鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用

为建立快速检测鸭血清多杀性巴氏杆菌抗体的方法,将兔抗鸭IgG标记胶体金,喷涂金标垫,用浓度为0.2 mg/mL的荚膜和0.2 mg/mL羊抗兔IgG抗体分别作为检测线和质控线,制备了检测鸭多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条(D-CGTS)。特异性试验显示,仅鸭抗多杀性巴氏杆菌血清检测为阳性,阴性血清、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清的检测结果均为阴性,表明D-CGTS的特异性良好。敏感性试验结果显示,对效价1∶16(琼脂扩散试验)的鸭抗多杀性巴氏杆菌血清1∶320倍稀释后采用制备的试纸条检测结果仍为阳性,表明D-CGTS的敏感性较高。重复性试验结果显示,同批次的不同试纸条和不同批次的试纸条,检测阴性血清和鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的结果相同,表明D-CGTS的重复性好。对92份鸭血清采用D-CGTS和ELISA进行检测,结果显示,阳性符合率为94.03%,阴性符合率为100%,总符合率为95.65%。结果表明,制备的D-CGTS操作简单,具有较强的特异性、较高的敏感性和较好的重复性,适合在兽医临床推广应用。

检测鸡血清多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条的研制与应用

为建立快速检测鸡血清多杀性巴氏杆菌(Pm)抗体的胶体金免疫层析技术,本研究采用胶体金标记兔抗鸡IgG,制备金标垫,将重组脂蛋白B(rPlpB)和羊抗兔IgG抗体分别包被于硝酸纤维膜作为检测线和质控线,优化条件后组装成胶体金试纸条(CGTS)。结果显示,胶体金标记兔抗鸡IgG的最佳pH为8.5,最佳标记浓度为7μg/mL;rPlpB和羊抗兔IgG抗体的最佳使用浓度均为0.2 mg/mL。利用该方法检测SPF鸡血清,鸡Pm、鸡大肠杆菌、鸡沙门菌、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒阳性血清,结果显示仅鸡Pm阳性血清检测为阳性,其他均为阴性,表明CGTS的特异性强。将琼脂扩散(AGP)效价为1∶16的鸡Pm阳性血清2倍倍比稀释后以CGTS检测,结果显示1∶320倍稀释仍检测为阳性,表明CGTS的敏感性较高。检测鸡Pm阳性血清和SPF鸡血清时,同批次不同试纸条之间、不同批次之间均无差异,表明该方法的重复性好。对89份鸡血清采用CGTS和间接ELISA检测,结果显示,二者阳性符合率为91.5%,阴性符合率为100%,总符合率为94.4%。禽霍乱灭活疫苗免疫后14 d,66.7%的鸡采用该方法能够检出抗体阳性,免疫后21 d,所有鸡均检出抗体阳性。本研究首次基于rPlpB建立了检测鸡血清Pm抗体的CGTS方法,该方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好,适合在基层推广,为评价禽霍乱疫苗的免疫效果提供了可行技术。

qPCR和胶体金试纸条方法检测猫疱疹病毒感染的比较

本研究比较猫疱疹病毒(FHV-1)2种检测方法荧光探针qPCR和胶体金试纸在检测FHV-1时各自的优劣,并以PCR扩增FHV-1特异基因Glycoprotein B序列并测序的方法作为参比方法。采集107份疑似FHV-1感染样本,分别用3种方法进行检测,qPCR方法采用的是冻干型PCR-荧光探针法,胶体金试纸方法采用的是市场成熟产品,参比方法测序结果与GeneBank数据进行比对,确认样本是否为FHV-1。qPCR检出89例FHV-1阳性,18例FHV-1阴性,胶体金试纸条检出51例FHV-1阳性,56例FHV-1阴性,参比方法检出89例阳性,且基因序列比对确认为FHV-1。通过对比实验结果的分析,qPCR方法灵敏度为100%,胶体金试纸条方法灵敏度为57.3%,qPCR检测灵敏度明显优于胶体金试纸。

胶体金试纸快速检测肥料中禁限用杀虫剂的应用研究

当前最受关注的禁限用农药包括有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂,毒死蜱和三唑磷是一种高效、广谱的有机磷杀虫剂,对人体神经系统有较大危害;克百威是广谱高毒的氨基甲酸脂类杀虫剂,其氧化应激作用可引起明显的细胞毒性。同时,氨基比林类的氟虫腈由于对环境不友好亦被禁用。肥料是食品上游产业链的重要一环,而禁限用杀虫剂由于“效果好、见效快、价格低”等特点,且与肥料施用途径相同,因此常作为隐性成分被经销商或农户混配至肥料中。

