半胱天冬酶3靶向分子影像探针在肿瘤细胞凋亡监测中的应用进展

细胞凋亡与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。因此,早期动态监测细胞凋亡对恶性肿瘤治疗效果评估以及指导后续治疗具有重要意义。分子影像是一种新兴的无创显像技术,能够可视化单个分子或特定细胞亚群,从而反映活体状态下分子水平变化。半胱天冬酶3(Caspase-3)是细胞凋亡的半胱天冬酶级联反应过程中至关重要的死亡执行蛋白酶,能够启动细胞内蛋白的特异性降解,从而诱导细胞凋亡。设计靶向Caspase-3的分子影像探针,能够实时监测治疗过程中肿瘤部位Caspase-3表达,精准评估治疗效果,从而为个体化治疗提供可靠依据。根据与Caspase-3不同的作用方式,Caspase-3分子影像探针主要分为Caspase-3抑制剂类和Caspase-3多肽底物类分子影像探针。这两类探针对Caspase-3均具有良好的靶向特异性和选择性,已成功应用于实时显像小鼠或人体治疗早期的肿瘤细胞凋亡。但这些探针仍有一定不足,如灵敏度低、组织背景高、代谢速度快等,尚需进一步优化。

基于NOD样受体蛋白3/半胱天冬酶-1信号通路探究槲寄生滴眼液对干眼症模型小鼠的治疗效果

目的基于NOD样受体蛋白3(NLRP3)/半胱天冬酶-1(Caspase-1)信号通路探究槲寄生滴眼液对干眼症模型小鼠的治疗效果。方法将干眼症模型小鼠(采用苯扎氯铵溶液滴眼造模)随机分为模型组(以生理盐水干预)、槲寄生滴眼液组(槲寄生滴眼液滴眼5μL,每天2次)、NLRP3/Caspase-1通路抑制剂(VX-765)组(腹腔注射50 mg/kg VX-765,每天1次)、槲寄生滴眼液+VX-765组(槲寄生滴眼液滴眼5μL,每天2次,腹腔注射50 mg/kg VX-765,每天1次),每组12只。另取12只健康小鼠作为对照组(以生理盐水干预)。各组均持续给药14 d。酚红棉线测定泪液分泌情况;苏木精-伊红染色观察结膜上皮和泪腺组织病理改变情况;酶联免疫吸附试验测定血清白细胞介素(IL)-18、IL-1β水平;荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别测定结膜上皮和泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,模型组结膜上皮细胞排列紊乱,杯状细胞数量减少,固有层可见淋巴细胞浸润等病理损伤,泪腺组织呈现腺泡空泡样改变,结构不清晰,大小不均一,各小叶及腺泡间细胞排列紊乱等病理变化,泪液分泌量(酚红棉线被浸湿的长度,下同)[(2.66±0.42)mm比(6.14±1.09)mm,P<0.05]显著减少,血清IL-18[(53.16±6.95)pg/mL比(15.04±2.14)pg/mL,P<0.05]、IL-1β[(57.28±7.11)pg/mL比(24.51±3.06)pg/mL,P<0.05]、结膜上皮及泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白[NLRP3 mRNA:(3.05±0.43)比(1.00±0.05),P<0.05;Caspase-1mRNA:(4.41±0.62)比(1.00±0.06),P<0.05;NLRP3蛋白:(1.33±0.21)比(0.17±0.03),P<0.05;Caspase-1蛋白:(1.51±0.26)比(0.20±0.04),P<0.05]表达显著升高。与模型组比较,槲寄生滴眼液组、VX-765组和槲寄生滴眼液+VX-765组结膜上皮和泪腺组织上述病理损伤减轻,泪液分泌量[(4.15±0.53)mm、(4.11±0.55)mm、(5.38±0.62)mm比(2.66±0.42)mm,P<0.05]显著增加,血清IL-18[(36.03±5.71)pg/mL、(35.92±5.66)pg/mL、(20.07±3.38)pg/mL比(53.16±6.95)pg/mL,P<0.05]、IL-1β[(40.85±5.04)pg/mL、(41.06±5.12)pg/mL、(28.08±4.57)pg/mL比(57.28±7.11)pg/mL,P<0.05]、结膜上皮和泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白[NLRP3 mRNA:(2.11±0.32)、(2.09±0.29)、(1.37±0.22)比(3.05±0.43),P<0.05;Caspase-1 mRNA:(2.93±0.38)、(2.89±0.36)、(1.58±0.25)比(4.41±0.62),P<0.05;NLRP3蛋白:(0.60±0.11)、(0.59±0.09)、(0.19±0.04)比(1.33±0.21),P<0.05;Caspase-1蛋白:(0.72±0.12)、(0.74±0.11)、(0.23±0.05)比(1.51±0.26),P<0.05]表达显著降低。与槲寄生滴眼液组和VX-765组比较,槲寄生滴眼液+VX-765组结膜上皮和泪腺组织上述病理损伤进一步减轻,泪液分泌量[(5.38±0.62)mm比(4.15±0.53)mm、(4.11±0.55)mm,P<0.05]显著增加,血清IL-18[(20.07±3.38)pg/mL比(36.03±5.71)pg/mL、(35.92±5.66)pg/mL,P<0.05]、IL-1β[(28.08±4.57)pg/mL比(40.85±5.04)pg/mL、(41.06±5.12)pg/mL,P<0.05]、结膜上皮和泪腺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白[NLRP3 mRNA:(1.37±0.22)比(2.11±0.32)、(2.09±0.29),P<0.05;Caspase-1mRNA:(1.58±0.25)比(2.93±0.38)、(2.89±0.36),P<0.05;NLRP3蛋白:(0.19±0.04)比(0.60±0.11)、(0.59±0.09),P<0.05;Caspase-1蛋白:(0.23±0.05)比(0.72±0.12)、(0.74±0.11),P<0.05]表达显著降低。结论炎症,可能通过下调NLRP3/Caspase-1信号通路实现。

