硫化氢、同型半胱氨酸和环格列酮对胱硫醚-γ-裂解酶基因及蛋白表达的影响

目的:探讨硫化氢、同型半胱氨酸及环格列酮对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)基因及其蛋白表达的影响。方法:应用不同浓度的硫氢化钠(300、1 000μmol/L)、同型半胱氨酸(10、100、1 000μmol/L)及环格列酮(10、100μmol/L)作用于HUVEC,48 h后提取细胞总RNA,应用荧光定量PCR(realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR)及蛋白质印迹技术(Western blot)检测CSE基因和蛋白表达的变化。结果:硫氢化钠在生理浓度(300μmol/L)时可增加HUVEC CSE基因及蛋白的表达(P<0.05)。高浓度同型半胱氨酸引起HUVEC CSE基因及蛋白表达减弱(P<0.05)。环格列酮适宜浓度(10μmol/L)时也可增加HUVEC CSE基因及蛋白的表达(P<0.05)。结论:高浓度同型半胱氨酸对细胞水平上CSE的转录与翻译有抑制作用。从基因水平和蛋白质水平检测发现硫化氢和环格列酮可以调节CSE的转录与翻译,并可逆转高浓度同型半胱氨酸对CSE的作用。

重组同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的表达纯化及表征

目的研究以包涵体形式表达的重组同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的表达、纯化,对其活性进行检测并对其酶学性质进行表征.方法将同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的重组表达载体pET-15 b/rHCYase转化大肠埃希菌BL21中,进行优化大量表达.使用Ni^(2+)亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,再通过His-Trap脱盐柱脱盐,采用MBTH法检测目的蛋白活性,并对该酶进行了表征.结果重组蛋白在大肠埃希菌中可以高效表达,产量为204 mg·L^(-1),比活约206 U·mg^(-1).相对分子质量为45200.重组酶的最适反应温度为35℃,酶活性稳定的温度范围为20~35℃.重组酶的最适反应pH为7.5,4℃下在pH7.5的缓冲溶液中保温5h酶稳定性最高.结论成功克隆和表达了rHCYase蛋白,并得到高产高酶活的可溶性蛋白,对同型半胱氨酸检测试剂的开发有一定的潜在应用价值.

高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法在血清同型半胱氨酸含量检测中的应用

目的:比较高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法对血清同型半胱氨酸含量测定效果。方法:选取2013年12月-2015年9月于本院健康体检的体检者120例作为研究对象,将其分为高效液相色谱法组和L-蛋氨酸γ-裂解酶法组,每组60例。比较两组变异系数、回收率及准确度。结果:两组不同浓度批内和日间变异系数比较,差异均无统计学意义(P>0.05);两组不同浓度回收率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);两组检测同型半胱氨酸含量比较,差异无统计学意义(P>0.05),L-蛋氨酸γ-裂解酶法组检测准确率为99.24%,高于高效液相色谱法组的89.63%,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在同型半胱氨酸含量的测定中,两组检测稳定性无明显差异,相对高效液相色谱法而言,L-蛋氨酸γ-裂解酶法检测准确率较高。在临床检验中,可以根据检测工作需求选择合适的检测方法。

胱硫醚-γ-裂解酶产生的H_(2)S在小鼠脑缺血/再灌注损伤中的作用及与RhoA-ROCK_(2)信号通路的关系

目的探讨胱硫醚-γ-裂解酶产生的H_(2)S在脑缺血/再灌注(cerebral ischemia/reperfusion,I/R)损伤中的作用及与RhoA-ROCK_(2)信号通路的关系。方法采用双侧颈总动脉结扎制备小鼠脑缺血/再灌注损伤模型,激光散斑法检测脑血流量,HE染色法观察脑海马组织病理学变化,检测LDH、NSE、RhoA和ROCK_(2)活性及H_(2)S含量和ROCK_(2)蛋白表达。结果H_(2)S合酶CSE底物L-Cys(300 mg·kg^(-1))可明显促进脑I/R小鼠脑血流量的恢复,改善海马组织的病理损伤,抑制血清中LDH活性和脑组织中NSE、RhoA及ROCK_(2)活性的升高,并抑制血清H_(2)S含量的降低和脑组织中ROCK_(2)蛋白表达的增多。但L-Cys上述作用可被CSE合酶抑制剂PPG(50 mg·kg^(-1))明显地减弱;H_(2)S供体NaHS(4.8 mg·kg^(-1))也有与L-Cys相同的上述作用。结论CSE产生的H_(2)S对小鼠脑I/R损伤有保护作用,其作用可能与抑制RhoA-ROCK信号通路及增加脑血流量有关。

