高效液相色谱法测定非变性Ⅱ型胶原蛋白含量的研究

研究非变性Ⅱ型胶原蛋白含量的测定方法,对样品中的目标成分进行测定和方法学验证分析。通过高效液相色谱法(HPLC)测定非变性Ⅱ型胶原蛋白的含量,考察线性、精密度、准确度、耐用性。实验结果表明,非变性Ⅱ型胶原蛋白(以L-羟脯氨酸计),在0~398.48μg/mL范围内线性关系较好;精密度较好;平均回收率为99.2%,RSD为0.87%;耐用性较好。经过全面的方法学验证,该实验方法稳定可靠,适用于高效液相色谱法测定非变性Ⅱ型胶原蛋白的含量,并可应用于相关产品的质量控制工作。

基于胃蛋白酶耐受性的变性胶原蛋白定量分析方法

基于胶原蛋白的蛋白酶耐受性,建立变性胶原蛋白的定量分析方法。制备6组已知含量比的变性/非变性胶原蛋白混合样品,在液态胶原pH值约2.0的条件下,添加胃蛋白酶对样品中的变性胶原蛋白进行酶切,使其成为短肽,胃蛋白酶与胶原蛋白的质量比为1∶5,温度为30℃,消化24 h;然后采用NaCl沉淀法(NaCl终浓度为2 mol/L)对样品中的非变性胶原蛋白进行沉淀回收,并通过羟脯氨酸测定法检测其含量比。结果显示,6组样品中非变性胶原蛋白的回收率为89.96%~99.24%,表明本方法可以充分酶解变性胶原蛋白,而非变性胶原蛋白得以沉淀回收,可用于定量分析液态或海绵状、粉末状等酸溶性胶原蛋白原料和产品中变性胶原蛋白的含量比。

牙本质源基质金属蛋白酶与牙体组织胶原变性关系的研究进展

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）是一组锌依赖性蛋白水解酶，可降解几乎所有的细胞外基质蛋白，参与多种生理过程，如组织的形成改建、血管发生、伤口愈合等，以及动脉粥样硬化、关节炎、癌症、溃疡等多种病理过程。迄今为止发现人体内含有24种MMP基因和26种MMP[1]。人牙本质中含有数种MMP，这些MMP多是在牙齿发育过程中由成牙本质细胞、成纤维细胞分泌产生，在牙本质矿化过程中被矿物质包裹，以未激活的酶原形式存在于矿化成熟的牙本质中[2]。

未变性胶原生物表面活性剂的表面张力及其表面吸附

研究了一种未变性胶原生物表面活性剂(CBS)水溶液的表面张力和表面吸附性质。结果表明,CBS水溶液的表面张力随CBS浓度的增大而降低,最终趋于平缓,达到55.92 mN/m。在等电点附近,CBS表面静电荷降低,使其表面张力显著降低。在低温下,CBS溶液的表面活性较好,当温度继续升高(>35℃),由于变性作用,CBS溶液的表面张力急剧增大。CBS水溶液的吸附属于Langmiur型吸附,根据γ-lgC、Γ-C以及C/Γ-C拟合曲线计算得到饱和吸附量相似,分别为1.86×10-10,1.97×10-10和2.03×10-10 mol/cm2。吸附自由能为-3.53kJ/mol,表明其在标准状态下可以自发进行。

牛骨胶原在[Emim]Br离子液体中的变性作用

1–乙基–3–甲基溴代咪唑([Emim]Br)离子液体对牛骨胶原具有一定的溶解作用,溶解后以水为沉淀剂得到再生物质.对再生物质进行FTIR、UV、SDS-PAGE凝胶电泳,SEM和DSC分析以确定再生物质成分和结构,从而确定牛骨胶原在离子液体中的变性过程.结果表明:再生物质不存在胶原特有的三股螺旋结构,但仍存在肽键结构,为小分子质量多肽,说明溶解过程中离子液体使牛骨胶原变性,不仅对牛骨胶原的网状结构有破坏作用,同时使牛骨胶原三股螺旋结构和肽链遭到破坏,胶原发生不可逆变性.