基于NOD样受体热蛋白结构域3/胱天蛋白酶-1通路探讨鱼腥草注射液缓解脂多糖诱导的小鼠急性肺炎肺损伤的作用机制

目的探究鱼腥草注射液(HHI)对急性肺炎小鼠的保护作用及对NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(caspase-1)通路的调控作用。方法2019年7月至2020年6月,将购自广东省医学实验动物中心的90只BALB/c雄性小鼠分为正常对照组、模型组、HHI低(10 mL/kg)及高(30 mL/kg)剂量组、NLRP3激动剂(DDC)组(300 mg/kg)、HHI+DDC组(30 mL/kg+300 mg/kg),每组15只。除正常对照组外,其余各组均通过雾化吸入脂多糖(LPS)2.5 g/L建立急性肺炎模型。末次给药后检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平、中性粒细胞数目;取右肺,检测右肺湿重/干重(W/D);左肺组织病理损伤情况,肺组织凋亡相关斑点样蛋白(ASC)mRNA及蛋白、NLRP3 mRNA及蛋白、TNF-α、IL-6、caspase-1蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组小鼠出现肺泡破坏及炎性细胞浸润等病理损伤现象,W/D、IL-6[(1692.06±95.26)µg/L比(569.91±50.89)µg/L]、TNF-α[(1846.24±99.26)µg/L比(506.99±55.48)µg/L]水平及中性粒细胞数目[(66.24±2.56)×10^(6)个/毫升比(5.09±1.98)×10^(6)个/毫升]、肺组织NLRP3 mRNA及蛋白(1.01±0.13比0.22±0.12)、ASC mRNA及蛋白(1.03±0.13比0.29±0.11)、caspase-1(1.06±0.14比0.25±0.12)、TNF-α、IL-6蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,HHI低、高剂量组肺泡破坏及炎性细胞浸润等现象缓解,W/D、小鼠BALF中炎性因子IL-6[(1069.13±75.12)µg/L、(889.02±65.13)µg/L比(1692.06±95.26)µg/L]、TNF-α[(1225.33±84.02)µg/L、(806.63±69.12)µg/L比(1846.24±99.26)µg/L]含量及中性粒细胞数目[(45.33±2.22)×10^(6)个/毫升、(22.63±2.02)×10^(6)个/毫升比(66.24±2.56)×10^(6)个/毫升]、肺组织中NLRP3 mRNA及蛋白(0.83±0.11、0.52±0.12比1.01±0.13)、ASC mRNA及蛋白(0.82±0.12、0.54±0.11比1.03±0.13)、caspase-1(0.80±0.15、0.59±0.12比1.06±0.14)、TNF-α、IL-6蛋白表达降低(P<0.05);DDC组小鼠上述指标与HHI低、高剂量组相反(P<0.05)。结论HHI可通过抑制NLRP3/caspase-1通路激活,改善肺炎小鼠炎症反应,缓解肺损伤。