5,5′-二硫硝基苯甲酸柱前衍生高效液相色谱法测定酶促反应液中的L-半胱氨酸

以5,5′ 二硫硝基苯甲酸(DTNB)为柱前衍生试剂对酶促反应液进行衍生化,用C18色谱柱在室温下采用二元梯度洗脱,于330nm波长下检测,同时以2 巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)为对照,对L 半胱氨酸的分离峰进行确认,并对酶促反应液中的L 半胱氨酸进行分离测定。L 半胱氨酸浓度为5～950μmol/L时,其浓度与峰面积呈显著的线性关系。高、中、低浓度水平的L 半胱氨酸加标回收率为99 7%～100 5%,相对标准偏差小于1 3%,检测限为0 8μmol/L。方法简便、快速、可靠。用于样品分析,结果令人满意。

胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

通过PCR从大肠杆菌(E.coliK12)基因组DNA中扩增出胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-lyase,CBL)基因,构建了能高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)。重组菌在30℃、0.5 mmol.L-1IPTG存在条件下诱导9 h,可溶性CBL的表达量达18 mg.L-1,占到菌体可溶性总蛋白的23%。将重组菌超声破碎后上清液经His-Trap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBL,回收率为71%,纯度达到94%,纯化后的CBL单位酶活为134.6 U.mg-1。为防止CBL溶液冻融后发生聚沉,向纯化后的酶液中加入5%甘油,-20℃保存。重组酶的最适反应温度为35℃,酶活性稳定的温度范围为20～35℃。重组酶的最适反应pH值为8.0,4℃下在pH值8.0的缓冲溶液中保温10 h酶稳定性最高。重组酶的KmL-cystathionine值为3.78 mmol.L-1,VmaxL-cystathionine值为0.928 mmol.L-1.h-1。本研究建立了基于CBL催化反应产物丙酮酸与2,4-二硝基苯肼显色原理测定CBL酶活性的新方法。

L-蛋氨酸γ-裂解酶的研究进展

L-蛋氨酸γ-裂解酶是一种磷酸吡哆醛依赖型多功能酶,属于γ-蛋白家族。它能催化L-蛋氨酸及同型半胱氨酸的α,γ-裂解反应,被应用于肿瘤治疗及同型半胱氨酸血症的诊断。综述了蛋氨酸γ-裂解酶的来源,酶学性质,基因克隆与表达,酶的空间结构、活性位点及其应用,并对其在制备及应用中存在的问题和前景作了分析与展望。

一种L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒的构建及高效表达

目的:拟通过构建人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化表达产物,从而获得重组蛋氨酸裂解酶。方法:PCR法从人阴道毛滴虫的基因组中获得L-蛋氨酸γ-裂解酶获得L-蛋氨酸γ-裂解酶基因片段,并克隆至pGEX4T-2质粒,获得重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下,实现高效表达,表达产物经亲和层析纯化获得重组L-蛋氨酸γ-裂解酶。结果:表达产物进行SDS-PAGE检测,结果表明在相对分子质量68000处出现高浓度的GST融合蛋白,相对分子质量与预期大小相符;薄层扫描显示重组蛋白占总菌量的33.6%。结论:人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒构建成功,并成功地获得高效表达。