非变性Ⅱ型胶原蛋白研究进展

非变性Ⅱ型胶原蛋白是指经提取后仍能保留完整大分子胶原蛋白三螺旋结构的Ⅱ型胶原蛋白,在类风湿性关节炎和骨关节炎的预防和治疗中极具开发应用价值。Ⅱ型胶原蛋白广泛存在于动物软骨组织中,与蛋白聚糖紧密结合。本文介绍了非变性Ⅱ型胶原蛋白的功能与结构,结合近年来国内对非变性Ⅱ型胶原蛋白的研究,从提取方法、定性定量表征方法及在食品领域的应用现状等方面进行综述,为非变性Ⅱ型胶原蛋白的进一步精深加工及其综合利用提供参考。

非变性牦牛骨胶原蛋白的提取与表征

三股螺旋结构是胶原蛋白的关键结构特征,胶原蛋白变性会破坏三股螺旋结构进而严重影响其生物功能。牦牛是高寒地区特有的半野生牛种,主要生活在我国的青藏高原。我们开发了一种温和的生物工艺,从牦牛骨中提取制备了高品质的牦牛胶原蛋白(Yak ossein,YO)。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和圆二色谱(CD)结果表明,我们提取得到的为I型牦牛胶原蛋白,未发生降解,并且整体保持完整的三股螺旋结构。酶切实验进一步表明,提取的YO未发生变性,它可以有效抵抗胃蛋白酶的降解。同时,我们建立变性胶原蛋白的靶向结合实验,利用高特异性的荧光多肽探针来检测牦牛胶原蛋白的变性程度。该靶向探针对提取的YO完全没有结合能力,表明该YO为非变性胶原蛋白。细胞实验表明,YO对成纤维细胞有良好的粘附能力,并且可以显著促进其细胞增殖。

基于未变性胶原生物表面活性剂的性能研究

研究了一种基于未变性胶原生物表面活性剂(简称LSCS)在水溶液中的表面吸附性质。LSCS生物表面活性剂经表面张力法测得其临界胶束浓度(CMC)为2.0×10-3mg/mL,在CMC时表面张力为54.5mN/m;LSCS水溶液的表面饱和吸附量为6.61×10-11mol/cm2,其吸附等温线属于Langmuir型等温线。经Gibbs吸附公式分析表明:LSCS水溶液的表面吸附在标准状态下能自发进行。

非变性Ⅰ型胶原蛋白对免疫低下大鼠免疫功能的调节作用

该研究旨在观察非变性Ⅰ型胶原蛋白(Non-denatured type-Ⅰ collagen,NDC-Ⅰ)对免疫低下模型大鼠免疫功能的调节作用。动物实验采用腹腔注射环磷酰胺法建立免疫低下大鼠模型,观察NDC-Ⅰ对大鼠的胸腺指数和脾脏指数,白细胞计数和分类,血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α),脾脏和胸腺的乳酸脱氢酶(LDH)活性和组织形态学变化。结果显示,在给予NDC-Ⅰ干预30 d后,与模型组比较,NDC-Ⅰ组胸腺指数上升(p<0.05),白细胞计数显著提高(p<0.01),血清中IgA、IgG、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α含量为43.32μg/mL、283.32μg/mL、1827.17 ng/L、135.97 pg/mL、113.87 ng/L、2302.44 pg/mL、469.91 ng/L,水平显著升高(p<0.01),脾脏中LDH活性显著上升(p<0.01),脾脏和胸腺组织病理学损伤减轻。结果证明,NDC-Ⅰ对环磷酰胺致免疫低下大鼠的免疫功能具有一定的调节作用,也为胶原蛋白等相关功能产品的综合开发与充分利用提供了参考依据。

非变性Ⅱ型胶原蛋白改善骨关节炎的研究进展

中国骨关节炎患者数量巨大,亟需改善骨关节炎症状的功能性食品原料。本文综述了非变性Ⅱ性胶原蛋白国内外改善关节炎的研究,阐述了其作用机理,认为非变性Ⅱ型胶原蛋白必将会成为改善关节炎症状的革命性功能原料,市场开发前景广阔。

变性Ⅰ型胶原对内皮细胞增殖、迁移及血管形成相关蛋白合成的影响

目的·探讨变性Ⅰ型胶原对内皮细胞增殖、迁移及血管生成相关蛋白合成的影响。方法·人脐静脉内皮细胞传代培养后分别接种于正常胶原(正常胶原组)、半量正常胶原(半量胶原组)和变性胶原(变性胶原组)包被的培养板上,2 d后用CCK-8法检测细胞增殖活性,划痕实验观察细胞迁移能力,Western blotting检测膜型基质金属蛋白酶-1(membrane-type 1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达水平,ELISA法检测血管生成素1(angiopoietin 1,Ang-1)和Ang-2的蛋白分泌情况。结果·CCK-8法检测结果显示,变性胶原组细胞的增殖活性显著高于正常胶原组和半量胶原组(均P<0.05);划痕实验结果显示,变性胶原组细胞的迁移能力最强,16 h即可将划痕基本完全覆盖。变性胶原组MT1-MMP和VEGF表达水平均明显高于其他2组(均P<0.05),Ang-2蛋白分泌量显著高于正常胶原组(P<0.05);但Ang-1分泌与其他2组差异无统计学意义(P>0.05)。结论·变性Ⅰ型胶原能促进内皮细胞增殖、迁移,增加MT1-MMP、VEGF、Ang-2的表达,提示变性胶原在创面修复的血管化过程中可能有积极作用。

