性别差异对牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿关节炎模型的影响

目的构建雌性及雄性牛Ⅱ胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,比较性别差异对CIA模型关节及关节外表现的影响。方法选用雌性及雄性SD大鼠并注射牛Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂诱导CIA模型,评估各组大鼠的一般情况、关节炎指数、足肿胀度、血清炎症因子及纤溶酶原激活物抑制剂水平、脾指数、膝关节及踝关节病理、右后足爪骨破坏情况、肺间质病变情况。结果雌性CIA大鼠的关节炎指数在初次免疫后第21天较雄性CIA大鼠显著升高(P<0.05),但两组足肿胀度在观察的任一时间点均无显著差异(P>0.05);雌性CIA大鼠血清肿瘤坏死因子α、白介素1β和脾指数均较雄性CIA大鼠显著升高(P<0.05,P<0.001),纤溶酶原激活物抑制剂水平无显著差异(P>0.05);雌性CIA大鼠膝关节和踝关节病理的炎症细胞浸润及滑膜增生评分较雄性CIA大鼠显著升高(P<0.05),雌性CIA大鼠膝关节软骨损伤及右后足爪骨破坏程度均较雄性显著升高(P<0.05);雌性和雄性CIA大鼠均出现了肺间质炎症细胞浸润及轻度纤维化,但雌性比雄性的肺间质病变更重。结论使用SD大鼠构建的雌性及雄性CIA模型均能兼具关节炎及肺间质病变,但雌性CIA大鼠的病变程度更重,在使用CIA模型进行RA相关研究时应关注性别差异带来的影响。

C-末端Ⅱ型胶原和骨桥蛋白与绝经后女性退变性膝骨关节炎疼痛的相关性

目的 探究C-末端Ⅱ型胶原(CTX-Ⅱ)和骨桥蛋白(OPN)与绝经后女性退变性膝骨关节炎疼痛的相关性。方法 以2019年2月-2021年7月北京市朝阳区中医医院骨伤科收治的96例绝经后女性退变性膝骨关节炎患者为研究对象根据Kellgren-Lawrence分级将患者分为轻度组、中度组与重度组。收集3组患者血清,采用酶联免疫吸附法试剂盒检测血清CTX-Ⅱ、OPN水平。采用视觉模拟评分法(Visual analogue scale, VAS)与西部安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数评分(Western Ontario and McMaster University Osteoarthritis Index, WOMAC)评估3组患者疼痛程度。采用单因素方差分析法分析3组患者临床指标差异,采用Pearson法分析CTX-Ⅱ、OPN水平与其他临床指标的相关性,多元逐步回归模型分析影响VAS、WOMAC评分的临床因素。结果 3组患者随着患者症状加重,血清CTX-Ⅱ、OPN水平与VAS、WOMAC评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05),病程、年龄、绝经年龄、BMI差异无统计学意义(P>0.05)。血清CTX-Ⅱ、OPN水平与VAS评分、WOMAC评分均呈显著正相关(P<0.05),CTX-Ⅱ、OPN水平是影响VAS与WOMAC评分的临床指标。结论 CTX-Ⅱ、OPN水平升高与绝经后女性退变性膝骨关节炎患者疼痛呈显著正相关。

ATG5通过细胞自噬调控Ⅱ型胶原表达的实验研究

目的 探究自噬相关蛋白ATG5通过影响自噬功能调控软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达水平。方法 GEO数据库下载13例人软骨组织样本的转录组数据分析ATG5和COL2A1表达的相关性。雷帕霉素(Rapamycin, Rapa)和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1,BafA1)处理人软骨细胞C28/I2,Western blot及免疫荧光检测Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,COL2)的表达水平。构建人源COL2A1启动子质粒,双荧光素酶报告实验检测过表达ATG5对COL2A1启动子转录活性的影响。mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒动态监测过表达和敲低ATG5后自噬流的变化。Western blot检测过表达或敲低ATG5后Rapa及BafA1对COL2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平的影响。结果 GEO数据库相关性分析结果显示在人软骨组织中ATG5和COL2A1的mRNA表达呈现正相关;Rapa和BafA1分别显著促进和抑制C28/I2细胞COL2的表达(P<0.05);成功构建人源COL2A1启动子质粒,并用双荧光素酶报告实验证实过表达ATG5上调COL2A1启动子转录活性(P<0.01);自噬双荧光病毒处理后,过表达ATG5组LC3-GFP荧光淬灭(P<0.01),自噬激活;敲低ATG5后,LC3-GFP荧光增强(P<0.05),自噬抑制;Rapa促进过表达ATG5上调的COL2和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达(P<0.05),BafA1显示与Rapa相反的作用(P<0.05)。结论 过表达ATG5上调Ⅱ型胶原的表达,且ATG5调控Ⅱ型胶原的表达依赖于细胞自噬。

