胱硫氨酸β-合成酶在食管胃结合部腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测胱硫氨酸β-合成酶(CBS)在食管胃结合部腺癌(AEG)中的表达,探讨CBS表达与肿瘤血管新生、临床病理特征及预后的关系。方法 选取经手术切除的243例AEG患者的蜡块标本制作病理芯片,采用免疫组织化学法检测癌组织及配对癌旁正常组织中CBS、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及微血管密度(MVD)的表达情况,分析CBS表达水平与VEGF及肿瘤MVD的相关性。探讨CBS表达水平与AEG患者的临床病理特征及预后的关系。结果 CBS在AEG患者的癌组织和配对癌旁正常组织中的阳性表达率分别为66.67%(162/243)和30.45%(74/243),两组比较差异有统计学意义(P<0.001)。CBS表达水平与T分期、淋巴结转移、吸烟史、VEGF表达及MVD均有关(P<0.05),而与患者的年龄、性别、分化程度、TNM分期及饮酒史无关(P>0.05)。CBS低表达患者的中位无病生存时间(DFS)为63个月,显著长于CBS高表达患者的50个月,差异有统计学意义(P=0.0039)。Cox多因素回归分析显示,CBS表达(HR=1.827,95%CI:1.146~2.912,P=0.011)、VEGF表达(HR=2.684,95%CI:1.637~4.401,P<0.001)、MVD(HR=4.064,95%CI:2.419~6.829,P<0.001)及TNM分期(HR=2.354,95%CI:1.523~3.638,P<0.001)是影响AEG患者DFS的独立因素。结论 CBS高表达可能与肿瘤新生血管相关,是AEG预后的不良因素之一,在AEG的诊治中具有潜在应用价值。

胱硫醚β-合成酶基因多态性及血浆同型半胱氨酸与新疆哈萨克族原发性高血压的关系

目的：探讨胱硫醚β-合成酶（Cystathione beta synthase，CBS）基因 T833C、G919A、844ins68多态性及血浆同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平与新疆哈萨克族原发性高血压（Essential Hypertension，EH）的关系。方法选择新疆哈萨克族 EH 患者118例（EH 组）和住院体检者108例（对照组），使用扩增阻滞实变体系法检测 CBS T833C、G919A、844ins68多态性，并采用酶标免疫吸附检测法检测血浆 Hcy 水平，化学发光法检测血浆叶酸、维生素 B12（VitB12）水平。结果EH 组血浆 Hcy 水平均高于对照组（P ＜0．05）。CBS T833C、G919A 纯合型、杂合型血浆 Hcy 水平高于野生型，且差异有统计学意义（P ＜0．05）。EH 组 CBS 基因第833位点 C 等位基因频率、第919位点 A 等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（CBS 833位点 C 等位基因：χ^2＝5．917，P ＝0．015；CBS 919位点 A 等位基因：χ^2＝5．917，P ＝0．020）。通过 Logistic 多元回归去除混杂因素后显示：年龄（OR＝1．120，P ＝0．000，95％ CI 1．077～1．165）、肥胖（OR ＝1．086，P ＝0．040，95％ CI 1．004～1．174）、高同型半胱氨酸血症（OR ＝1．099，P ＝0．039，95％ CI 1．005～1．203）是新疆哈萨克族 EH 的独立危险因素。结论血浆 Hcy水平与新疆哈萨克族 EH 相关。CBS T833C、G919A、844ins68基因多态性可能与新疆哈萨克族 EH 无关。