miRNA-181a、胱天蛋白酶富集域家族成员11、核因子κB在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义

目的探讨微小RNA-181a(miRNA-181a)、胱天蛋白酶富集域家族成员11(CARD11)、核因子κB(NF-κB)在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义。方法选取85例弥漫大B细胞淋巴瘤患者和60例增生性淋巴结炎患者,分别作为观察组和对照组,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量。比较不同临床特征弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 m RNA、NF-κB mRNA相对表达量,比较Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期观察组和对照组患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量,比较不同疗效弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κB mRNA相对表达量。采用受试者工作特征(ROC)曲线及曲线下面积(AUC)分析miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独及联合检测对弥漫大B细胞淋巴瘤患者临床分期的诊断价值及对疗效的预测价值。结果Ann Arbor分期为Ⅲ~Ⅳ期、国际预后指数(IPI)评分为3~5分弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a相对表达量分别明显高于Ann Arbor分期为Ⅰ~Ⅱ期、IPI评分为0~2分的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。结外累及数目﹥1个、Ann Arbor分期为Ⅲ~Ⅳ期、IPI评分为3~5分弥漫大B细胞淋巴瘤患者CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均明显高于结外累及数目≤1个、Ann Arbor分期为Ⅰ~Ⅱ期、IPI评分为0~2分的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均高于对照组,Ⅲ~Ⅳ期弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均高于Ⅰ~Ⅱ期患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。疗效为完全缓解(CR)/部分缓解(PR)/疾病稳定(SD)弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均低于疗效为疾病进展(PD)的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。ROC曲线显示,miRNA-181a、CARD11、NF-κB联合检测诊断弥漫大B细胞淋巴瘤患者临床分期的AUC为0.968,高于三者单独检测的0.852、0.841、0.830;miRNA-181a、CARD11、NF-κB联合检测预测弥漫大B细胞淋巴瘤患者疗效的AUC为0.953,高于三者单独检测的0.847、0.684、0.816。结论miRNA-181a、CARD11、NF-κB可作为弥漫大B细胞淋巴瘤患者病情监测和预后预测指标,其表达水平升高提示患者病情可能加重,三者联合检测对弥漫大B细胞淋巴瘤的诊断价值较高,且对预后的预测价值较高。

清肺通络方通过胱天蛋白酶-1/Gasdermin D蛋白细胞焦亡途径对支原体肺炎小鼠的干预机制

目的:探讨清肺通络方通过胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/Gasdermin D(GSDMD)蛋白细胞焦亡途径对支原体肺炎小鼠干预机制。方法:将30只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、清肺通络方组,每组10只。采用肺炎支原体菌株滴鼻法建立支原体肺炎小鼠模型。造模同时予灌胃治疗,连续治疗3 d,实验第4天处死各组小鼠。PCR检测小鼠肺组织MP-DNA含量,HE染色观察小鼠肺组织病理改变,Western blot检测胱天蛋白酶-1前体(pro-Caspase-1)、Caspase-1、GSDMD、Gasdermin D氮端活性结构域多肽(GSDMD-N)表达,ELISA检测肺泡灌洗液中白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)含量,生化法检测肺组织细胞乳酸脱氢酶(LDH)和Na+-K+-ATP酶活性。结果:镜下观察模型组小鼠肺间质出现炎性细胞浸润、渗出明显。与空白对照组比较,模型组小鼠pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表达及IL-1β、IL-18含量均升高,LDH活性上升,Na+-K+-ATP酶活性下降(均P<0.05);与模型组比较,清肺通络方组小鼠肺间质炎症细胞浸润明显减轻,肺组织中Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表达及IL-1β、IL-18含量均降低(均P<0.05),LDH活性下降,Na+-K+-ATP酶活性上升(均P<0.05);两组pro-Caspase-1表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:清肺通络方通过抑制Caspase-1/GSDMD通路,缓解细胞焦亡,减轻小鼠肺组织炎症反应。

