胶原蛋白Ⅴ型2链对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭及肿瘤生长的调控作用

目的 探究胶原蛋白Ⅴ型2链(COL5A2)对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭及肿瘤生长的调控作用。方法 于2022年1―3月开展研究,基于TCGA数据库分析COL5A2在胃癌组织、正常组织中的表达差异,COL5A2对胃癌分期的作用及对病人预后的价值。荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白质印迹法(WB)检测正常人胃黏膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞MGC-803、MKN-45、SGC7901中COL5A2的表达。慢病毒介导稳定转染shRNA-COL5A2、shRNA、NC的MKN-45细胞。克隆形成实验、细胞计数试剂盒(CCK8)、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)染色检测细胞的增殖;碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期分布;Transwell实验、伤口愈合实验检测细胞的迁移、侵袭能力;裸鼠成瘤实验检测肿瘤的生长;免疫组织化学实验检测肿瘤组织PCNA蛋白。结果 胃癌组织COL5A2相对表达量为4.74±0.45,显著高于正常组织的2.53±0.26(P<0.05),与正常组织相比,胃癌组织中COL5A2升高,与病人临床分期、预后差有关。GES-1组COL5A2相对表达量为0.25±0.04,显著低于胃癌细胞中MGC-803组0.47±0.05、MKN-45组0.72±0.08、SGC7901组0.54±0.04(P<0.05),其中MKN-45升高幅度最大。与shRNA组细胞相比,shRNACOL5A2组细胞COL5A2表达降低,细胞的克隆形成数、在48、72 h的活性、EdU阳性率、迁移和侵袭数量、划痕愈合率均降低,细胞周期阻滞G1/S期,CyclinD1和CDK4表达降低(P<0.05)。异种移植裸鼠成瘤的体积、质量均降低,肿瘤PCNA表达也降低。结论 COL5A2在胃癌中高表达,下调COL5A2抑制癌细胞增殖、迁移侵袭及肿瘤的生长。

系统性硬化症患者皮损中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原的表达及其作用探讨

目的探讨Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原(Col Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ)在系统性硬化症(SSc)患者皮损中的表达、分布及其在发病机制中的作用。方法采用免疫组化SP法检测36例SSc患者(轻度纤维化9例,中度14例,重度13例)皮损中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原α1链〔α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)、α1(Ⅴ)〕的表达(以平均光密度值为半定量检测指标),并以6例正常皮肤作为对照。结果3种胶原在SSc皮损真皮呈弥漫性分布,在网状层可见深染的α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)团块或条带,α1(Ⅴ)分布则较均匀,在小血管和皮肤附属器周围较多;从对照到SSc轻度、中度、重度纤维化组,α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅴ)含量在真皮、小血管和附属器及其周围组织均呈逐渐升高趋势(P均<0.05);在SSc皮损真皮、小血管和附属器及其周围组织中,α1(Ⅴ)在早期即明显升高(80.07±1.80 vs 73.56±2.48,94.23±1.53 vs 85.73±1.70,94.06±1.64 vs 84.65±1.65,P均<0.01),持续整个纤维化过程且增幅较大,α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)升高则较迟,在中、后期显著升高。结论α1(Ⅴ)先于α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)在SSc早期即开始大量沉积,并持续整个纤维化过程;其含量改变始于真皮小血管和附属器及其周围组织,可能参与SSc血管炎的发生。

中国专业长跑运动员Ⅴ型胶原蛋白α1链基因多态性分析

目的:解析中国专业长跑运动员Ⅴ型胶原蛋白α1链(COL5A1)基因rs12722、rs13946多态位点,探讨COL5A1基因多态性与杰出有氧运动能力的关联性。方法:采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术解析rs12722、rs13946单核苷酸多态性在201名专业长跑运动员和337名对照组中的分布特征。结果:(1)COL5A1 rs12722基因型在专业长跑运动员中的分布频率与对照组相比无显著性差异,但马拉松组T等位基因频率显著高于对照组。(2)COL5A1 rs13946等位基因和基因型在专业长跑运动员中的分布频率与对照组无显著性差异。(3)rs13946和rs12722位点组成的TC单体型在5 km、10 km组中的分布频率显著高于对照组。结论:rs12722位点T等位基因与马拉松跑能力有关联。