Ⅱ型胶原病诊治进展

Ⅱ型胶原病是由于COL2A1基因变异导致的一大类骨骼-软骨发育异常的疾病。COL2A1基因位于常染色体12q13.11-q13.2上,主要编码合成Ⅱ型胶原蛋白。COL2A1突变导致各种骨骼异常、口面部特殊体征和眼部、听觉损害,各类型疾病表现形式广泛,基因-表型相关性尚不明确。本文综述COL2A1突变导致骨骼-软骨发育异常的疾病临床表型和相关变异,同时对目前的诊治进展进行阐述。

清热养阴除湿汤对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠炎症因子的调节作用

目的:观察清热养阴除湿汤(QYCD)对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠的保护作用。方法:采用牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型,将24只CIA大鼠随机分为模型组(CIA组)、甲氨蝶呤组(0.625 mg/kg)、清热养阴除湿汤低剂量组(17 g/kg)、清热养阴除湿汤高剂量组(34 g/kg),每组6只,同时随机取6只大鼠作为正常对照组(Control组)。连续给药5周,每周观察大鼠足肿胀度及炎症指数;HE染色法观察大鼠踝关节组织病理形态学改变;micro-CT法观察骨破坏程度;ELISA法检测血清IL-4、IL-17A、TGF-β、IFN-γ水平;荧光PCR法检测脾脏组织T-bet mRNA、Gata-3 mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表达。结果:初次免疫后3周CIA组大鼠右后足关节肿胀程度高于Control组(P<0.05),5周时CIA组大鼠关节炎评分最高(P<0.05)。甲氨蝶呤(MTX)、低剂量清热养阴除湿汤(QYCD-L)、高剂量清热养阴除湿汤(QYCD-H)可以缓解大鼠足关节的肿胀程度(P<0.05),减轻炎症细胞浸润、滑膜增殖及软骨表面的侵蚀,CIA大鼠骨破坏在一定程度上被缓解。QYCD-L组、QYCD-H组大鼠血清IFN-γ、IL-17A水平均低于CIA组(P<0.01或P<0.05),而血清IL-4、TGF-β水平均显著高于CIA组(P<0.01)。QYCD-L组、QYCD-H组大鼠T-bet mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相对表达量均高于CIA组(P<0.05或P<0.01),但Gata-3mRNA相对表达量与CIA组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:清热养阴除湿汤能有效改善CIA大鼠关节炎症状,其机制可能与调节炎症细胞因子及其转录因子水平有关。

骨桥蛋白干预体外培养人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达

背景:骨桥蛋白基因和蛋白表达与骨关节炎的病变程度高度相关。目的:进一步验证骨桥蛋白对体外培养人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原mR NA表达的影响。方法:体外培养人膝骨关节炎软骨细胞。取第1代人膝骨关节炎软骨细胞,分为空白对照组、0.1 mg/L骨桥蛋白组和1 mg/L骨桥蛋白组。骨桥蛋白组加入重组骨桥蛋白0.1 mg/L或1 mg/L干预48 h;空白对照组未予任何干预继续培养48 h。用Real-time PCR测量蛋白多糖与Ⅱ型胶原的mR NA表达量。结果与结论:经0.1 mg/L与1 mg/L两种质量浓度骨桥蛋白干预后,人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖与Ⅱ型胶原mR NA表达水平显著上升(P<0.05),1 mg/L骨桥蛋白组人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖与Ⅱ型胶原mR NA表达水平高于0.1 mg/L骨桥蛋白组(P<0.05),人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖mR NA表达水平与骨桥蛋白干预质量浓度呈正相关(r=0.751,P<0.01)。人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原mR NA表达水平与骨桥蛋白干预浓度呈正相关(r=0.676,P<0.01)。结果提示骨桥蛋白上调人膝骨关节炎软骨细胞蛋白多糖与Ⅱ型胶原mR NA的表达,并具有浓度依赖性。

龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的:观察龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。方法:采用抽签法将168只4月龄雌性SD清洁级大鼠随机分为2组,手术造模组141只,假手术组27只。切除手术造模组大鼠双侧的卵巢和双侧膝关节的内侧副韧带和前交叉韧带,制造肝肾亏虚型骨关节炎大鼠模型;切除假手术组大鼠双侧卵巢附近的脂肪组织。每天驱赶实验大鼠1 h,连续驱赶4周。4周后分别从手术造模组与假手术组各取5只大鼠,采用HE染色和甲苯胺蓝染色法观察子宫与膝关节软骨的组织形态学变化,采用甲苯胺蓝染色法观察膝关节软骨基质中糖胺聚糖的表达情况,采用放射免疫法测定血清雌二醇浓度,鉴定大鼠模型。造模成功后将假手术组作为空白对照组(空白组),并将其分为干预2、4、8周的3小组,每组7只,留1只备用;采用抽签法将手术造模组随机分为6组,即模型对照组(模型组)、龟鹿二仙胶组(全方组)、龟甲鹿角组(龟鹿组)、龟甲鹿角人参组(龟鹿参组)、龟甲鹿角枸杞组(龟鹿杞组)、盐酸氨基葡萄糖对照组(盐酸氨基葡萄糖组),再分别将每组分为干预2、4、8周的3小组,每组7只,留10只备用。参照人与大鼠药物等效剂量换算公式,将龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞、盐酸氨基葡萄糖分别配成浓度为81 mg.mL-1、54 mg.mL-1、10.8 mg.mL-1、27 mg.mL-1、13.5 mg.mL-1的药液。各组大鼠均以10mL.kg-1体质量以各组药液灌胃,空白组与模型组以生理盐水灌胃;全方组以配成的龟鹿二仙胶混合液灌胃;龟鹿组以配成的龟甲胶和鹿角胶混合液灌胃;龟鹿参组以配成的龟甲胶、鹿角胶与人参混合液灌胃;龟鹿杞组以配成的龟甲胶、鹿角胶、枸杞子混合液灌胃;盐酸氨基葡萄糖组以配成的盐酸氨基葡萄糖溶液灌胃。每天灌胃1次,各组分别连续灌胃2、4、8周。药物干预结束后,从腹主动脉抽血后处死大鼠,取出的血经静置、离心后吸取上层血清,保存待检;取出大鼠右侧中下1/3段股骨,制备石蜡标本。采用放射免疫法检测大鼠血清雌二醇浓度,采用免疫组化染色法观察关节软骨中Ⅱ型胶原的表达。结果:①形态观察。手术造模组与假手术组大鼠的子宫与膝关节软骨的组织形态学变化显示手术造模组造模成功。②药物干预前血清雌二醇浓度和膝关节软骨基质中糖胺聚糖含量。药物干预前,手术造模组的血清雌二醇浓度明显低于假手术组[(87.130±39.720)ng.L-1,(195.080±42.449)ng.L-1;t=4.152,P=0.003];手术造模组的软骨基质中糖胺聚糖含量低于假手术组[(0.239±0.066),(0.597±0.053);t=9.457,P=0.000]。显示手术造模组造模成功。③药物干预后血清雌二醇浓度。用药2周后,各组间血清雌二醇浓度比较,差异有统计学意义[(204.082±50.995)ng.L-1,(80.191±29.921)ng.L-1,(129.583±48.763)ng.L-1,(121.223±51.514)ng.L-1,(117.582±50.131)ng.L-1,(128.181±45.987)ng.L-1,(114.479±39.346)ng.L-1;F=4.520,P=0.001]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.002,P=0.001,P=0.001,P=0.003,P=0.001);模型组低于全方组(P=0.039);其余各组间血清E2浓度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药4周后,各组间血清雌二醇浓度比较,差异有统计学意义[(204.819±53.802)ng.L-1,(91.613±32.654)ng.L-1,(148.727±51.860)ng.L-1,(146.576±32.976)ng.L-1,(145.225±49.217)ng.L-1,(146.365±45.800)ng.L-1,(132.197±46.032)ng.L-1;F=4.278,P=0.002]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.022,P=0.013,P=0.015,P=0.013,P=0.002);模型组低于全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组(P=0.027,P=0.027,P=0.037,P=0.027);其余各组间血清E2浓度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药8周后,各组间血清雌二醇浓度比较,差异有统计学意义[(192.060±57.040)ng.L-1,(97.504±40.006)ng.L-1,(183.140±50.887)ng.L-1,(130.757±39.285)ng.L-1,(167.763±32.878)ng.L-1,(158.112±48.309)ng.L-1,(112.494±46.687)ng.L-1;F=3.296,P=0.009]。组间两两比较,空白组高于模型组、龟鹿组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.011,P=0.001);模型组低于全方组、龟鹿参组、龟鹿杞组(P=0.002,P=0.005,P=0.012);全方组高于盐酸氨基葡萄糖组(P=0.010);其余各组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。④药物干预后膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量。用药2周后,各组间膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量比较,差异有统计学意义[(0.598±0.096),(0.226±0.113),(0.310±0.070),(0.310±0.072),(0.311±0.075),(0.296±0.081),(0.389±0.068);F=33.533,P=0.000)]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);模型组低于全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.007,P=0.006,P=0.006,P=0.021,P=0.000);全方组低于盐酸氨基葡萄糖组(P=0.008)。其余各组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药4周后,各组间膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量比较,差异有统计学意义[(0.603±0.083),(0.223±0.113),(0.387±0.090),(0.270±0.083),(0.371±0.059),(0.300±0.081),(0.442±0.067);F=37.064,P=0.000]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);模型组低于全方组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.011,P=0.000);全方组高于龟鹿组、龟鹿杞组(P=0.000,P=0.003)。其余各组间Collagen-Ⅱ表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药8周后,各组间软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量比较,差异有统计学意义[(0.608±0.067),(0.217±0.106),(0.437±0.065),(0.263±0.110),(0.380±0.073),(0.273±0.081),(0.443±0.068);F=42.071,P=0.000]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);模型组低于全方组、龟鹿参组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);全方组高于龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组(P=0.000,P=0.049,P=0.000);其余各组间Collagen-Ⅱ表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:在提高血清雌二醇浓度方面,龟甲胶与鹿角胶配伍人参或枸杞均是有效配伍,且用药2周时配伍人参和枸杞的效果要优于单独配伍人参或单独配伍枸杞。但随着用药时间的延长,龟甲胶与鹿角胶配伍人参提高雌二醇浓度的效果好还是配伍枸杞的效果好,还是龟鹿二仙胶全方效果好,仍需进一步研究证实。在促进膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原表达方面,人参和枸杞在龟鹿二仙胶方中发挥了不可缺少的作用。