胱天蛋白酶募集域蛋白9介导心肌缺血再灌注损伤发生发展的机制研究进展

及时血运重建恢复冠状动脉血流是心肌梗死患者治疗的关键,但再灌注同时可能对缺血心肌造成二次损伤,即心肌缺血再灌注损伤。胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)是主要在骨髓细胞表达的重要衔接蛋白,在心肌缺血再灌注损伤中能够介导心肌细胞炎症反应、凋亡及自噬,可在炎症及免疫反应中充当调节器,从而参与心肌缺血再灌注损伤的发生发展。深入了解CARD9介导心肌缺血再灌注损伤的相关机制,或可为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新思路。

激活转录因子2、胱天蛋白酶9在结直肠腺瘤、结直肠癌中的表达及意义

目的探讨激活转录因子2(ATF2)、胱天蛋白酶9(caspase 9)在结直肠癌(CRC)、结直肠腺瘤(CRA)中的表达及意义。方法收集50例CRC患者的CRC组织及对应癌旁组织(距离病灶边缘10 cm以上)、30例CRA患者的CRA组织。采用免疫组化法检测不同组织中ATF2、caspase 9的表达情况,并分析其与临床特征的关系及二者的相关性。结果CRC组织中ATF2、caspase 9阳性表达率均低于CRA组织和癌旁组织,CRA组织中caspase 9阳性表达率低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。浸润深度为肌层以内、TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移CRC患者CRC组织中ATF2阳性表达率分别高于浸润深度为浆膜及浆膜外、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05);分化程度为高分化、TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移CRC患者CRC组织中caspase 9阳性表达率分别高于分化程度为中+低分化、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。Spearman相关分析显示,CRC组织中ATF2与caspase 9的表达呈正相关(r=0.418,P=0.003)。结论ATF2和caspase 9与CRA、CRC的发生和发展有关。

胱天蛋白酶募集域蛋白9的可溶性表达及纯化

目的 制备可溶性TrxA-CARD9蛋白及其临床突变型。方法 将构建好的原核系统表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞后,通过不同诱导条件筛选合适的表达条件。使用精氨酸辅助目的蛋白进行非变性溶解,并通过聚乙烯亚胺和硫酸铵沉淀法去除核酸和杂蛋白,最终利用阴离子交换和肝素亲和色谱柱纯化融合蛋白。结果 成功构建表达质粒并纯化融合蛋白,酶切去除TrxA标签后通过质谱鉴定其为可溶性CARD9蛋白。结论 成功实现了全长CARD9序列在原核系统中的高可溶性表达,为研究CARD9蛋白生物结构和功能提供了基础,并为寻找治疗真菌感染的潜在靶点和治疗方法提供新思路。