非变性Ⅱ型胶原蛋白对老年db/db小鼠运动机能的改善作用

目的:探讨非变性Ⅱ型胶原蛋白(UCⅡ)对增龄导致的db/db小鼠运动机能下降的改善作用。方法:将正常喂养至老年的db/db小鼠随机分为模型对照组、UCⅡ干预组、阳性对照组,以同周龄的db/m小鼠为正常对照组,喂养至25周的db/db小鼠作为青年对照组,干预12周后评估其爬网时间和步态特征,继续干预4周后评价其骨形态计量学特征,计算腓肠肌指数。结果:UCⅡ干预组腓肠肌指数明显大于模型对照组(P<0.05)。骨密度最大为UCⅡ干预组(439.11 mg/cm^(3)),与同年龄组之间存在统计学差异(P<0.05)。相比于模型和青年对照组,UCⅡ干预组骨小梁相对体积和数量显著增加(P<0.05)。UCⅡ干预显著提升db/db老年小鼠的爬网能力(P<0.05)。相比于模型对照组,UCⅡ干预组小鼠步幅、摆动速度、步速、步调和步序比增加,摆动时长、支撑相时长降低,并且小鼠腓肠肌指数与支撑相时长、爬网时间呈正相关(P<0.05,系数>0.5),小鼠骨密度与爬网时间、支撑相时长、摆动速度呈现一定正相关(系数>0.5),表明UCⅡ可以改善db/db小鼠由于增龄带来的腓肠肌质量、骨密度的下降,提高其运动能力。

非变性Ⅱ型胶原蛋白改善骨关节炎的研究进展

随着人口老龄化的到来,骨折和骨关节炎患病人群呈现大幅度增高趋势,严重的危害着老年人的身体健康。作为世界上发病率和致残性都比较高的疾病,关节炎的致残率高达53%。但是关节炎远没有骨质疏松症那样备受重视,尤其是中国,骨关节炎患者数量巨大,目前普遍用于改善关节炎症状的药物有糖皮质激素、非甾体类抗炎药、营养补充剂如硫酸软骨素、氨基葡萄糖、透明质酸等,研究表明药物治疗会带来副作用,而营养补充剂的效果也存在争议。非变性Ⅱ型胶原蛋白(也称之为含Ⅱ型胶原蛋白的软骨粉)在20世纪90年代初开始用于治疗人体的关节炎,效果良好,备受关注。本文主要阐述了非变性Ⅱ性胶原蛋白在改善关节炎方面国内外的动态及前沿研究进展,以及对其作用机制的研究,通过研究发现非变性Ⅱ型胶原蛋白对改善关节炎的症状具有非常重要作用及功能,其具有非常广阔的市场开发前景。

非变性Ⅱ型胶原蛋白改善犬骨关节炎的研究

本研究以骨关节炎犬为研究对象,探讨非变性II型胶原蛋白的作用效果。结果发现,与安慰剂相比,每天饲喂40mg非变性II型胶原蛋白3个月后,有效改善骨关节炎犬的整体疼痛,跛行疼痛和四肢疼痛,且具有安全无毒的特点,可用于犬类等宠物关节炎改善的营养补充剂。

非变性Ⅱ型胶原蛋白提取工艺优化及质量验证

以新鲜鸡胸软骨作为原材料,清洗灭菌后进行破碎处理,经中性盐及碱共作用的方法进行预处理后,使用酸法及酶法相结合的提取方法添加胃蛋白酶提取非变性Ⅱ型胶原蛋白。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定不同盐析pH值及浓度条件,和盐碱处理后材料酶解过程不同时间段光条带密度变化以确定最适条件。最后对不同盐析pH值、最佳盐析浓度条件下所获得胶原进行傅里叶红外吸收图谱,圆二色谱,紫外光谱,羟脯氨酸含量,等电点,熔融温度(T_(m)),热分解温度(T_(d)),十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,氨基酸含量,扫描电子显微镜及原子力显微镜对比分析。结果表明在pH13的混合清洗液,酶解48 h及酸性条件0.75 mol/L盐析浓度条件下所获得的Ⅱ型胶原冻干产品天然纤维结构完整,产率高达68.9%,羟脯氨酸含量可达11.04%。