正常人及圆锥角膜患者角膜中Ⅳ、Ⅴ型胶原的检测

目的观察正常人及圆锥角膜患者角膜组织中Ⅳ、Ⅴ型胶原的表达，探讨基底膜损伤在圆锥角膜病变中的作用。方法采用免疫组织化学ＳＡＢＣ法检测角膜组织中Ⅳ、Ⅴ型胶原的表达。结果正常角膜组织中Ⅳ型胶原表达在Ｂｏｗｍａｎ’ｓ层及Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ层，圆锥角膜患者Ⅳ型胶原表达也在Ｂｏｗｍａｎ’ｓ层及Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ层，但其阳性表达因角膜病变的程度不同而呈不同程度的减弱。Ｂｏｗｍａｎ’ｓ层的断裂呈波浪状，实质层排列不规则，局部可见瘢痕形成，Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ层膜破裂。角膜上皮、基质和内皮层未见明显的阳性表达，Ⅴ型胶原表达在Ｂｏｗｍａｎ’ｓ层及基质层，正常及圆锥角膜中无明显差异，但在圆锥角膜瘢痕区Ⅴ型胶原表达呈强阳性。结论Ⅳ型胶原是基底膜的主要胶原，Ｂｏｗｍａｎ’ｓ层的断裂导致圆锥角膜的发病过程，最终整个过程以瘢痕形成结束。

不同月龄肉羊肌内结缔组织中Ⅴ型胶原蛋白的特性

采用自然放牧条件下的6、9、12、18月龄乌珠穆沁羊,取其半腱肌(Semitendinosus,ST)和背最长肌(Longissimus dorsi,LD),提取并分离纯化肌内结缔组织中的Ⅴ型胶原蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、热变性温度和氨基酸组成分析,比较各月龄段肉羊不同部位中Ⅴ型胶原蛋白的特性。结果表明:Ⅴ型胶原蛋白主要由α1(Ⅴ)、α2(Ⅴ)、α3(Ⅴ) 3种亚基组成;ST和LD肌内结缔组织中Ⅴ型胶原蛋白的含量随着月龄的增长而增加,且各月龄间差异显著(P<0.05);在同一月龄段,ST肌内结缔组织中Ⅴ型胶原蛋白的含量高于LD;FTIR分析表明,各月龄段ST和LD肌内结缔组织中的Ⅴ型胶原蛋白均出现了主要吸收峰酰胺A、B及酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ;ST肌内结缔组织中Ⅴ型胶原蛋白的热变性温度随着月龄的增长而显著升高(P<0.05),但9、12月龄间无显著差异(P>0.05);LD肌内结缔组织中Ⅴ型胶原蛋白的热变性温度随着月龄的增长而升高,但9、12月龄及12、18月龄间无显著差异(P>0.05),其他月龄均差异显著(P<0.05);氨基酸组成分析结果表明,Ⅴ型胶原蛋白的总氨基酸、亚氨基酸及羟脯氨酸含量随着月龄的增长而呈上升趋势,且各月龄间有显著差异(P<0.05)。本研究解释了随着肉羊月龄的增加,其骨骼肌肌内结缔组织中Ⅴ型胶原蛋白的特性变化。

致敏大鼠成肌纤维细胞与Ⅲ型、Ⅴ型胶原表达关系的研究

目的 探讨致敏大鼠气道壁中成肌纤维细胞与Ⅲ型、Ⅴ型胶原的表达及成肌纤维细胞 (MF)在气道重建中的作用。方法 Wistar大鼠 3 2只 ,随机分为对照 4周组、8周组 ,致敏 4周组、8周组 ,每组 8只 ,并用卵白蛋白 (OVA)致敏并激发 ,制备致敏大鼠模型。对照组用生理盐水对照和激发。分别于激发 4周和 8周时取肺组织 ,用免疫组化法测定气道壁中Ⅲ型、Ⅴ型胶原和成肌纤维细胞、TGF β1的表达。结果 ①致敏 4周组和 8周组Ⅲ型胶原、Ⅴ型胶原和成肌纤维细胞的表达与对照 4周组和 8周组比较 ,差异均有显著性 (P均 <0 0 1) ;②致敏各组Ⅲ型、Ⅴ型胶原的表达与成肌纤维细胞的表达均呈显著正相关 (P均 <0 0 1) ;③致敏 8周组与 4周组比较 ,Ⅲ型、Ⅴ型胶原含量和成肌纤维细胞的表达显著增加 ,差异均有显著性 (P均 <0 0 1)。结论 哮喘气道重建过程中 ,有Ⅲ型、Ⅴ型胶原增生 ,成肌纤维细胞的过度表达 ,表明成肌纤维细胞促进了细胞外基质的形成 。