微RNA-223-3p调控NOD样受体热蛋白结构域3/胱天氨酸蛋白酶-1/白细胞介素-1β信号通路抗小鼠肝纤维化的作用及机制

目的探讨微RNA-223-3p(miR-223-3p)调控NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)/胱天氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白细胞介素-1β(IL-1β)信号通路抗小鼠肝纤维化的作用及其机制。方法将32只ICR小鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、miR-223-3p模拟物(miR-223-3p agomir)组和阴性对照miRNA模拟物(agomir-NC)组,建立四氯化碳小鼠肝纤维化模型。miR-223-3p agomir组和agomir-NC组于第4周末尾静脉注射miR-223-3p agomir及agomir-NC(给药剂量为每只200 nmol/L),每周给药3次,连续给药2周。分别比较4组小鼠血清总胆红素(TBIL)、白蛋白(Alb)、血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)表达水平,采用苏木精-伊红(HE)染色及马松(Masson)染色检测肝组织病理改变。采用基因本体分析(GO)、KEGG分析对miR-223-3p进行功能分析,采用Targetscan数据库对miR-223-3p的靶基因进行预测,实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白质印迹法(Western blotting)检测肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA及蛋白表达情况。结果与模型组相比,miR-223-3p agomir组血清TBIL[(24.32±3.24)比(62.21±4.52)]、Alb[(34.12±7.32)比(59.21±8.21)]、HA[(136.12±10.25)比(298.56±32.14)]、PCⅢ[(39.52±4.25)比(78.32±14.21)]、Ⅳ-C[(50.25±6.32)比(165.85±12.35)]表达均明显降低(P<0.05),小鼠肝组织损伤得到明显改善,浸润的炎性细胞明显减少,纤维化程度明显减轻。GO、KEGG富集及miRNA-mRNA-KEGG关联分析结果显示,miR-223-3p可在炎症、免疫等的59个生命进程中发挥作用。靶点预测结果显示NLRP3可能为miR-223-3p的反向靶点。与模型组相比,miR-223-3p agomir组小鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表达[(1.24±0.12)比(2.17±0.14)、(1.44±0.11)比(2.65±0.18)、(1.31±0.13)比(1.97±0.21)]及蛋白表达[(0.89±0.05)比(1.93±0.04)、(1.29±0.07)比(2.15±0.09)、(1.50±0.05)比(2.52±0.12)]水平均显著降低(P<0.05)。结论过表达miR-223-3p可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的激活,降低机体炎症反应,改善小鼠肝组织损伤,进而发挥其抗肝纤维化作用。

基于X连锁凋亡抑制蛋白/第二种线粒体衍生半胱天冬酶激活剂通路探讨尼莫地平对脑梗死大鼠神经功能的影响

目的基于X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)/第二种线粒体衍生半胱天冬酶激活剂(Smac)通路探讨尼莫地平对脑梗死大鼠神经功能的影响。方法以线栓法闭塞大鼠大脑中动脉诱导建立大鼠脑梗死模型,随机分为模型组、尼莫地平组(10 mg/kg)、AT-406组(XIAP抑制剂,7 mg/kg)、联合组(尼莫地平联合AT-406),每组12只,另取12只大鼠设定为假手术组,分别给药干预后,以Zea Longa分级法对各组大鼠神经功能缺损进行评分;以Morris水迷宫实验评测各组大鼠学习记忆功能通过比较其跨越原平台次数;以TTC染色检测各组大鼠脑梗死状况;以TUNEL染色评测各组大鼠海马神经元凋亡状况;以试剂盒检测各组大鼠血清促炎因子环氧化酶-2(COX-2)与白细胞介素-18(IL-18)含量;以蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑组织凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]与XIAP/Smac通路相关蛋白(XIAP、Smac)表达状况。结果与假手术组相比,模型组大鼠跨越原平台次数、脑组织Bcl-2与XIAP表达水平显著降低(P<0.05),神经功能缺损评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡比率、血清COX-2与IL-18含量、脑组织Bax与Smac表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组、联合组分别相比,尼莫地平组大鼠跨越原平台次数、脑组织Bcl-2与XIAP表达水平均升高(P<0.05),神经功能缺损评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡比率、血清COX-2与IL-18含量、脑组织Bax与Smac表达水平均降低(P<0.05)。与模型组、联合组分别相比,AT-406组大鼠脑组织跨越原平台次数、脑组织Bcl-2与XIAP表达水平均降低(P<0.05),神经功能缺损评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡比率、血清COX-2与IL-18含量、脑组织Bax与Smac表达水平均升高(P<0.05)。结论尼莫地平可通过上调XIAP表达,下调Smac表达,进而抑制炎症,减轻脑梗死大鼠海马神经元凋亡,提升大鼠学习记忆能力,改善其神经功能。

锰对人脐静脉内皮细胞及半胱天冬酶表达影响

目的探讨锰对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-304细胞生长周期及半胱天冬酶-3（caspas-3）、半胱天冬酶-8（caspase-8）表达的影响。方法以100～800μmoml／L）的氯化锰分别处理HUVEC-304细胞24～72h后，四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测EVC-304细胞的生长活性；流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡情况；蛋白印迹法（Western blot）检捌HUVEC-304细胞在，氯化锰半数抑制浓度（IC50）400μmol／L作用24h时caspase．8、caspase-3的表达。结果氯化锰可呈时间及剂量依赖性抑制HUVEC-304细胞的增殖和诱导细胞凋亡，抑制率为22．34％～90．94％，凋亡率为10．20％～98．73％。氯化锰24hIC50约为400μmol／L，在此浓度下。HUVEC-304细胞caspase-8、caspase-3表达显著增高。（P〈0．05）。结论氯化锰能够抑制HUVEC-304细胞的增殖。星明显的时效和量效关系。caspase-8、cas-pase-3表达增高在细胞增殖和凋亡中起重要的作用，可能是其作用机制之一。