免疫快速同步检测玉米中5种真菌毒素胶体金试纸条的构建和应用

玉米作为重要的粮食和饲料来源,容易受到多种真菌毒素的污染,给居民健康和养殖业造成严重的危害。本文优化了适合5种真菌毒素(黄曲霉毒素B1、伏马毒素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮)同时提取的样品前处理方法,并构建了5检测线胶体金试纸条,检测结果可以通过肉眼定性,结合Image J软件可以进行定量分析,并应用于实际玉米样品检测。结果表明,最佳提取条件为90%乙腈/水,涡旋20 min,样品的添加回收率为71.9%~113.3%,相对标准偏差为0.9%~7.5%;测定基质添加样品建立标准曲线,通过肉眼判定得到5种真菌毒素的消线值分别为80.0、1 000.0、100.0、400.0、200.0μg/kg;结合Image J软件提取多重检测试纸条的检测线灰度值,结果表明当AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的质量分数为8.0、20.0、10.0、40.0、20.0μg/kg时,各真菌毒素浓度对应的检测线显色值比空白对照显色值低。最后,通过检测11个实际玉米样品,结果表明部分玉米样品受到了不同程度的AFB1、DON和ZEN的污染。因此,本研究开发的免疫快速同步检测玉米中5种真菌毒素胶体金试纸条可以用于玉米中真菌毒素的现场快速筛查。

应用于RPA nfo反应产物结果可视化的胶体金试纸条制备与评价

旨在利用6-羧基荧光素(6-FAM)与6-FAM单克隆抗体、生物素与链霉亲和素之间的特异性结合,制备可用于nfo酶切割探针的重组酶聚合酶(RPA)反应产物结果可视化的胶体金侧向免疫层析试纸条(GICS)。通过杂交瘤法和诱生腹水法制备了高亲和力的6-FAM单克隆抗体(亲和力常数为5.38×10~9 L/mol),再运用高浓度NaCl破坏试验,确定了胶体金与6-FAM抗体的最佳标记pH值为8.0,最佳抗体标记量为12μg/mL,并使用模拟样本确定了最佳检测(T)线包被缓冲液为0.2 mol/L(pH值5.0)。然后使用RPA nfo反应产物作为实际样本,观察条带的深浅,最终确定在层析液为0.1 mol/L PB(pH值7.4)、T线包被1 mg/mL SA、反应液用量5μL及金标抗体用量10μL条件下,能实现试纸条最佳检测性能。自主研发的胶体金侧向免疫层析试纸条在加样5 min后能出现清晰的条带,与目前商品化试纸条的可视化判定结果一致,能替代现有的商品化试纸条,降低检测成本、缩短检测时间,对建立RPA nfo-GICS及RPA-CRISPR Cas12a-GICS检测方法奠定了基础。

非洲猪瘟病毒p54抗体胶体金试纸检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒（ASFV）p54抗体的胶体金检测方法，本研究原核表达并纯化了带有His标签的p54重组蛋白（aa51～aa183），胶体金标记后，喷涂玻璃纤维垫，分别以SPA和抗p54多克隆抗体作为检测线和质控线，制作ASFVp54抗体检测胶体金免疫层析试纸。检测结果表明，该试纸条的敏感性为200ng／mL，对ASFV抗体阳性猪血清具有高度特异性，与猪其他病毒抗体阳性血清无交叉反应。对141份猪血清样品进行比对检测表明，在ASFV感染早期，胶体金试纸优于OIE推荐间接ELISA检测方法；以western blot检测方法作为参照，该试纸条检测疫区临床阳性样品的符合率比OIEELISA高。表明本研究建立的ASFV抗体免疫层析检测方法具有特异性强、敏感性高等特点，在ASF防控中具有趣好的应用前景。

基于CCD的胶体金试纸条光电检测仪器设计及实验研究

为了将农残检测的胶体金试纸条检测结果数值化，设计了基于线阵CCD的光电检测仪器，用其进行现场检测。仪器设计包括光路和电路部分，其中电路部分使用FIFO芯片进行数据缓存，有效降低了开发成本；采用自动定位插槽的定位装置，用于提高检测目标定位的准确度。实验测定了系统的工作曲线及参数，精度可达1ng／mL，线性范围为1～20ng／mL，符合农残检测范围。

基于免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗的便携式光电型传感器

利用免疫竞争抗制原理制备检测盐酸克伦特罗的免疫纳米金试纸条,盐酸克伦特罗与CLB-BSA复合物竞争性结合胶体金上抗体的有限位点,从而使试纸条上的检测带显色减弱或消失。将显色后的试纸条插入自行研制的光电型传感器的测试孔内,根据反射光的强弱计算出克伦特罗的浓度。结果表明:用光电传感方法检测盐酸克伦特罗的线性范围为1～10μg/L,检出限为0.05μg/L,回收率为85.5%～96.0%。此光电型传感器检测克伦特罗具有简便、快速、灵敏、特异性强的优点。