胰岛素样生长因子1通过PI3K/Akt信号通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达

背景:采用生长因子等生物学方法修复退变椎间盘是目前椎间盘退变治疗的研究热点,胰岛素样生长因子1能促进髓核细胞增殖、促进功能性细胞外基质的合成,但其机制仍未阐明。目的:观察胰岛素样生长因子1对髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的促进作用,并探讨其信号转导机制。方法:分离培养人髓核细胞,取第3代细胞给予不同质量浓度的胰岛素样生长因子1(0,20,50,100,200μg/L)进行刺激,采用RT-PCR、Western-blot检测聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达。100μg/L的胰岛素样生长因子1作用于髓核细胞,采用Western-blot检测胰岛素样生长因子1对PI3K/Akt信号通路的激活作用,并通过LY294002的应用检测PI3K/Akt通路的抑制对聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的影响。结果与结论:(1)随胰岛素样生长因子1质量浓度增高,聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达水平逐渐升高,该作用呈剂量依赖性。胰岛素样生长因子1(100μg/L)能显著促进p-PI3K和p-Akt的表达(P<0.01),而LY294002能抑制胰岛素样生长因子1的促进作用(P<0.01);(2)胰岛素样生长因子1(100μg/L)能促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达(P<0.01),而LY294002能抑制胰岛素样生长因子1对聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的促进作用(P<0.01);(3)因此认为胰岛素样生长因子1可通过PI3K/Akt通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达。

Ⅱ型胶原修饰脱细胞真皮基质胶原膜修复关节软骨缺损

背景:前期实验发现,以小牛皮为原料的脱细胞真皮基质胶原膜修复软骨缺损,存在修复时间长、降解速度快等不足。目的:观察Ⅱ型胶原修饰后脱细胞真皮基质胶原膜修复兔软骨缺损的效果。方法:将新西兰乳兔软骨细胞接种于Ⅱ型胶原修饰脱细胞真皮基质胶原膜上,接种3,7,14 d进行扫描电镜观察。在24只新西兰大白兔双侧膝关节股骨髁部制作软骨缺损模型,随机分3组,空白对照组不作任何处理,对照组缺损部位植入软骨细胞-脱细胞真皮基质胶原膜,实验组缺损部位植入软骨细胞-Ⅱ型胶原修饰脱细胞真皮基质胶原膜,术后6,12周进行组织学Wakitani评分及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。结果与结论:1细胞在支架材料的内部生长良好,贴附较佳;2实验组术后6,12周的组织学Wakitani评分均低于对照组、空白对照组(P<0.05);3术后6,12周,实验组Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性最强,可见棕黄色颗粒分布于细胞质内;对照组也可见Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性,空白对照组未着色;4结果表明,Ⅱ型胶原修饰脱细胞真皮基质胶原膜可促进软骨缺损的修复。