硫化氢／胱硫醚-γ-裂解酶系统在肺缺血／再灌注损伤中的作用

目的探讨硫化氢／胱硫醚-γ-裂解酶（H2S／CSE）系统在肺缺血／再灌注损伤（LIRI）中的作用。方法将40只SD大鼠随机均分成假手术组、LIRI组、NaHS组、炔丙基甘氨酸（PPG）组4组。制备在体大鼠单肺原位LIRI模型。NaHS组和PPG组分别于制模前腹腔注射NaHS 28μmol／kg或PPG30mg／kg；假手术组和LIRI组给予生理盐水0．5ml。实验结束后取血，检测血浆H2S浓度、超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）活性和丙二醛（MDA）含量；检测肺组织H2S含量、CSE活性和CSE mRNA表达水平；计算肺系数及肺泡损伤率（IAR）；并观察肺组织病理改变。结果与假手术组比较，LIRI组血浆和肺组织H2S水平、肺组织CSE活性和CSE mRNA表达均降低（均P〈0．01），血浆SOD降低，MDA、MPO升高（均P〈0．01）；肺系数、IAR增高（均P〈0．01）；同时LIRI组肺组织有明显的病理改变。与LIRI组比较，预先给予NaHS组血浆和肺组织H2S水平、肺组织CSE活性和CSE mRNA表达均升高（均P〈0．01），血浆SOD升高，MDA、MPO降低（均P〈0．01），肺系数、IAR降低（均P〈0．01）；同时肺组织病理改变减轻。而预先给予PPG组则相反，可加重LIRI所致的肺损伤（P〈0．05或P〈0．01）。结论H2S／CSE系统功能下调参与LIRI的病理过程，预先给予NaHS对肺组织有保护作用。

色氨酸及其肽对cis-syn型1,3-二甲基胸腺嘧啶二聚体的光敏化裂解作用

通过荧光猝灭实验和测定二聚体裂解程度的辐照实验 ,研究色氨酸 (Trp)及其二肽色氨酰苯丙氨酸 (Trp Phe)对cis syn型 1,3 二甲基胸腺嘧啶二聚体 (DMTD)的光敏化裂解作用 .结果表明 ,色氨酸及其二肽在较强光 (λ >2 90nm)辐照下 ,主要通过双光子电离生成的水合电子 (e-aq)导致二聚体裂解 ,其次 ,通过激发单重态与二聚体间的电子转移导致二聚体裂解 .另外一导致二聚体裂解的可能途径 :色氨酸残基激发三重态与二聚体间的电子转移光敏化二聚体裂解 .

胱硫醚-β-合成酶在SHR脑组织表达下调

内源性硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）由L-半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）及半胱氨酸转移酶催化作用下产生，它通过中枢机制参与调节心血管活动。高血压时脑内局部H2S浓度的改变可能参与了高血压的发病，自发性高血压大鼠（SHR）脑内CBS表达未见报道。本实验检测CBS在SHR脑组织的分布及表达，探讨其与高血压发病的关系。

胰岛素样生长因子-1对β-淀粉样前体蛋白裂解酶1的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme1,BACE1)的影响以及可能的细胞信号机制。方法:用不同剂量IGF-1(20、40 ng/ml和80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 24 h,荧光定量PCR及Western blot检测BACE-1mRNA及蛋白水平;Western blot检测淀粉样前体蛋白、C99、C83及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3-kinase/serine threonine kinase,PI3-K/Akt)通路相关蛋白的水平;ELISA检测细胞培养液中β-淀粉样蛋白42(β-amyloid peptide,Aβ42)的水平,然后选择最佳剂量的IGF-1(80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,在此之前30 min加入PI3-K抑制剂LY294002(25μmol/L及50μmol/L),重复上述检测。结果:IGF-1降低BACE-1、C99及Aβ42的水平(P=0.000),提高C83的表达(P=0.000),增加Akt的磷酸化(P=0.000),而LY294002具有抑制IGF-1的上述作用。结论:IGF-1降低BACE-1mRNA及蛋白的水平,其机制可能涉及PI3-K/Akt信号通路。

同型半胱氨酸与甲基代谢及其胱硫醚酶基因研究进展

同型半胱氨酸(HCY)水平增高是慢性血管疾病的独立危险因子,但HCY的来源不是从食物中吸取,其由蛋氨酸在甲基(CH3)循环代谢的中间产物。甲基化代谢亢进,再甲基化或转硫化代谢酶基因突变或功能障碍等原因均可造成甲基循环代谢失衡,从而导致HCY推积,患者出现高同型半胱氨酸血症(HHCY),动脉硬化等为特征的临床症状和体征。胱硫醚β-合酶(CBS)基因可将HCY转硫化成为胱硫醚,后者再经过胱硫醚-γ-裂解酶(CTH)裂解成丙酮酸、硫酸和水,达到有效降低HCY水平,降低动脉硬化进展,保障机体健康。本文综述近年来HCY代谢通路及其与心血管疾病的关系等的研究许多新进展。