检测兔出血症病毒抗体胶体金试纸条的研制及初步应用

利用免疫层析技术建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的方法,将胶体金标记重组RHDV VP60蛋白,抗VP60单抗A3C和金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)分别包被质控线(C线)和检测线(T线),通过检测强阳性、阳性、弱阳性、阴性血清优化试纸条制备条件,并验证其性能及与血凝抑制试验的符合率。结果显示,试纸条检测阳性血清时T线、C线颜色深度相同,强阳性血清T线比C线颜色深,弱阳性血清T线比C线颜色浅,阴性血清T线不显色、C线显色,检测强阳性、阳性、弱阳性、阴性血清与血凝抑制试验的符合率分别为93.75%、88.75%、91.25%、95.00%,总的符合率为91.54%;该试纸条具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,为兔病毒性出血症流行病学调查和抗体水平监测提供了有力的检测工具。

胶体金试纸快速检测食品中单增李斯特菌

制备单增李斯特菌(Lm)特异性单克隆抗体,研制胶体金试纸,快速检测食品中Lm。所研制的胶体金试纸具有较高的特异性,不与绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌同属菌及大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌异属菌发生交叉反应;对Lm纯培养物检测的灵敏度为3.9×105CFU/mL;4℃保质期在120d以上;对自来水、牛奶、生肉制品、蔬菜、冷冻虾仁和面包模拟样品检测的灵敏度为3.9×105CFU/mL。该试纸具有快速、敏感、特异的优点,可用于食品中Lm的快速检测。

一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研制

甲霜灵胶体金试纸条用于现场快速检测进出口蔬菜甲霜灵农药残留量。在对试纸条光谱测量分析的基础上,研制出一种基于图像测量的便携式甲霜灵试纸条显色分析仪器,该仪器集成了样品滴定、定时检测、显色度分析、身份认证等多种功能,实现了试纸条的自动检测、显色度数值分析和数据存储。实验测定了浓度为2-50 ng/mL的标准浓度甲霜灵农药滴定的试纸条,结果表明,浓度〈40 ng/mL时,显色度与浓度线性相关,而浓度〉40 ng/mL时,显色度差异不明显。

鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0—8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释）,将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1：10^3、1：10^3、1：10^5、1：10^3。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6%。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测。

基于侧流免疫层析技术制备胶体金试纸条检测莲子中黄曲霉毒素B_1的研究

目的基于侧流免疫层析技术制备一种适用于快速检测莲子中黄曲霉毒素B1(AFB1)的试纸条。方法利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,金颗粒标记单克隆抗体制成金标偶联物作为结合垫,特异性抗原(AFB1-BSA)和羊抗鼠Ig G二抗分别作为检测线和控制线。结果经组装测试,试纸条的灵敏度为2.5ng·m L-1,检测时间在10 min以内。在检测的23份莲子样品中,6份样品有AFB1,阳性样品经UFLC-MS/MS确证,试纸条假阳性和假阴性率为0。结论所制备的试纸条检测快速、操作简便、结果准确,适合大批量莲子中AFB1的现场检测。

检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条的研制

为建立水禽源细小病毒的快速检测方法,本研究采用纯化的小鹅瘟病毒(GPV)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,筛选到21株能够稳定分泌抗GPV的单克隆抗体(MAb),将1株MAb纯化后与胶体金结合,喷涂金标垫,与另一株纯化的MAb配对,制成检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条。特异性试验表明,鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒的检测结果均为阳性,猪细小病毒、1型鸭甲肝病毒、坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9N2亚型禽流感病毒、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒等的检测结果均为阴性。该方法对鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒的最低检出量分别为10^(4.7) ELD50/mL、10^(4.7)ELD50/mL和10^(5.7) ELD50/mL。重复性试验良好。对临床粪便样品的检测,该方法比PCR方法简单快速,但是存在漏检的情况。上述结果表明,本实验建立的方法可用于水禽源细小病毒病的初步快速筛查。

口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究

利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。

应用胶体金试纸条诊断方法检测牛结核病的试验

采用牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试验方法对贵阳周边及某县奶牛场共309头奶牛进行牛结核病检测,同时采用结核菌素（PPD）皮试进行对比试验,结果显示,该病的感染率为4.48%-6.47%,胶体金试纸条试验与PPD反应具有一定的符合率[75%（15/20）],采用生物统计分析,进行χ2检验,计算得χ2c=0.703,χc2〈χ20.05,显示两种试验差异极不显著。同时试验还证明了牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试纸条试验方法具有快速、简便、特异、敏感的特点,并且可作为PPD反应的辅助诊断方法。因此,该方法具有良好的应用前景。