大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达:失神经状态下Western blot方法测定

目的:揭示失神经骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律,探讨神经系统对骨折愈合机制的影响。方法:实验于2005-05/12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。40只SD大鼠按随机数字表法分成2组,每组20只。单纯左胫骨骨折组(胫骨骨折组),于左胫骨前弓状缘上0.3cm上1/3处咬断胫骨,从胫骨平台前缘插入一根直径0.8mm克氏针,制成胫骨骨折模型。T10脊髓完全性损伤并左胫骨骨折组(脊髓损伤并胫骨骨折组),在上述模型的基础上,横断切除T10段脊髓约0.3cm,制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型制备。分别于伤后1,2,4,5周采用Westernblot方法检测骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原的蛋白表达。结果:40只大鼠全部进入结果分析。伤后第1周,两组Ⅰ、Ⅱ型胶原均有表达,脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于胫骨骨折组;伤后第2周,脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达达到峰值,高于胫骨骨折组(39.45±0.99,29.45±0.85,aP<0.05);伤后第4周,胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值,高于脊髓损伤并胫骨骨折组(31.69±1.42,26.33±1.11,aP<0.05),脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达;伤后第5周,胫骨骨折组、脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅰ、Ⅱ型胶原表达下降(Ⅰ型胶原2组依次为:20.32±0.56,13.57±0.44;Ⅱ型胶原2组依次为6.34±0.21,12.58±0.44)。结论:神经系统可能通过调节Ⅰ、Ⅱ型胶原的分泌而影响骨折愈合。

鹿茸多肽对实验性膝骨性关节炎关节软骨中糖胺多糖和Ⅱ型胶原水平的影响

目的:检测膝骨性关节炎关节软骨中糖胺多糖和Ⅱ型胶原的水平及鹿茸多肽对其影响。方法:6月龄新西兰大白兔64只,随机分为正常组(8只)和模型组(56只)。模型组采用Hulth法造成膝骨性关节炎模型。造模成功后再将模型组随机分为鹿茸多肽组(24只)和对照组(24只),鹿茸多肽组给予鹿茸多肽稀释液0.5ml,每2日1次关节腔注射;对照组给予0.5ml生理盐水,每2日1次关节腔注射。分别于干预后第7、15、30天分3批取材,甲苯胺蓝染色观察两组关节软骨中糖胺多糖含量,免疫组织化学法观察软骨基质中Ⅱ型胶原的表达。结果:随着干预时间的延长,鹿茸多肽组和对照组软骨基质中糖胺多糖和Ⅱ型胶原表达量逐渐减少。鹿茸多肽组药物干预后第7、15、30天,Ⅱ型胶原阳性面积积分光密度值分别为(312.06±14.12)、(273.31±12.42)和(248.34±10.41),组间差异有统计学意义(P<0.05);对照组干预后第7、15、30天,Ⅱ型胶原阳性面积积分光密度值分别为(253.47±15.53)、(215.67±9.72)和(160.01±13.23),组间差异有统计学意义(P<0.05)。相同时间段内,鹿茸多肽组Ⅱ型胶原阳性面积积分光密度值高于对照组,组间差异有统计学意义。结论:鹿茸多肽通过阻止膝骨性关节炎关节软骨基质中糖胺多糖和Ⅱ型胶原含量的减少,一定程度上延缓关节软骨的退变。

大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白的表达:失神经状态下Western blot方法测定(英文)

背景:近年来大量的实验及临床观察均证实神经因素对骨折愈合有调节和支配作用。Ⅰ型胶原是促成骨细胞分化和增强成骨细胞黏附能力主要因素,是组成骨构架的基质蛋白;而Ⅱ型胶原由软骨细胞产生。目的:观察失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05/12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。材料:选用3月龄健康雄性SD大鼠40只,采用随机数字表法分为2组,单纯胫骨骨折组与脊髓损伤并胫骨骨折组各20只。方法:单纯胫骨骨折组大鼠于从左胫骨平台前缘插入1根φ0.8mm克氏针,制成胫骨骨折模型。脊髓损伤并胫骨骨折组在植备上述模型的基础上,横断切除T10段脊髓约0.3cm,制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型。主要观察指标:分别于伤后1,2,4,5周采用Western blot法检测两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ,Ⅱ型胶原的蛋白表达。结果:伤后第1周两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ,Ⅱ型胶原均有表达,脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于单纯胫骨骨折组(P<0.05);伤后第2周脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达量达到峰值,高于单纯胫骨骨折组(P<0.05);伤后第4周单纯胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值,高于脊髓损伤并胫骨骨折组(P<0.05),脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达;伤后第5周两组Ⅰ,Ⅱ型胶原表达量均下降。结论:失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ胶原的分泌规律与正常骨折愈合一致,区别在于各时间点尤其是在峰值点上表达量有明显差异。