硫化氢和同型半胱氨酸在动脉粥样硬化病变中的研究现状

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)性病变是目前世界上心血管疾病的发生率与死亡率高的首位原因,严重危害人们的生命健康安全。动脉粥样硬化主要累及大中动脉,是一种慢性复杂的累进型病理过称。高同型半胱氨酸血症(Hyperho-mocysteinemia,HHcy)是动脉粥样硬化形成的独立危险因子,它可以通过转硫基作用等转化成硫化氢,但是其致病机制尚未完全阐明。近年来,硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)因其在心血管健康和内稳态调节平衡方面的诸多积极性作用而受到重要关注。新近研究发现H2S在动脉粥样硬化病变过程中发挥重要作用。AS的发生发展与同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)和H2S存在一定的内在联系,本文拟对此方面的研究和认识作一综述。

痰热清联合N-乙酰半胱氨酸对老年AECOPD患者血清IL-33/sST2轴表达的影响

目的研究痰热清联合N-乙酰半胱氨酸对老年慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者血清白细胞介素-33(IL-33)/可溶性基质裂解素2(sST2)轴表达的影响。方法选取老年AECOPD患者122例,根据随机数字表法分为治疗组(61例)与对照组(61例)。治疗组加用痰热清联合N-乙酰半胱氨酸治疗,对照组仅予N-乙酰半胱氨酸治疗,两组均持续治疗7 d。比较两组患者治疗过程中不良反应发生情况,并比较两组治疗前后的肺功能指标、动脉血气指标、IL-33/sST2轴相关炎症细胞因子以及IL-33、sST2 mRNA和蛋白表达水平。结果治疗后,治疗组患者的IL-33、sST2 mRNA和蛋白均低于对照组,差异均有统计学意义(t分别=10.00、6.80、10.30、11.26,P均<0.05);治疗组患者治疗后的IL-4、IL-5、IL-10以及气道峰压(Ppeak)、呼气峰流速(PEF)、一秒用力呼气容积占用力肺活量(FEV1/FVC)水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t分别=17.95、7.55、7.79、6.59、7.06、7.34,P均<0.05);治疗组患者治疗后的动脉二氧化碳分压(PaCO_(2))低于对照组,而血氧饱和度(SaO_(2))、动脉血氧分压(PaO_(2))高于对照组,差异均有统计学意义(t分别=-5.02、11.40、7.12,P均<0.05)。结论痰热清联合N-乙酰半胱氨酸可明显改善老年AECOPD患者临床症状,延缓肺功能下降,利于病患预后的优化,疗效明显,其机制可能与抑制IL-33/sST2轴的活化及相关炎症因子释放有关。

外源性硫化氢对嗜铬细胞瘤细胞β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的观察外源性硫化氢(H2S)对嗜铬细胞瘤细胞(PC12)β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响,并探讨可能涉及的细胞信号机制。方法用不同浓度的硫氢化钠(NaHS)处理体外培养的PC12细胞,利用RT-PCR和Western blot法检测细胞内BACE1mRNA及蛋白表达;继以LY294002和PD98059分别阻断磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Ak)t及丝裂酶原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2(MAPK/ERK1/2)通路,Western blot法检测其对NaHS诱导的通路下游蛋白Akt1和ERK1/2磷酸化的影响及其对BACE1蛋白表达变化的调节;ELISA法检测细胞培养液中Aβ42水平的变化。结果 NaHS在实验浓度范围内呈剂量依赖性下调BACE1mRNA及蛋白表达,200μmol/L时最明显,各NaHS组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);LY294002抑制NaHS诱导的Akt1蛋白磷酸化,削弱NaHS对BACE1蛋白的下调作用,其表达在LY294002预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);而PD98059虽能抑制NaHS导致的ERK1/2蛋白磷酸化,但对其调节BACE1蛋白表达无影响,PD98059预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异无统计学意义(P>0.05);不同处理条件下的Aβ42表达与BACE1变化趋势基本一致。结论外源性H2S下调PC12细胞BACE1表达,其机制可能与PI3-K/Akt信号通路的激活有关,而与MAPK/ERK1/2通路无关。