CollagenⅤ在推拿促进长期大负荷运动大鼠肌肉干细胞自我更新中的作用研究

目的:观察推拿对长期大负荷运动大鼠骨骼肌损伤修复、后肢抓力及CollagenⅤ表达的影响,探讨推拿促进大鼠肌肉干细胞自我更新的机制。方法:32只雄性SD大鼠随机分为空白对照组(C组)、长期大负荷运动组(E组)、长期大负荷运动+推拿组(ET组)、长期大负荷运动+假推拿组(ES组)。C组不做任何处理,E组、ET组和ES组进行4周大负荷跑台运动制备长期大负荷运动损伤模型;E组不予任何干预;ET组于每次运动后6h予以推拿干预;ES组于每次运动后6h仅予以抚摸干预。测定初始及4周后大鼠的体重和后肢抓力。末次干预后24h取大鼠两侧腓肠肌,采用透射电镜观察肌纤维超微结构变化;免疫组织化学染色检测CollagenⅤ表达水平;实时荧光定量PCR检测Col5a1和Col5a3 mRNA表达水平;Western Blot检测Pax7、MyoD和Myf5蛋白表达水平;双重免疫荧光染色检测Pax7与CollagenⅤ共定位。结果:与C组相比,E组、ES组和ET组大鼠后肢抓力增加值差异显著(P<0.01),E组和ES组超微结构均出现肌原纤维断裂等变化,E组和ES组CollagenⅤ、Pax7、MyoD、Myf5、Col5a1和Col5a3 mRNA以及Pax7与CollagenⅤ共定位表达显著降低(P<0.05);与E组相比,ET组后肢抓力增加值差异显著(P<0.05),超微结构表现良好,CollagenⅤ、Pax7、MyoD、Myf5、Col5a3 mRNA以及Pax7与CollagenⅤ共定位表达显著升高(P<0.05)。结论:推拿可通过上调CollagenⅤ表达,促进大鼠骨骼肌肌肉干细胞自我更新,从而加速修复长期大负荷运动诱发的超微结构损伤,增强肌肉力量。

Ⅴ型胶原蛋白a1链基因多态性与有氧耐力表型的关联性

目的:通过分析Ⅴ型胶原蛋白a1链(COL5A1)基因多态性与60名中国北方汉族女子专业长跑运动员机能指标的关联性,探寻预测有氧耐力表型的分子标记。方法:采用联合测试法测得无氧阈和最大摄氧量相关指标,肺功能仪测得肺功能相关指标。用PCR-RFLP分析COL5A1基因的rs13946、rs12722多态性。结果:1)rs12722位点:不同基因型运动员之间无氧阈摄氧量、无氧阈摄氧量相对值有显著性差异(P<0.05),TT型运动员显著大于CC和CT型。2)rs13946位点:该位点与有氧耐力表型以及肺功能之间无关联(P>0.05)。3)rs13946-rs12722单体型:携带TC单体型运动员的无氧阈摄氧量和无氧阈摄氧量相对值指标均显著高于非TC单体型运动员(P<0.025)。结论:1)COL5A1 rs12722 TT基因型可作为预测中国北方汉族女子长跑运动员无氧阈强度下机体氧耗量的分子遗传学标记。2)TC单体型可作为预测北方汉族女子长跑运动员无氧阈摄氧量及其相对值指标的分子遗传学标记。

Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白通过YAP核转位调节大鼠胰岛β细胞增殖的研究

目的探讨Yes相关蛋白(YAP)核转位对Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白包被的大鼠胰岛β细胞(INS-1细胞)增殖的影响。方法将INS-1细胞分为空白组(未包被胶原蛋白,正常培养)、对照组(包被40.00 mg·mL^(-1)的Ⅰ型胶原蛋白)和实验组(包被5.00 mg·mL^(-1)的Ⅴ型胶原蛋白),并培养48 h。用噻唑蓝法检测细胞的存活率,用PI流式细胞术检测细胞周期,用蛋白质印迹法检测YAP蛋白的表达情况。结果实验组、对照组和空白组的干预48 h后细胞存活率分别为(46.65±4.29)%、(112.90±3.20)%和(100.00±0.00)%,S+G2/M期比例分别为(30.51±1.05)%、(41.59±0.90)%和(36.15±1.08)%,细胞核中YAP相对表达水平分别为0.78±0.06、1.17±0.04和1.00±0.00,细胞质中YAP相对表达水平分别为1.15±0.02、0.78±0.05和1.00±0.00,实验组和对照组的上述指标与空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论Ⅰ型胶原蛋白包被培养促进YAP核转位,从而促进INS-1细胞增殖;而Ⅴ型胶原蛋白包被培养抑制YAP核转位,从而抑制INS-1细胞增殖。