Ⅱ型胶原变构肽鼻黏膜给药治疗胶原诱导性关节炎的实验研究

目的:研究以丙氨酸替换Ⅱ型胶原(collagenⅡ,CⅡ)263-272序列中的267、270、271位氨基酸的变构肽鼻黏膜给药对胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)的抑制作用及其作用机制。方法:以牛CⅡ免疫Lewis大鼠诱发CIA。于发病的当天开始给予CⅡ变构肽和原型肽鼻滴入治疗,连续每天给药,5d后,改为隔天给药,空白对照组给予磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)。观察关节肿胀情况,记录关节炎评分以及体重的改变。治疗结束后处死大鼠,行后踝关节病理切片,观察关节病理改变。ELISA方法检测血清中抗CⅡ抗体亚型以及细胞因子的变化,流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+T细胞的变化,荧光定量PCR检测脾和淋巴结中Foxp3和TGF-βmRNA的表达水平。结果:(1)CⅡ变构肽可以抑制CIA的发展。实验结束时CⅡ变构肽、原型肽以及PBS组大鼠关节炎评分分别为2.50±2.43、4.50±2.23和6.33±2.73(变构肽治疗组与PBS对照组比较,P<0.05),各组大鼠后踝关节病理学评分分别为1.33±1.07、2.17±0.94和2.83±0.58,与PBS对照组相比,CⅡ变构肽可以明显抑制CIA关节病变的发展(P<0.05)。(2)与PBS对照组相比,CⅡ变构肽可以降低CIA大鼠体内抗CⅡ抗体IgG2a亚型的滴度(0.56±0.19和0.95±0.29,P<0.05)。CⅡ变构肽、原型肽及PBS对照组大鼠血清中γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平分别为(185.33±29.77)、(231.62±41.82)和(220.64±83.61)ng/L,与原型肽组相比,CⅡ变构肽可以降低大鼠血清中IFN-γ水平。(3)CⅡ变构肽治疗对调节性T细胞的影响:3组大鼠外周血CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞比例差异无统计学意义,CⅡ变构肽治疗组大鼠脾和淋巴结中Foxp3和转化生长因子β(transforming growth factors β,TGF-β)mRNA的表达水平较对照组有升高趋势,但差异无统计学意义。结论:CⅡ变构肽鼻黏膜给药治疗可以抑制CIA的发展,CⅡ变构肽可能主要通过抑制CIA大鼠体内IgG2a型抗CⅡ抗体的产生,并降低血清中IFN-γ,从而抑制Th1型免疫反应而发挥治疗作用。

鸡Ⅱ型胶原双盲随机对照治疗类风湿关节炎的研究

目的观察口服鸡Ⅱ型(CCⅡ)胶原胶囊治疗我国活动性类风湿关节炎(RA)患者的疗效和安全性。方法采用随机、双盲双模拟、平行对照临床研究。共入选病例60例,口服鸡Ⅱ型胶原胶囊90μg/d,或甲氨蝶呤(MTX)10mg/周,疗程24周。其中5例患者被剔除,最后纳入统计共55例,MTX组29例,CⅡ组26例。结果口服CCⅡ能明显改善RA患者的休息痛、晨僵、压痛关节指数、肿胀关节指数、患者评价、日常生活能力、血沉和C反应蛋白(P<0.05),但对压痛关节指数、肿胀关节指数、关节功能、日常生活能力、血沉的改善不及MTX(P<0.05)。按国内抗风湿药疗效评价标准,两组在治疗12周时疗效差异无统计学意义,治疗18、24周时CⅡ疗效不及MTX(P<0.05)。ACR20%在12、18和24周时MTX组疗效较CⅡ组好(P<0.05);ACR50%在18周时MTX组疗效较CⅡ组好(P<0.05),但12和24周时两组差异无统计学意义。CⅡ组无因不良反应停药者,对肝、肾功能、血常规未见影响,胃肠道等不适反应明显低于MTX组(P<0.05),MTX组有1例患者因服药后转氨酶升高3倍以上而停药。结论口服CCⅡ治疗RA具有一定的疗效且不良反应较少,但总体疗效不及MTX。

