强了NSCs的增殖能力。体外长期扩增的NSCs，由于微环境和（或）自身基因的调控，随着传代的延续，其神经发生能力逐渐降低，分化为神经元的比例逐渐减少，分化为星形胶质细胞的比例逐渐增加。

胰酶消化法用于TB-DNA扩增的痰标本前处理及结果分析

目的 探讨胰酶对痰的消化作用及用于荧光定量PCR(FQ PCR)检测TB DNA的可行性。方法 用市售胰酶配制悬液 ,确定胰酶浓度、pH、激活剂 ,按 1∶1用量观察胰酶对痰的液化能力、对FQ PCR的影响 ,并与结核培养阳性率进行比较。 结果 5 %的胰酶悬液 (pH8.0、CaCl2 为激活剂 )对痰的消化力明显强于单纯的碱 (2 %NaOH)消化 ,且时间短、稀释小 ;对FQ PCR的扩增无影响 ;阳性率 (33.3% )明显高于培养阳性率 (12 .6 % )。结论 胰酶消化法用于痰标本的前处理是可行的 ,不仅缩短了液化时间 ,提高了阳性率 ,且易于准确定量。

胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞

建立胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞 ,并和其他大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养方法相比较。在无菌条件下分离雄性Wistar大鼠胸主动脉血管中膜 ,剪碎中膜 ,在 37℃用 10mL 0 .2 5 %胰酶消化大约 3.5h。中止消化后 ,在 10 0g条件下离心 5min ,收集细胞种入 2 5cm2 细胞培养瓶。结果发现 ,胸主动脉平滑肌细胞至少可以传 2 0代以上 ,并且细胞形态、生长特点、平滑肌a 肌动蛋白表达不发生明显的改变。结果提示 ,与目前的平滑肌细胞培养方法相比 ,胰酶消化法培养平滑肌细胞的方法重复性好 ,原代培养的平滑肌细胞具有数量多、生长迅速的特点。

胰酶消化对不同抗体在石蜡切片中免疫酶标记的影响

采用27种抗体在200例各种类型的肿瘤和正常组织中进行免疫组化染色,显示石蜡切片经胰蛋白酶消化后,一部分抗体的免疫反应有所增强。但也有一部分抗体没有变化,甚至一部分抗体可转为阴性结果。说明胰蛋白酶消化要根据各种抗体,以及其厂家、批号的不同,经多次试验来决定是否需要。

胰酶消化时长对GFP转基因小鼠BMSC传代生长特性的影响

目的比较胰酶消化时间对绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)传代生长、分化能力的影响。方法取含相同细胞量的P2代绿色荧光蛋白转基因小鼠BMSC悬液接种于6孔细胞培养板中,待细胞生长融合度达到80%~90%时,用0.25%的胰酶消化5、10、15和20 min,比较不同时间点胰酶的消化能力、再次贴壁生长状态、培养上清中BMSC死亡碎片的数量以及诱导成脂、成骨、成软骨分化能力。结果消化5 mins后,大量BMSC处于贴壁状态,无法传代;消化10、15 mins后,80%以上的BMSC缩成圆形并脱落,二次贴壁后呈长梭形,表面光滑,具有多向分化潜能;消化20 min后,BMSC全部悬浮,再贴壁后呈宽大扁平状,表面粗糙,培养上清中悬浮大量细胞死亡碎片。结论绿色荧光蛋白转基因小鼠BMSC传代培养中,0.25%胰酶的最佳消化时间为10~15 mins。

视网膜胰酶消化标本平铺方法及应用

1 引言视网膜胰酶消化标本平铺是Kuwabara和Cogan于1960年首先创用。本技术是利用胰蛋白酶的生物活性,将视网膜的神经纤维组织消化掉,并能完整的残留下视网膜血管网。在我们的工作实践中,对其操作细节作了一些改进。

胰岛64KD蛋白胰酶消化片段抗原与胰岛素依赖型糖尿病

胰岛６４ＫＤ蛋白抗原（６４ＫＤａ）是胰岛素依赖型糖尿病（ＩＤＤＭ）的主要自身抗原，其抗体在ＩＤＤＭ患者中阳性率很高，６４ＫＤａ经胰酶消化后可产生５０ＫＤａ，４０ＫＤａ，３７ＫＤａ三种片段，它们均与ＩＤＤＭ发病有紧密联系，尤其３７ＫＤａ对青少年发病型和快速进展型ＩＤＤＭ预测和诊断有重要价值。通过对三种片段与其它ＩＤＤＭ抗体的联系研究发现，５０ＫＤａ来源于谷氨酸脱羧酶，４０ＫＤａ的前体为胰岛细胞抗体（ＩＣＡ）５１２，３７ＫＤａ的前体为ｐｈｏｇｒｉｎ。

用胰酶消化法分离弓形体虫体

目前，对弓形体病的诊断方法有很多，如皮内变态反应及琼脂扩散反应、间接血凝反应、染色反应法等免疫血清学诊断法。尽管这些方法具有较高的检出率，但没有一种方法比直接分离到虫体更准确而有说服力。

不同胰酶消化方法用于制备猴胚肾细胞的评价

为了提高猴胚肾细胞的产量和质量，对生物制品生产中常规使用的四种细胞制备方法进行实验性评价，结果表明热消化法和冷消化法较适合于猴胚肾细胞的制备，冷消化法又优于热消化法，细胞产量高稳定性好，细胞活力强，上述两种方法也适合于幼兔肾和胎猴肺细胞的制备．

以差速贴壁与化学药物并胰酶限时消化法纯化新生大鼠嗅鞘细胞:优于单一差速贴壁和化学药物法吗?