抗肿瘤药物新靶点半胱天冬酶-10

细胞凋亡过程是依赖天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)产生的级联反应。半胱天冬酶-10是凋亡途径中关键的启动子,能够通过寡聚而自身切割活化,并能激活下游其他半胱天冬酶,参与细胞凋亡过程。半胱天冬酶-10基因突变及其它表达异常可导致细胞凋亡和增殖失调,从而参与某些肿瘤和免疫系统疾病的发生和发展。半胱天冬酶-10有可能是抗肿瘤药物的新靶点。

凋亡相关蛋白胱天蛋白酶与男性尖锐湿疣病情的相关性分析

目的分析凋亡相关蛋白胱天蛋白酶(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)与男性尖锐湿疣(CA)病情的相关性。方法收集2018年4月至2019年4月安徽省第二人民医院确诊的72例男性CA患者的皮损组织标本作回顾性分析。根据人乳头状瘤病毒(HPV)基因分型检测结果分为高危型组(n=38)和低危型组(n=34),收集同期于安徽省第二人民医院行包皮环切术的30例健康男性包皮组织标本作为对照组。采用免疫组织化学法检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9在三组标本中的表达情况。结果高危型组、低危型组标本的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白阳性表达率均低于对照组标本(13.16%vs.96.67%、44.12%vs.96.67%;10.53%vs.96.67%、38.24%vs.96.67%;7.89%vs.93.33%、35.29%vs.93.33%),且高危型组的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白阳性表达率均低于低危型组标本(13.16%vs.44.12%;10.53%vs.38.24%;7.89%vs.35.29%),差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论男性CA皮损组织中凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达均明显下调,且高危型男性CA较低危型男性CA下调更为明显。

早期激素性股骨头缺血性坏死模型的建立及半胱天冬酶3活性测定

背景:有研究表明骨细胞凋亡与激素性股骨头缺血性坏死的发病机制密切相关,而活化的半胱天冬酶3可作用于其他半胱天冬酶家族成员,使蛋白酶级联反应放大,最终导致细胞凋亡。但半胱天冬酶3参与的骨细胞凋亡与早期激素性股骨头缺血性坏死的相关研究则罕见报道。目的:采用大剂量激素联合强迫兔直立负重的方法建立早期激素性股骨头缺血性坏死模型并测定骨细胞半胱天冬酶3活性。方法:将4月龄新西兰大白兔随机分成模型组和对照组。模型组每周3次臀肌注射地塞米松,每日强迫兔直立1h,对照组注射等量生理盐水。分别于3,6,9和12周处死动物,取其双侧股骨头,光镜及电镜下观察组织病理学改变,应用对-硝基酰苯胺比色法测定骨细胞半胱天冬酶3活性。结果与结论:给药3周后,模型组光镜下可见脂肪细胞肥大和增多,骨髓间充质干细胞及造血干细胞数量相对减少;给药6周后,模型组空骨陷凹率均大于对照组(P<0.05);给药9周后,模型组出现骨小梁变细、断裂,电镜下见模型组部分骨细胞体积缩小,染色质浓集,核固缩和碎裂等凋亡特征。给药6周后,模型组骨细胞半胱天冬酶3活性高于对照组(P<0.05)。实验以此推论采用大剂量激素联合强迫兔直立负重可以诱导建立早期激素性股骨头缺血性坏死模型,半胱天冬酶3参与的骨细胞凋亡可能与早期激素性股骨头缺血性坏死发病过程有关。