同型半胱氨酸及胱硫醚β-合成酶基因多态性与2型糖尿病合并冠心病的关系

目的探讨我国北方汉族糖尿病(DM)合并冠心病(CHD)者同型半胱氨酸水平(Hcy)及Hcy代谢相关酶胱硫醚β-合成酶(CBS)的844ins68的基因多态性特点。方法检测104例2型DM合并CHD患者(DM合并CHD)、127例2型DM患者、61例CHD患者和91名健康对照者的Hcy、叶酸、维生素B12、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A-I(apo A-I)、载脂蛋白B(apo B)浓度。应用聚合酶链反应(PCR)分析CBS 844ins68基因多态性。结果DM合并CHD组Hcy水平明显高于DM组和对照组,叶酸、维生素B12水平明显低于DM组及对照组(P<0.01)。DM合并CHD组与CHD组Hcy、叶酸、维生素B12水平差异无统计学意义(P>0.05)。DM组与对照组之间Hcy、叶酸、维生素B12水平差异无统计学意义(P>0.05)。4组CBS 844ins68的基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。Lo-gistic回归分析显示高Hcy水平、年龄、TC是CHD发生的独立危险因素,OR值[95%可信区间(CI)]分别为2.117(1.081～4.145)、1.105(1.070～1.142),1.023(1.005～1.042)(P均<0.05)。CBS 844ins68的OR值(95%CI)为1.254(0.229～6.867)(P>0.05)。结论高Hcy水平是我国北方汉族人2型DM合并CHD发生的独立危险因素。CBS 844ins68基因多态性不是2型DM合并CHD的危险因素。

同型半胱氨酸及胱硫醚β-合成酶844ins68基因多态性与急性脑梗死的关系

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)水平及胱硫醚β-合成酶(CBS)844ins68基因多态性与急性脑梗死的相关性。方法运用循环酶法和PCR方法检测300例急性脑梗死患者(病例组)及261例健康对照者(对照组)Hcy水平及CBS 844ins68基因型,并进行测序验证。结果病例组和对照组空腹血浆Hcy水平分别为(19.3±7.2)μmol/L和(15.1±4.9)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05),按卒中类型分层后比较,各卒中类型之间Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05);病例组CBS 844ins68 D/D基因型频率为98.7%,I/D型频率为1.3%,对照组分别为97.7%和2.3%,病例组和对照组I等位基因频率分别为0.7%和1.1%,两组基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05);病例组D/D和I/D基因型相应的Hcy水平分别为(17.3±6.4)、(20.0±13.4)μmol/L,差异无统计学意义(P>0.05)。logistic回归分析结果显示:在调整传统危险因素后,升高的Hcy水平与急性脑梗死发病有关,CBS 844ins68基因突变与脑梗死无关。结论血浆Hcy水平升高是急性脑梗死的独立危险因素;CBS 844ins68基因突变不影响Hcy水平,可能不足以构成急性脑梗死发病中的独立危险因素。

同型半胱氨酸和胱硫醚-β合成酶基因多态性与颅内动脉瘤的关系

目的探讨同型半胱氨酸和胱硫醚-β合成酶基因(CBS)844ins 68基因多态性与颅内动脉瘤的关系。方法运用多聚酶链反应技术和荧光偏振法(FPIA)检测76例颅内动脉瘤及143例正常人CBS 844ins 68基因多态性和血浆总Hcy水平。结果①AD组CBS844ins 68 D/D、D/I、I/I基因型频率(%)分别为78.95、19.74、1.31,对照组分别为对照组分别为78.32、18.88、2.80,CBS844ins 68各种基因型频率在患者组与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。②颅内动脉瘤病例组与对照组血浆Hcy分别为(16.14±6.72)μmol/L和(10.90±2.44)μmol/L,两者差异有统计学意义(P<0.05),颅内动脉瘤患者血浆总Hcy水平显著高于正常组。结论胱硫醚-β合成酶多态性与颅内动脉瘤无明显相关,高同型半胱氨酸血症与颅内动脉瘤病发生有一定关系。