背景:目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同,个别方法重复性较差,不利于实际应用。目的:观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果,并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成。材料:新生2d的SD大鼠8只,由福建医科大学试验动物中心提供。方法:无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球,剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网,剪成0.5mm3的小块进行胰蛋白酶消化,过筛后按4.0×108L-1密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养。设立4组:①未经纯化的常规对照组。②化学药物组加入5μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂。③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞。④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞,而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理,培养6d贴壁细胞大部分融合后,加入1.25g/L胰蛋白酶消化1min,显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化。主要观察指标:嗅鞘细胞的形态,NGFRp75免疫细胞荧光染色结果。结果:体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长;未经纯化的常规对照组培养7d时视野内成纤维细胞已达60%以上,至14d成纤维细胞完全长满;经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多,嗅鞘细胞的形态与原代基本相同。存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应,但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低,仅为75%;差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高,达85%以上。结论:实验结果证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术,是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法。

胰酶限时消化在嗅鞘细胞培养中的运用

目的探索出一套高效、实用的大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的培养和纯化方案。方法分离SD大鼠嗅球的外两层组织,剪切消化成细胞悬液进行接种。采用3种方法进行OECs的培养和纯化:(1)A组分别经6h、24h两次差速贴壁去除杂质细胞,培养至12d左右消化重悬细胞进行爬片分析。(2)B组分别经6h、24h两次差速贴壁去除杂质细胞,培养至12d左右经胰酶限时消化,留成纤维细胞于瓶壁,重悬的细胞进行爬片分析。(3)C组采用经典的Nash法(分别经18h、36h两次差速贴壁去除杂质细胞),培养至11d左右消化重悬细胞进行爬片分析。采用NGFRP75与碘化丙啶(PI)双染的方法进行OECs的鉴定和纯度分析。结果在共聚焦显微镜下呈双染阳性的细胞为OECs,OECs多数突起细长,呈双极或三极,少量呈单极或多极。A、B、C组所纯化的OECs纯度分别为(67.3±6.2)%、(83.7±7.7)%和(74.6±9.5)%,3组间比较有统计学差异(F=13.633,P<0.01),B组所得OECs纯度均较另两组高(P<0.05)。结论经6h、24h两次差速贴壁+胰酶限时消化可以获得较高纯度的OECs,能够满足动物实验的需要。

人脐带间充质干细胞生物特性比较:胰酶冷消化和组织块法体外培养

背景:以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。目的:比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞,记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期,倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况,制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线,流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达,第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。结果与结论:使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P<0.05);原代培养周期差异无显著性意义(P>0.05)。倒置相差显微镜下细胞均为贴壁生长,形态为成纤维细胞样,但胰酶冷消化法培养的少数原代细胞呈多角形,不规则,细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法,在进入对数生长期后各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P<0.05)。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45。两种方法培养出来的第3代脐带间充质干细胞经诱导后,免疫荧光均显示神经干细胞特征性标志物nestin阳性表达。结果表明胰酶冷消化法与组织块法均能培养出脐带间充质干细胞,但组织块法更适合于此类细胞的培养,对细胞的伤害更低。

乳鼠心肌细胞酶消化培养和贴块培养法的比较

目的探索经济、简单易行的心肌细胞培养方法。方法选用新生乳大鼠心肌细胞进行0.25%胰酶分离培养和贴块培养两种培养方法。结果用0.25%胰酶消化培养可获得大量的单细胞,但是酶对细胞的损伤比较大,酶消化所受的影响因素比较多,此过程获取单细胞所需的时间比较长;贴块培养法简便易行,得到的细胞结构完整、存活率高,且经济实惠、适合长期研究且需细胞量不多的实验。结论酶分离培养和贴块培养各有优劣势,应根据不同的实验目的选用不同的培养方法。

胰酶复合消化液在抗酸杆菌检测中的应用

目的 痰液找抗酸杆菌,目前常采用直接涂片抗酸染色法,但该方法检出率低.为了提高检出率,我们改进了标本前处理的方法.方法 利用胰酶复合消化液使黏稠痰液均质液化,利于抗酸杆菌的检出.

肾活检组织Masson染色方法的改良

目的 通过对传统Masson染色方法的改良,解决肾活检光镜诊断中Masson染色存在的色彩浑浊,定位不清等问题。方法 收集2021-2022年的25例膜性肾病标本,分别采用改良染色法与传统方法,对比染色质量进行评分。结果 25例膜性肾病4种Masson染色结果比较,发现变色酸2R-亮绿+Bouin二次固定+胰酶消化法在色彩鲜明、嗜复红蛋白定位清晰及不易褪色、切片整体评分方面均优于传统方法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 改良后的Masson的染色方法在色彩对比度、持久度均优于传统方法。