胱天蛋白酶3介导BAG3蛋白剪切的研究

目的解析胱天蛋白酶(caspase)3介导BCL2结合抗凋亡基因3(BAG3)酶切的具体作用靶点,明确caspase 3裂解对BAG3抗凋亡作用的影响。方法采用生物信息学方法筛选BAG3蛋白序列中潜在caspase酶切位点;采用定点突变法构建潜在caspase酶切位点突变体;体外翻译野生型和突变型BAG3蛋白;利用重组caspase对野生型或突变型重组BAG3蛋白进行体外剪切实验;构建BAG3裂解片段的真核表达载体,突变型或片段BAG3表达载体转染SW1990细胞;利用Western blot检测各组细胞中BAG3蛋白的裂解情况;利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果在BAG3蛋白序列中存在K344EVD347和L515EAD518 2个潜在caspase酶切位点;caspase3可有效剪切D518A突变型BAG3,而不能剪切D347A突变型BAG3;D518A突变型和野生型BAG3同等程度抑制MG132诱导的细胞凋亡,D347A突变型BAG3对细胞凋亡的保护作用高于D518A突变型或野生型BAG3,而N末端和C末端剪切片段BAG3对MG132诱导的细胞凋亡无作用。结论 caspase3主要在D347位点裂解BAG3蛋白;BAG3在D347位点的剪切使其丧失了原有的抗凋亡作用。

凉血化瘀方抗肝细胞凋亡效应及对半胱天冬酶-3mRNA表达的影响

目的 研究半胱天冬酶-3(caspase-3)mRNA在内毒素肝损伤中的表达与肝细胞凋亡的关系,以及凉血化瘀方对其的影响。方法 腹腔注射内毒素脂多糖(Lipoplysaccharide,LPS)于D-氨基半乳糖(D-galactosamine, GalN)致敏的小鼠,造成暴发性肝衰竭(Fulminant Hepatic Failure, FHF)模型,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析caspase-3 mRNA表达,脱氧核苷酸转移酶介导的缺口原位末端标记技术(TUNEL法)、HE染色及透射电镜观察肝细胞凋亡情况,同时观察药物的影响作用。结果 造模3h肝组织caspase-3 mRNA明显表达,治疗组83%,模型组141%,6h二组表达水平接近。凋亡阳性细胞在6h表达最强,二组比较治疗组则明显减少(P<0.01)。结论 内毒素肝损伤中caspase-3 mRNA表达与肝细胞凋亡程度有相关关系,凉血化瘀方能延缓内毒素肝损伤肝细胞caspase-3 mRNA表达和抑制其凋亡效应。

瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡和半胱天冬酶-3表达的影响

目的观察瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马神经细胞凋亡和半胱天冬酶(Caspase)-3表达的影响。方法80只大鼠随机分为假手术(sham)、NS、REM2、REM6和REM20组,每组16只。NS、REM2、REM6和REM20组分别于缺血再灌注前静脉滴注0.9%氯化钠溶液及瑞芬太尼2、6、20μg.kg-1.min-1。采用双侧颈总动脉阻断+低血压法建立大鼠短暂性全脑缺血模型。于全脑缺血前30 min由靶控微量注射泵经股静脉注射瑞芬太尼,并于双侧颈总动脉阻断前及开放后10 min进行动脉血血气分析。再灌注后24 h,每组各取8只大鼠,取其新鲜海马组织,采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组Caspase-3 mRNA的表达。再灌注后72 h,取剩余大鼠,灌注取脑,制作脑组织切片,采用苏木精-伊红(H-E)染色和原位末端标记法(TUNEL法)观察各组大鼠海马退变的神经元数和凋亡细胞数,采用免疫组织化学法检测各组Caspase-3蛋白的表达。结果①H-E染色结果:sham组偶可见退变的锥体细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马退变的神经元数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6及REM20组海马退变的神经元数较NS组显著减少(P值均<0.05)。②TUNEL法检测结果:sham组未见TUNEL阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马CAl区的凋亡锥体细胞数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6和REM20组海马CAl区的凋亡锥体细胞数较NS组显著降低(P值均<0.05)。③免疫组织化学法检测结果:sham组可见少量Caspase-3免疫阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马区Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数较sham组显著增多(P值均<0.05),各瑞芬太尼预处理组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于NS组(P值均<0.05),REM6和REM20组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于REM2组(P值均<0.05)。④实时RT-PCR结果:sham组大鼠海马组织中Caspase-3 mRNA呈低水平表达,缺血再灌注24 h后,NS组及各瑞芬太尼处理组Caspase-3 mRNA的表达水平较sham组显著升高(P值均<0.05),REM6组Caspase-3 mRNA的表达较NS组显著降低(P<0.05)。结论瑞芬太尼预处理(以6μg.kg-1.min-1为佳)对全脑缺血再灌注后的神经元损伤具有一定的保护作用,其机制可能与抑制神经元凋亡及下调Caspase-3基因有关。