同型半胱氨酸及其胱硫醚酶β-合成酶G919A基因多态性与颅内动脉粥样硬化性狭窄的相关性研究

目的探讨胱硫醚酶β-合成酶(CBS)G919A基因多态性与同型半胱氨酸(Hcy)及颅内动脉粥样硬化性狭窄的关系。方法对348例急性脑梗死患者行颅内血管MRA检查。采用PCR-限制片段长度多态性技术和扩增阻滞突变体系法检测患者CBS G919A基因多态性,并使用全自动生化仪采用循环酶法测定其血浆Hcy浓度。结果 348例急性脑梗死患者被纳入研究,其中合并颅内动脉狭窄186例,无颅内动脉狭窄162例。其中CBS G919A基因为纯合突变型(AA)33例(9.4%)、杂合突变型(GA)135例(38.8%)、野生型(GG)180例(51.7%)。纯合突变型患者血浆Hcy水平显著高于杂合突变型及野生型患者(t=9.15,P<0.05;t=8.67,P<0.05);杂合突变型患者血浆Hcy水平显著高于野生型患者(t=6.89,P<0.05)。狭窄组与非狭窄组基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(χ^2=1.29,P>0.05;χ^2=0.55,P>0.05)。结论 CBS G919A基因型与血浆Hcy水平相关,但与颅内动脉粥样硬化性狭窄无关。

同型半胱氨酸和胱硫醚-β合成酶基因多态性与Alzheimer病的关系

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)和胱硫醚-β合成酶基因CBS844ins68基因多态性与阿尔茨海默病(alzheimerdisease,AD)的关系。方法运用多聚酶链反应技术和荧光偏振法(FPIA)检测66例阿尔茨海默病及143例正常人CBS844ins68基因多态性和血浆总Hcy水平。结果AD组CBS844ins68D/D、D/I、I/I基因型频率(%)分别为78.79、19.69、1.52,对照组分别为78.32、18.88、2.8,CBS844ins68各种基因型频率在患者组与正常对照组之间的差异无显著性(P>0.05)。AD病例组与对照组血浆Hcy分别为(14.72±6.2)μmol/L和(10.9±2.4)μmol/L,两者差异有显著性(P<0.05)。AD患者血浆总Hcy水平显著高于正常组。结论胱硫醚-β合成酶多态性与AD无明显相关,高同型半胱氨酸血症与Alzheimer病发生有一定关系。

羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白2在细胞抗氧化中的作用及机制研究

目的探讨羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白2(LanCL2)在细胞抗氧化过程中的作用及相关机制。方法采用不同浓度(0、30、75、100、150、200μmol/L)的过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导处理人胚胎肾细胞(HEK293T)24 h以诱导氧化应激,通过蛋白质印迹技术检测LanCL2的表达;分别转染GFP、GFP-LanCL2过表达质粒至HEK293T细胞,在200μmol/L H_(2)O_(2)刺激条件下,通过PI/Hoechst 33342染色检测细胞死亡;向HEK293T细胞中转染Myc、Myc-LanCL2、Myc-GSTP1、Myc-LanCL2-His和GSTP1-His质粒,分别作为Myc组、Myc-LanCL2组、Myc-GSTP1组、Myc-LanCL2-His组(诱导纯化后)和GSTP1-His组(诱导纯化后),将未经任何处理的细胞作为Ctrl组,采用紫外分光光度计检测各组谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性及Myc组与Myc-LanCL2组的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性。结果与无H_(2)O_(2)刺激相比,在100、200μmol/L H_(2)O_(2)刺激后HEK293T细胞中LanCL2相对表达量升高(P<0.05);与GFP组相比,GFP-LanCL2组在200μmol/L H_(2)O_(2)刺激后细胞死亡率下降(P<0.01);Myc-LanCL2组GST活性与Myc组及Myc-GSTP1组相比,差异无统计学意义(P>0.05);与Ctrl组相比,GSTP1-His组具有较高的GST活性(P<0.001);而Myc-LanCL2-His组GST活性与Ctrl组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Myc-LanCL2组GPx活性与Myc组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论LanCL2能被氧化应激诱导,并减轻氧化应激介导的细胞死亡,但LanCL2不具有GSH依赖的抗氧化酶(GST和GPx)活性。

同型半胱氨酸代谢酶胱硫醚β-合成酶和N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与慢性肺源性心脏病的关系