Ⅰ型和Ⅴ型胶原的提取精制及其结构分析

目的 :从牛角膜提取精制Ⅰ型和Ⅴ型胶原 ,检测胶原的提取精制过程 ,分析其结构特点。方法 :提取在含有蛋白酶的乙酸溶液中进行 ;精制用不同浓度的NaCl溶液盐析 ;电泳分析胶原的制备过程和结构。结果 :在不同温度下提取的Ⅴ型胶原 ,其组分相对分子质量存在差异 ;部分Ⅴ型胶原分子可能存在二硫键结构。结论 :使用不同浓度的NaCl溶液进行多步盐析 ,可使Ⅴ型胶原与Ⅰ型胶原分开。

COL5A2在胃癌组织中表达及其对胃癌细胞增殖、侵袭能力的影响

目的:探讨Ⅴ型胶原蛋白α2(COL5A2)在胃癌组织中表达情况及其对胃癌细胞BGC823表型影响,并研究其相关影响机制。方法:收集手术切除的胃癌组织及相应癌旁正常组织各18例,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及Western blotting检测COL5A2表达差异。人胃癌细胞株BGC823转染siRNA,敲低COL5A2基因在细胞中表达量,通过qRT-PCR及Western blotting验证转染效率。通过克隆形成实验检测各组细胞增殖变化,Transwell检测细胞侵袭变化,Western blotting检测细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白MMP9、Wnt、β-catenin表达。结果:与癌旁正常组织相比,胃癌组织中COL5A2蛋白表达增高(P<0.05)。沉默COL5A2表达后,BGC823细胞增殖及侵袭能力均降低(P<0.05),且MMP9、Wnt、β-catenin蛋白表达量均下调(P<0.05)。结论:COL5A2蛋白表达在胃癌组织中表达上调,并且可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌细胞增殖及侵袭。

COL5A2在胃癌组织中的表达及其与患者预后的关系

目的探讨Ⅴ型胶原蛋白α2(COL5A2)基因在胃癌(GC)组织中的表达及与患者预后的关系。方法使用Oncomine数据库分析COL5A2基因在GC组织的表达;通过cBioPortal数据库探寻COL5A2基因突变情况;利用Kaplan-Meier Plotter平台绘制COL5A2 mRNA表达水平与GC患者预后的生存曲线;使用GEPIA数据库对COL5A2基因在GC中的表达及临床预后关系进行验证;采用GeneMANIA数据库分析COL5A2基因-基因互作网络,并进行功能富集分析。通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测4种GC细胞株(HGC-27、MKN-45、BGC-823和SGC-7901)COL5A2 mRNA的表达水平;用小干扰RNA(siRNA)抑制HGC-27细胞COL5A2基因的表达,将细胞分为转染NC si-RNA的阴性对照组(si-NC组)和转染COL5A2 siRNA的转染组(si-1、si-2和si-3组),最后通过CCK-8和细胞克隆实验检测COL5A2基因下调对GC细胞增殖的影响。结果数据库分析显示COL5A2基因在GC组织中高表达,且与GC患者的肿瘤分期呈正相关;cBioPortal数据库研究发现COL5A2基因在GC中的突变率为10.36%,并且COL5A2基因突变组比非突变组总生存期更长;生存曲线分析表明高COL5A2 mRNA表达与GC患者较差的临床预后显著相关;此外,通过GeneMANIA数据库探索发现COL5A2基因与COL5A1、BMP1、ITGA1等20种基因互作调控,主要与细胞外基质受体交互、骨骼系统开发以及肽交联等有关。qRT-PCR检测结果显示,COL5A2 mRNA在HGC-27和MKN-45细胞株中显著高表达;HGC-27细胞经过下调COL5A2基因表达后,与si-NC组相比,si-1和si-2组的细胞增殖能力以及克隆形成能力均明显下降。结论COL5A2基因在GC组织和细胞中高表达,与患者的肿瘤分期和不良预后密切相关,COL5A2基因突变患者预后较好,且COL5A2基因与细胞外基质受体交互、骨骼系统开发、肽交联等有关,下调COL5A2基因的表达可抑制GC细胞的增殖和克隆形成能力,因此COL5A2基因有望成为治疗GC的潜在新靶点。