侧脑室注射4,4＇-二异硫氰基芪-2，2＇-二磺酸对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

目的探讨侧脑室注射4，4’-二异硫氰基芪-2，2’-二磺酸（DIDS）对脑缺血再灌注（CIRI）大鼠脑组织损伤的保护作用及其机制。方法采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，侧脑室注射法给药。脑缺血2h再灌注24h后用Zea—Longa标准进行神经功能评分；红四氮唑溶液（TTC、染色法测定大鼠脑梗死面积；Westernblot法测大鼠脑组织B淋巴细胞瘤．2（B—celllymphoma-2，Bcl-2）和天冬氨酸蛋白酶．3（Caspase-3）两种蛋白的表达水平；试剂盒测定大鼠脑组织内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）的活性。结果100gmol／LDIDS侧脑室给药能改善大脑的神经功能，减少脑缺血面积，增加Bcl-2的表达，减少Caspase-3的表达，降低iNOS的活性。结论DIDS可以通过调节凋亡相关蛋白的表达以及降低iNOS的活性对大鼠神经细胞进行保护，减轻脑缺血再灌注损伤（CIRI）造成的脑组织损伤。

蒜氨酸通过CBS/CSE途径改善小鼠非酒精性脂肪肝病的研究

【目的】研究蒜氨酸对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)小鼠肝脏中胱硫醚-β-裂解酶(cystathionine-β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)表达的影响,阐释蒜氨酸改善NAFLD的作用途径,为临床药物研发提供科学依据。【方法】50只雄性C57/6J小鼠随机分为5组:正常组、模型组、硫氢化钠组、蒜氨酸组和蒜氨酸+PAG组(DL-炔丙基甘氨酸,DL-propargylglycine,PAG),每组10只。正常组饲喂普通饲料,其他4组饲喂高脂饲料。蒜氨酸组灌胃给予蒜氨酸20 mg/kg;蒜氨酸+PAG组灌胃给予蒜氨酸20 mg/kg,同时腹腔注射PAG 15 mg/kg;硫氢化钠组腹腔注射硫氢化钠2 mg/kg;正常组和模型组灌胃给予等剂量的蒸馏水,每天1次,每周称体重1次,预防给药6周后处死,观察肝脏形态学和病理学变化,检测血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL-C)的水平,Western blotting检测肝脏组织中CBS和CSE蛋白表达水平。【结果】与正常组相比,模型组小鼠体重显著增加(P<0.05),其他组小鼠体重无显著变化(P>0.05)。形态学观察显示,模型组小鼠肝脏偏黄无光泽,成花斑状,其他组小鼠肝脏表面光滑、质地均匀、颜色与正常组小鼠接近。肝脏病理学HE染色可见,正常组切片正常,模型组出现明显脂肪空泡和脂滴沉积,说明脂肪肝模型建立成功;与模型组相比,硫氢化钠组和蒜氨酸组均有明显好转;与蒜氨酸组相比,蒜氨酸+PAG组抗脂肪变性作用减弱。与正常组相比,模型组小鼠血清中TG、TC、LDL-C均显著升高(P<0.05),各给药组小鼠TC、TG、LDL-C相较于模型组显著降低(P<0.05)。与正常组相比,模型组小鼠CBS和CSE蛋白表达水平显著下降(P<0.05),硫氢化钠组和蒜氨酸组干预后CBS和CSE蛋白表达水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);与模型组相相比,蒜氨酸+PAG组小鼠CBS和CSE表达无显著差异(P>0.05)。【结论】蒜氨酸可明显增加高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏组织中CBS和CSE表达,改善血清中血脂各项指标,减少小鼠肝细胞脂质沉积,发挥保护肝脏作用。

高同型半胱氨酸血症与冠心病及临床处理

同型半胱氨酸又称为高半胱氨酸（Homocysteine，Hcy），是一种含硫氨基酸，主要来源于食物，体内不能合成。Hcy是甲硫氨酸代谢过程中的重要中间产物，本身并不参加蛋白质的合成[1-2]。在体内约一半的Hcy和甲基四氢叶酸在蛋氨酸合成酶（Methionine synthase reductase，MS）的作用下，生成蛋氨酸和四氢叶酸，四氢叶酸在N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetralydrofolate，MTHFR）的作用下生成甲基四氢叶酸；另一半Hcy通过转硫基途径，即Hcy与丝氨酸在胱硫醚β合成酶（Cystathioninel3．synthase，CBS）作用下形成胱硫醚，其中一部分在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸，最后生成丙酮酸、硫酸和水，此过程需维生素β。和丝氨酸羟甲基转移酶；另一部分则生成同型丝氨酸。