目的了解血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平及其代谢酶胱硫醚β-合成酶(CBS)844ins68、N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因多态性与慢性肺源性心脏病(CPHD)的关系。方法选取2014年1月至2016年11月在新乡市第二人民医院住院治疗的CPHD患者230例作为观察组,另选取同期体检健康者235例作为健康对照组,应用肺功能仪进行肺功能检查,记录2组受试者的1秒用力呼气量占预计值百分比(FEV1%pred)、1秒用力呼气量占用力肺活量百分比(FEV1%);观察组患者于入院次日、健康对照组于体检日清晨抽取空腹肘静脉血,检测血浆Hcy、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;并提取全血细胞中的DNA,运用聚合酶链式反应技术进行基因分型,检测CBS 844ins68基因多态性,运用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术检测MTHFR C677T基因多态性。结果观察组患者的FBG水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组患者的Hcy、TG、TC和LDL-C均显著高于健康对照组(P<0.05),FEV1%和FEV1%pred均显著低于健康对照组(P<0.05)。观察组患者与健康对照组受试者的CBS 844ins68直接分型均可见2种基因型,其中观察组患者DD和DI基因型频率分别为91.74%和8.26%,D和I的等位基因频率分别为95.87%和4.13%;健康对照组受试者DD和DI基因型频率分别为94.04%和5.96%,D和I的等位基因频率分别为97.02%和2.98%,2组受试者基因型与等位基因频率分布比较差异均无统计学意义(χ~2=0.935、0.901,P>0.05)。观察组患者与健康对照组受试者的MTHFR C677T基因酶切后均可见3种基因型,观察组患者的CC、CT和TT基因型频率分别为21.31%、43.91%和34.78%,C和T的等位基因频率分别为43.26%和56.74%;健康对照组受试者的CC、CT和TT基因型频率分别为27.66%、48.94%和23.40%,C和T的等位基因频率分别为52.13%和47.87%,观察组患者TT基因型与T等位基因频率分布显著高于健康对照组(χ~2=7.730、7.326,P<0.05)。结论 Hcy水平升高可能是CPHD发病的危险因素之一;CBS 844ins68基因多态性可能与CPHD的发生无关;MTHFR C677T基因多态性可能通过影响Hcy代谢水平导致肺源性心脏病的发生,其T等位基因可能是CPHD的风险因子,MTHFRC677T基因可能是CPHD的遗传易感基因。

丰白散对COPD模型大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及超氧化物歧化酶的影响

目的通过观察丰白散对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)与超氧化物歧化酶(SOD)的影响,探讨丰白散治疗COPD的作用机制。方法采用烟熏加气管内滴加脂多糖方法复制COPD模型,用苏木素-伊红(HE)染色评估各组大鼠肺组织病理改变,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测γ-GCSmRNA表达水平,用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。结果模型组、丰白散组、沐舒坦组大鼠肺组织出现了符合人COPD的病理改变,COPD模型复制成功;与正常组相比,模型组大鼠肺组织γ-GCSmRNA表达水平、SOD活力均明显降低,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,丰白散组肺组织γ-GCSmRNA表达水平、SOD活力均增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论丰白散能增强COPD模型大鼠γ-GCS表达及SOD活力,纠正氧化/抗氧化失衡,增强抗氧化能力,这可能是丰白散治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制之一。