Ⅱ型胶原预防和治疗骨关节炎的动物实验

目的:采用H ulth法对新西兰兔建立膝骨关节炎动物模型,以透明质酸钠及注射用生理盐水为对照,观察Ⅱ型胶原注射治疗兔膝关节炎的愈合效果。方法:实验于2002-02/2003-07在暨南大学医学院附属第四医院完成。取36只新西兰兔制备Hulth膝骨关节炎动物模型,随机等分为3组:实验组术前及术后每两周关节内注射1m L1%Ⅱ型胶原至12周。关节内注射透明质酸钠组和关节内注射生理盐水组分别于术前及术后每两周关节内注射1%透明质酸钠1m L,生理盐水1m L,以上各组于术后4,8,12周各处死动物4只,作标本手术显微镜观察和组织学检测。结果:①实验组与透明质酸钠组骨关节炎改变较生理盐水对照组明显减轻。②术后4周时,实验组软骨膜光滑,软骨细胞排列整齐,可见双核软骨细胞;关节内注射透明质酸钠组软骨膜也光滑,软骨细胞排列整齐;关节内注射生理盐水组软骨膜细胞增生,有裂隙,软骨层变薄,细胞排列不规则。术后8周时,实验组软骨膜细胞增生,有裂隙,软骨细胞层次减少,但排列尚规则;关节内注射透明质酸钠组的光镜改变基本与实验组相似;关节内注射生理盐水组出现软骨表面缺损及纤维化,软骨细胞层薄排列不规则。术后12周时,实验组、关节内注射透明质酸钠组的光镜改变与实验组术后8周时相似;关节内注射生理盐水组在其术后8周时光镜改变基础上有更广泛的软骨缺损,部分切片可见软骨下骨质暴露。结论:①Ⅱ型胶原与透明质酸钠匀能有效抑制骨关节炎。②外源性Ⅱ型胶原可以替代透明质酸钠应用于骨关节炎的防治。

骨关节炎早期的Ⅱ型胶原代谢产物

骨关节炎是以关节软骨渐进性破坏为特点的、普遍的致残性疾病。临床上需要一些早期即可以测量的、敏感的、特异性的标志物来诊断疾病。软骨的主要组成是Ⅱ型胶原,所以其合成和降解所产生的生物学标志物已成为研究重点。对关节滑液、血清、尿中的生物学标志物的检测可以早期诊断疾病、监测疾病的发展、了解机体对治疗药物的反应。Ⅱ型胶原合成的产物包括:Ⅱ型胶原C前肽、ⅡA型胶原N前肽。Ⅱ型胶原降解产物包括:Ⅱ型胶原C端肽、Ⅱ型胶原新抗原表位、Ⅱ型螺旋、单克隆抗体C2C结合肽段、可氰溴化的9.7肽段、Ⅱ型胶原-1和硝化的Ⅱ型胶原-1。本文仅对Ⅱ型胶原合成、降解所产生的生物学标志物与早期骨关节炎之间的关系加以阐述。

骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ,Ⅱ型胶原的影响

背景:研究表明,退变椎间盘细胞外基质的主要变化是Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量的减少和Ⅰ型胶原含量的增加。目的:观察腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白2基因(AAV-BMP-2)对兔退变腰椎间盘内髓核Ⅰ,Ⅱ型胶原的影响。方法:将12只新西兰大白兔L2-3,L3-4,L4-5,L5-6椎间盘针刺制造退变模型后随机分为3组,每组4只。其中AAV-BMP-2组兔椎间盘注射AAV-BMP-2,AAV组兔椎间盘注射不携带目的基因的空载体,生理盐水组兔椎间盘注射生理盐水,注射后第8周处死动物取其相应的椎间盘常规石蜡包埋,组织切片,以苏木精-伊红染色观察其髓核组织学变化,免疫组织化学法检测髓核组织Ⅰ型、Ⅱ型胶原表达并进行半定量分析。结果与结论:普通苏木精-伊红染色结果显示AAV-BMP-2组椎间盘内髓核细胞数目较多,呈单个或者簇状分布,髓核结构清晰,无纤维样组织填充。而AAV组和生理盐水组的组织结构相似,髓核内细胞数目少,髓核皱缩干瘪,细胞间为纤维样组织填充且排列紊乱。免疫组织化学染色显示:AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅱ型胶原的表达均高于AAV组和生理盐水组(P<0.05);AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅰ型胶原的表达均低于AAV组和生理盐水组(P<0.05)。结果说明,体内转染AAV-BMP-2能抑制椎间盘髓核细胞表达Ⅰ型胶原,促进椎间盘髓核细胞表达合成Ⅱ型胶原,提示维持椎间盘内胶原的含量、种类,可维持椎间盘内组织学的结构和形态,稳定髓核细胞生长环境,延缓椎间盘的退变。