过氧化氢诱导乳鼠心肌细胞凋亡及半胱天冬酶-3抑制剂的作用

目的 观察外源性羟自由基对心肌细胞凋亡的诱导作用 ,并探讨其可能的信号转导通路 .方法 1利用培养的第 2代心肌细胞 ,随机分成 4组 ,在终浓度为 10 - 4 mol· L- 1 ,10 - 3 mol· L- 1 的过氧化氢 [一组加半胱天冬酶 - 3(caspase- 3)的抑制剂 (DEVD- FMK) 10 μmol· L- 1 ]无血清条件下培养2 4h.观察各组心肌细胞存活率 ,TU NEL 法检测凋亡 ,透射电镜观察细胞超微结构 ,流式细胞仪检测细胞的凋亡率 .结果 1外源性羟自由基对心肌细胞生长具有明显抑制作用 .2低浓度过氧化氢 (10 0 μmol· L- 1 )可诱导培养的心肌细胞发生凋亡 ,心肌细胞呈现特征性超微结构变化 ,TU NEL检测呈现黄绿色荧光 ,流式细胞仪 PI染色法呈现典型的亚二倍体峰 .高浓度时则主要致使心肌细胞坏死 .3caspase- 3抑制剂(DEVD- FMK)可阻断外源性 OH-对心肌细胞生长的抑制作用 ,降低心肌细胞的凋亡率 .结论 低浓度羟自由基能诱导心肌细胞凋亡 ,其信号转导通路包括 caspase-

益气养肺方干预肺癌化疗耐药的线粒体及半胱天冬酶机制

目的:研究益气养肺方对肺癌耐药细胞体外生长和多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨益气养肺方干预肺癌耐药的线粒体及半胱天冬酶机制。方法:采用体外培养肺癌耐药细胞株SW 1573/2R120,分别以益气养肺方和阿霉素作用于肺癌细胞,通过MTT法检测细胞毒作用,流式细胞仪检测MRP蛋白表达,共聚焦显微镜测定线粒体膜电位和胞内钙离子(Ca2+)浓度,酶标法测定半胱天冬酶Caspase-3和Caspase-8活性。结果:与正常对照组相比,益气养肺方组细胞抑制率明显增加,MRP蛋白表达降低,线粒体膜电位和胞内Ca2+水平下降,Caspase-3和Caspase-8活性增加。结论:益气养肺方具有干预和逆转肺癌耐药的作用,其分子机制可能与下调线粒体膜电位水平和上调Caspase-3、Caspase-8活性有关。

小鼠短暂前脑缺血海马中半胱天冬酶-3酶原表达的变化

通过测定脑缺血再灌注时海马中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)的表达变化,从细胞凋亡的角度探讨脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制及procaspase-3的活化机制.将C57BL/6N小鼠随机分为假手术组(正常对照组)、缺血再灌注组(I/R组),后者夹闭双侧颈总动脉20 min后再通血流,建立前脑缺血再灌注模型,分别于再灌注6 h、12 h、24 h和48 h取海马.采用蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测海马中procaspase-3的表达变化.结果显示,12 h I/R及24 h I/R组海马中总procaspase-3水平与假手术组相比有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05);24 h I/R组海马中去磷酸化水平与假手术组相比有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05);而各组procaspase-3磷酸化水平与假手术组相比差异无统计学意义.结果提示,脑缺血再灌注损伤诱发procaspase-3表达增加;其中procaspase-3去磷酸化水平高明显,提示脑缺血再灌注损伤可能诱发procaspase-3去磷酸化,继而促进procaspase-3转化为活性形式.