白三烯诱导人呼吸道上皮细胞氧化应激及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用研究

目的研究白三烯诱导人呼吸道上皮细胞内谷胱甘肽氧化还原状态变化及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用。方法将人气道上皮细胞分为对照组和暴露组。暴露组的人气道上皮细胞暴露于白三烯2、4、6、12 h。检测对照组及暴露组在2、4、6、12 h相应指标。测定气道上皮细胞内谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量;双酶法测定γ-GCS活性;RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达;Western-blot检测气道上皮细胞核和细胞质中γ-GCS蛋白表达;细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白表达。结果暴露组细胞2、4、6、12 h的GSH含量、GSH/GSSG比值先减少后逐渐增加,4 h最低,6 h达最高,12 h恢复正常;而GSSG含量则呈现相反趋势,与对照组之间差异有统计学意义。暴露组细胞2、4、6 h,γ-GCS活性增强,与对照组比较差异有统计学意义。细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白阳性信号主要分布在胞质中,暴露组呈强阳性表达,而对照组表达较弱,暴露组2、4、6 h时与对照组比较,差异有统计学意义。Western-blot检测结果相似。RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达,暴露组2、4、6 h时较对照组增加,差异有统计学意义。结论白三烯诱导氧化应激影响呼吸道上皮细胞谷胱甘肽氧化还原状态,而呼吸道上皮细胞通过提高γ-GCS活性对抗氧化应激,保持氧化还原稳定的状态。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、转化生长因子β1在吸烟大鼠肺组织中的表达

目的观察不同吸烟时间大鼠支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺组织中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA及其蛋白的表达水平以及二者的相关性,探讨TGF-β1在吸烟所致慢性阻塞性肺疾病(COPD)氧化/抗氧化失衡中的作用。方法自制大鼠实验性被动吸烟装置,建立吸烟引起COPD的动物模型,将40只大鼠随机分为不吸烟组、吸烟1月组、吸烟2月组、吸烟3月组,每组各10只。分别采用免疫组织化学法、免疫细胞化学法和原位杂交半定量技术检测支气管上皮细胞及肺泡巨噬细胞中γ-GCSh(重链亚单位)和TGF-β1mRNA及其蛋白的表达水平。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测肺组织匀浆中γ-GCSh和TGF-β1mRNA的表达水平。结果吸烟3月组大鼠出现了肺气肿的病理改变。①吸烟1月、2月和3月组大鼠支气管上皮细胞γ-GCSh和TGF-β1mRNA及蛋白表达水平、肺泡巨噬细胞γ-GCSh和TGF-β1蛋白表达水平明显高于不吸烟组(均P<0.01)。②吸烟1月、2月和3月组大鼠肺组织匀浆中γ-GC-Sh和TGF-β1mRNA表达水平明显高于不吸烟组(均P<0.05)。③吸烟1月组和吸烟3月组大鼠支气管上皮细胞γ-GCShmRNA及其蛋白的表达水平与TGF-β1表达水平呈直线正相关,肺泡巨噬细胞γ-GCSh蛋白表达水平与TGF-β1表达呈直线正相关;吸烟3月组肺组织匀浆中γ-GCShmRNA表达水平与TGF-β1表达呈直线正相关。结论随着吸烟时间的延长,支气管肺组织中γ-GCS和TGF-β1的mRNA及其蛋白表达水平逐渐增高,并且二者呈正相关;提示TGF-β1在吸烟所致COPD氧化/抗氧化失衡中可能发挥一定的作用。

人γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因E-box元件功能初步分析

目的:探讨人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列E-box元件的功能。方法:利用PCR法克隆人GCLC基因上游调控序列,PCR重叠延伸法对2个E-box元件分别和同时进行定点突变。扩增获得的突变体片段克隆入PMD18-T载体,DNA测序鉴定后,亚克隆入野生型GCLC-Luc荧光素酶报道载体。将3个突变体质粒和野生型质粒转染人肺泡上皮细胞A549和人支气管上皮细胞16HBE,检测转染后细胞荧光素酶活性值。结果:测序结果证实,成功将E-box1CACGGG突变为AGCGGG;E-box2CACGTG突变为CACGGA。GCLC-Luc、GCLC-mEbox1-Luc(突变E-box1)、GCLC-mEbox2-Luc(突变E-box2)、GCLC-mEbox12-Luc(突变E-box1和E-box2)转染A549细胞后荧光素酶活性值分别为(5197852±132206)U、(5455692±127431)U、(5315722±244197)U、(5174303±183179)U,转染16HBE细胞后荧光素酶活性值分别为(141157±18907)U、(126454±23724)U、(137315±22179)U、(132441±28970)U。经过统计学分析,各组荧光酶活性没有显著差别,均P>0.05。结论:E-box元件不参与基础状态下A549细胞和16HBE细胞GCLC基因转录调控。