大鼠胰岛细胞的分离纯化及培养

目的 探讨大鼠胰岛细胞分离纯化和培养的方法。方法 采用胰导管逆行灌注Hanks液分离成年大鼠胰岛,Ⅴ型胶原酶消化,不连续密度梯度Ficoll 4 0 0纯化胰岛。用台盼蓝和双硫腙染色检测胰岛活性和纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。结果 胰岛细胞的收获量为5 4 0±15 0个胰岛 胰腺,活性>90 % ,纯度>90 % ,高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激的2倍多。结论 胰导管灌注Hanks液,Ⅴ型胶原酶消化和不连续密度梯度葡聚糖纯化胰岛,可以获取数量多。

人骨髓基质干细胞体外诱导为成骨细胞的实验研究

目的 探讨人骨髓基质干细胞 (hBMSC)体外诱导为成骨细胞的适宜条件。方法 hBMSC体外分离、培养、鉴定 ,观察应用 β 甘油磷酸钠 (10mmol/L)、地塞米松 (10 -8mol/L)干预后hBMSC的生长情况、形态学特征、ALP染色、VonKos sa染色和Ⅰ、Ⅴ型胶原mRNA表达情况。结果 诱导后的hBMSC呈多种形态外观 ,ALP染色、VonKossa染色、Ⅰ和Ⅴ型胶原mRNA阳性表达。结论 人骨髓基质干细胞在体外适当条件下可诱导为成骨细胞 ,适当浓度的 β

miR-29a-3p/COL5A2信号轴对胃癌细胞耐药性的影响

目的:探究miR-29a-3p与胶原蛋白Ⅴ型2链(COL5A2)的靶向作用关系,以及它们对胃癌细胞MKN-28阿霉素耐药性的影响。方法:通过数据库查询胃癌组织中COL5A2的表达水平与癌症不同分期以及预后的相关性;检测miR-29a-3p在胃癌组织中的表达,并利用双荧光素酶报告基因分析COL5A2与miR-29a-3p的靶向关系;将miR-29a-3p mimics/inhibitor转染胃癌MKN-28细胞,利用不同浓度阿霉素处理,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞活力,并观察其对相关耐药蛋白的影响。结果:胃癌组织中COL5A2的表达水平显著高于正常组织(P<0.01),且随着肿瘤进展COL5A2表达增加,患者生存预后较差;荧光素酶报告结果显示miR-29a-3p靶向抑制COL5A2表达;MKN-28转染miR-29a-3p mimics和miR-29a-3p inhibitor后,与对照组相比miR-29a-3p mimics组细胞活力降低,COL5A2表达降低(P<0.05),相关耐药蛋白Pgp、MDRA1、HSP、GST表达下降(P<0.05);miR-29a-3p inhibitor组COL5A2表达增加(P<0.05),耐药蛋白Pgp、MDRA1、HSP、GST表达增加(P<0.05)。结论:与正常组织相比胃癌组织中COL5A2高表达,且随着癌症进展COL5A2表达增加,患者预后较差;miR-29a-3p能够通过靶向下调COL5A2的表达降低胃癌细胞MKN-28对阿霉素的耐药性。

COL5A2在乳腺癌中的表达及其与预后和免疫微环境的关系

目的 探究Ⅴ型胶原蛋白α2(COL5A2)在乳腺癌组织中的表达及其与预后和免疫微环境的关系。方法 选取2017年1月至2020年12月于徐州市肿瘤医院行乳腺癌切除术治疗的164例乳腺癌患者作为研究对象,经手术获得其乳腺癌组织和癌旁正常组织样本。免疫组化分析组织中COL5A2的表达及其与患者临床病理特征和免疫微环境的关系;Kaplan-Meier法分析两组患者的预后情况;多因素Cox比例风险回归分析影响患者预后的因素;构建列线图模型并评价其预测效能。结果 乳腺癌组织中COL5A2阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P<0.05);COL5A2表达与患者的组织学分级、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05);COL5A2高表达组患者2年无进展生存率和2年总生存率均明显低于COL5A2低表达组(P<0.05);肿瘤直径≥2cm、临床分期Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移、COL5A2高表达是影响患者2年无进展生存率和2年总生存率的危险因素(P<0.05),术后新辅助化疗是患者2年无进展生存率的保护因素(P<0.05);列线图模型的区分度较高,准确性和有效性较好;COL5A2表达与乳腺癌组织中的免疫微环境改变有关。结论 COL5A2在乳腺癌组织中高表达,其高表达影响乳腺癌患者的预后和肿瘤免疫微环境。