骨关节炎患者血清中Ⅱ型胶原羧基端端肽的检测及临床意义

目的分析骨关节炎(OA)患者血清Ⅱ型胶原羧基端端肽(CTX-Ⅱ)含量与关节软骨损伤程度之间的关系,探讨CTX-Ⅱ在OA发病中的作用。方法采用酶联免疫吸附试验对膝OA患者59例(OA组)、膝关节其他疾病患者64例(非OA组)、以及69名正常健康者(正常组)血清中CTX-Ⅱ含量进行检测,并在关节镜下利用Outerbridge软骨损伤评分法对膝关节软骨损伤程度进行评价。结果经方差分析得三组总体血清CTX-Ⅱ含量有差异(F=20.982,P<0.05);经SNK两两比较可得:OA组与非OA组和正常组,血清的CTX-Ⅱ含量差异有统计学意义(P<0.05),即OA组血清含量CTX-Ⅱ均高于其他组;而非OA组与正常组血清CTX-Ⅱ含量差异无统计学意义。CTX-Ⅱ含量与Outerbridge软骨损伤累计评分作Spearman相关分析,123例膝关节疾病患者CTX-Ⅱ含量与Outerbridge软骨损伤累计评分呈正相关(r=0.64,P<0.01),OA组血清含CTX-Ⅱ量与Outer-bridge软骨损伤累计评分呈正相关(r=0.66,P<0.01);OA组中血清的CTX-Ⅱ含量与年龄、Outerbridge软骨损伤累计评分呈正相关(P<0.05)。结论血清中含CTX-Ⅱ量是综合反映膝关节软骨损伤累计程度的生物标志物,它主要受膝关节软骨损伤累计程度的影响。其含量在早期软骨损伤诊断方面有重要意义,提示软骨有损伤的危险因素,最终易导致OA的发生。

人Ad-BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞对其Ⅱ型胶原和碱性磷酸酶表达的影响

目的 :用人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad- BMP- 2 )转染兔骨髓基质干细胞 (BMSC) ,观察Ad- BMP- 2转染对细胞分化的影响。方法 :将 Ad- BMP- 2转染体外培养的兔 BMSC,7d后利用原位杂交和免疫组化方法检测细胞内 BMP- 2及 型胶原的表达 ,同时行碱性磷酸酶染色。结果 :BMP- 2和 型胶原原位杂交法显示实验组细胞胞浆中有棕黄色阳性杂交信号 ,对照组阴性。 BMP- 2和 型胶原免疫组化法显示实验组细胞胞浆棕黄色阳性着色 ,胞核阴性表达 ,对照组阴性 ;碱性磷酸酶染色见实验组细胞胞浆呈棕黑色阳性着色 ,可见细小的棕黑色颗粒 ,对照组染色阴性。结论 :Ad- BMP- 2可高效转染 BMSC,且促进其向成骨细胞和软骨细胞方向转化。

鸡Ⅱ型胶原对大鼠骨关节炎的防治作用

目的:评估鸡Ⅱ型胶原(chicken collagen typeⅡ,CCⅡ)对大鼠骨关节炎(osteoarthritis,OA)的防治效果。方法:参照Hayami的方法诱导大鼠OA模型。免疫组化法原位测定基质金属蛋白酶13及组织蛋白酶K水平,比较灌胃高剂量(80μg/d)与低剂量(20μg/d)CCⅡ及对照药布洛芬(10 mg/d)对大鼠OA模型关节软骨的形态学及生化改变的影响。实验分预防性研究与治疗性研究,预防性研究组,术后当日开始用药;治疗性研究组,从术后第7周开始用药;治疗时间均为8周。结果:治疗性灌胃CCⅡ不能完全阻止,但可显著延缓大鼠OA软骨降解,并能降低基质金属蛋白酶13和组织蛋白酶K水平,但远未达到正常水平。预防性灌胃CCⅡ对延缓软骨降解、降低基质金属蛋白酶13和组织蛋白酶K水平的效果比治疗性用药更佳,但仍未达到正常水平。布洛芬对软骨降解及基质金属蛋白酶13和组织蛋白酶K水平无明显影响。结论:CCⅡ可能成为治疗OA的药物。