人膀胱癌耐药细胞株原癌基因c-jun、c-fos表达与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及谷胱甘肽的关系

目的 研究原癌基因c jun和c fos的表达对谷胱甘肽介导的膀胱癌多药耐药的影响。 方法 应用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)和蛋白免疫印迹法 (WesternBlotting) ,检测c jun、c fos基因在人膀胱癌细胞株BIU87及其阿霉素诱导的多药耐药亚株BIU87/A的表达 ,并分析其与两株细胞的γ 谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ GCS)表达和细胞内谷胱甘肽 (GSH)水平的关系。结果 BIU87/A细胞γ GCSmRNA的相对表达水平明显高于BIU87(P <0 .0 5 ) ,与此相应 ,BIU87/A细胞内GSH水平也高于BIU87(P <0 .0 1) ;c jun基因mRNA及其蛋白在BIU87/A的表达均高于BIU87,而c fos基因在BIU87和BIU87/A的表达未见明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 原癌基因c jun上调γ GCS表达和GSH的合成可能是BIU87/A细胞多药耐药形成的重要机制之一 ,而c fos对BIU87/A的耐药形成可能不起主要作用。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和多药耐药相关蛋白基因在膀胱癌中的表达及相关性分析

为探讨 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ- GCS)及多药耐药相关蛋白 (MRPs)与膀胱癌化疗耐药的关系 ,应用逆转录多聚酶链式反应 (Rt- PCR)技术检测了 32例膀胱癌及其癌周正常膀胱粘膜上 γ- GCS亚单位 γ- GCSh、γ- GCSl以及 MRPs家族成员 MRP1 和 MRP2 的 m RNA的表达 ,并以 β- actin m RNA为内对照半定量进行相关分析。结果显示 :γ-GCSh、γ- GCSl、MRP1 和 MRP2 m RNA在癌组织的平均相对表达水平均高于其在正常粘膜的表达 ;γ- GCSh和 MRP1 在化疗复发病例的癌组织的平均表达水平明显高于在未接受过任何化疗的初发病例 ,同时显示两者在癌组织的表达具有较强的相关性 (r=0 .786 ,P<0 .0 1)。提示 :正常细胞的恶性化可上调 γ- GCS和 MRPs的表达 ;膀胱癌临床化疗耐药的形成与 γ- GCSh和 MRP1 的过表达密切相关 。

腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位表达的机制研究

目的:研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达的机制。方法:构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分析转录活性的变化;检测AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因调控序列的结合活性。结果:GCLC基因5’-上游调控序列报道系统检测结果显示大部分(9/11)缺失体的转录活性抑制,AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因的结合活性增强,而对应的功能元件的转录活性降低。结论:腺病毒E1A蛋白通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的转录活性,扩大大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡,其机制可能涉及E1A对辅助转录因子的抑制。

半胱氨酸合成酶与β-氰基丙氨酸合成酶活性检测

植物半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CSase)和β-氰基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,β-CAS)分别催化合成半胱氨酸(Cysteine,Cys)和β-氰基丙氨酸(β-Cyanoalanine,β-CA),它们在功能上冗余。本研究以山黧豆、苜蓿和玉米为主要材料,结合电泳对8种常见植物CSase和β-CAS粗酶活性进行了分析。结果表明,检测CSase活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为10min,最适pH均为8.0,底物O-乙酰-丝氨酸和Na2S最适浓度分别是10和5 mmol·L-1。检测β-CAS活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为30min,最适pH均在9~10范围内,底物Cys最适浓度均为3mmol·L-1,而底物KCN最适浓度前者为80mmol·L-1,后者为3mmol·L-1。8种植物中,CSase活性在种、种内组织间差别不是很大,但β-CAS活性则相反,尤其在茎叶和根中差别较大。

慢性阻塞性肺疾病大鼠NRF2和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的改变

目的:通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺内红系衍生的核因子2相关因子2(NRF2)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达,探索NRF2调控γ-GCS在COPD发病中可能的参与机制。方法:雄性Wistar大鼠16只,随机分COPD模型组和对照组。检测γ-GCS活性,γ-GCS的基因表达和NRF2的蛋白质表达。结果:γ-GCS活性在COPD组中明显高于对照组。γ-GCSmRNA广泛高表达于COPD组支气管平滑肌细胞,而对照组相应部位呈弱表达。对照组肺匀浆中有一定量γ-GCSmRNA表达,但相对于COPD组仍较低。NRF2、γ-GCS在COPD组支气管上皮细胞胞浆中高表达,而对照组相应部位中呈弱表达。COPD组γ-GCS和NRF2蛋白表达皆有明显上调。NRF2蛋白表达与γ-GCS蛋白、mRNA表达呈正相关关系。结论:氧化应激可能通过使NRF2转录活性增加的方式上调NRF2,进而上调γ-GCS的表达,在COPD的发病中起重要作用。

支气管哮喘豚鼠肺泡灌洗液中炎症细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达

目的探讨支气管哮喘豚鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达。方法38只健康雄性豚鼠随机分为对照组(A组)、哮喘组(B组)和地塞米松治疗组(C组),卵蛋白致敏法复制哮喘模型,收集BALF,行细胞计数和分类。离心,上清液行谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)浓度测定,细胞涂片行免疫细胞化学和原位杂交,检测γ-GCS蛋白和mRNA。结果B组嗜酸性粒细胞数(EOS)比例高于A组和C组,差异有统计学意义(P=0.000);γ-GCS免疫细胞化学B组A值最低,三组差异有统计学意义(P=0.047);γ-GCS原位杂交B组A值最低,三组差异有统计学意义(P=0.022);B组BALF中EOS比例与γ-GCS mRNA表达(A值)(r=-0.727,P=0.017)呈负相关;BALF中GSH和MDA浓度在三组间差别无统计学意义。结论哮喘组豚鼠抗氧化能力下降,抗氧化能力下降可能与炎症反应有关,糖皮质激素治疗有效。

PI3K/Akt-aPKC_(ι/ζ)-Nrf2调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达

目的:观察香烟烟雾提取物(CSE)是否通过磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt-不典型蛋白激酶Cι/ζ(aP-KCι/ζ)-核因子相关因子2(Nrf2)信号通路调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-γGCS)表达。方法:用Western blot法检测-γGCS、Nrf2、p-Akt和p-aPKCι/ζ蛋白质,细胞免疫化学法观察-γGCS蛋白质表达,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测-γGCSmRNA,免疫荧光法检测Nrf2蛋白质,流式分析法检测p-Akt阳性细胞率,双酶法测定-γGCS活性,酶循环分析法测定总还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果:暴露CSE 3 h,GSH含量显著升高,Nrf2胞核蛋白质、p-aPKCι/ζ蛋白质、p-Akt蛋白质及其阳性细胞率、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性均显著增强。aPKCι/ζ抑制剂RO813220明显减弱p-aPKCι/ζ蛋白质、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性表达,但增强Nrf2胞浆蛋白质表达,对p-Akt无影响。p-Akt抑制剂LY294002及RO813220+LY294002均降低p-aPKCι/ζ蛋白质、p-Akt蛋白质及阳性细胞率、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性表达,增强Nrf2胞浆蛋白质表达。直线相关性分析显示Nrf2与-γGCS、p-Akt及p-aPKCι/ζ呈正相关,p-Akt与Nrf2、p-aPKCι/ζ及-γGCS呈正相关,p-aPKCι/ζ与Nrf2、p-Akt及-γGCS呈正相关(P<0.05)。结论:CSE可能通过PI3K/Akt-aPKCι/-ζNrf2调节-γGCS表达。