氨糖-碳酸钙-非变性Ⅱ型胶原蛋白复合物增加骨密度的作用

研究氨糖、碳酸钙、非变性Ⅱ型胶原蛋白复合物对大鼠骨密度的影响。大鼠分别灌胃给予剂量为0.22,0.44和0.88 g/(kg·bw)的复合物,1次/日,连续12周。动物每周称重1次。结束后测定各组大鼠股骨质量、股骨骨密度和股骨钙含量。试验结果显示,各剂量组股骨远心端和中心端骨密度均高于低钙对照组(P<0.01),且高剂量组股骨质量和骨钙含量高于低钙对照组(P<0.01)。氨糖、碳酸钙、非变性Ⅱ型胶原蛋白复合物具有增加大鼠骨密度功能,可用于相关食品的研发。

间质型环状肉芽肿1例

患者女,67岁,因“双下肢散在环状红斑2年,增多1年”就诊于我院。患者2年前无明显诱因双下肢出现环状红斑,散在分布,无瘙痒,无疼痛,自行外用“糠酸莫米松乳膏、黄铍人草本抑菌乳膏”效果不佳,后未予其他干预治疗。近1年红斑逐渐增多、增大。既往高血压、陈旧性脑梗病史,否认其他病史。否认药物及食物过敏史。体格检查:系统检查未见异常。皮肤科检查:双下肢散在分布大小不等的环状红斑,边界清楚,部分红斑周边轻度隆起,无压痛,未见明显鳞屑(图1,见封三)。实验室检查:血常规、肝肾功、血脂、凝血、免疫球蛋白、补体及风湿三项、过敏原总IgE、抗核抗体谱未见异常。皮损组织病理示:表皮未见著变;真皮浅中层间质型肉芽肿斑片状穿插分布,伴真皮浅、深层血管周围炎(图2A,见封三);真皮浅中层可见胶原变性肿胀(图2B,见封三),变性肿胀的胶原纤维间可见黏蛋白沉积(图2C,见封三)。

变性Ⅰ型胶原在人成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中的作用

目的探讨变性Ⅰ型胶原在人成纤维细胞（Fb）向肌Fb分化中的作用。方法取烧伤瘢痕手术患者捐献的少量正常皮肤，组织块培养法获得人Fb，并进行传代培养，取第4代细胞进行以下实验。（1）取Fb，按随机数字表法分为正常胶原组和变性胶原组，每组10孔。正常胶原组Fb接种于正常Ⅰ型胶原包被的盖玻片，变性胶原组Fb接种于变性Ⅰ型胶原包被的盖玻片。免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达，计算PCNA表达阳性细胞百分比。（2）另取Fb，同（1）进行分组处理，每组12孔，噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性。（3）另取Fb，同（1）进行分组处理，罗丹明－鬼笔环肽染色观察细胞微丝形态。（4）另取Fb，同（1）进行分组处理，免疫组织化学法检测细胞中α平滑肌肌动蛋白（α－SMA）表达，免疫荧光法检测细胞中OB钙黏蛋白表达。（5）另取Fb，按随机数字表法分为正常胶原组、变性胶原组和普通玻片组，每组6孔。正常胶原组和变性胶原组Fb处理同（1），普通玻片组Fb接种于无胶原包被的盖玻片。蛋白质印迹法检测细胞中α－SMA和OB钙黏蛋白表达。（6）另取Fb，同（5）进行分组处理，实时荧光定量反转录－聚合酶链反应法检测细胞中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原及α－SMA的mRNA表达。对数据行t检验、单因素方差分析、LSD检验。结果（1）变性胶原组PCNA表达阳性细胞百分比为（83±9）%，明显高于正常胶原组的（29±9）%（t＝13.53，P〈0.01）。（2）变性胶原组Fb的增殖活性为0.32±0.06，明显高于正常胶原组的0.25±0.05（t＝3.06，P〈0.01）。（3）正常胶原组Fb微丝均纵向平行排列，贯穿细胞长轴。变性胶原组Fb微丝更为密集、粗大。（4）正常胶原组Fb基本呈典型的长梭形；变性胶原组Fb形态发生变化，细胞明显铺展。变性胶原组Fb的α－SMA、OB钙黏蛋白表达较正常胶原组强。（5）变性胶原组、正常胶原组、普通玻片组Fb的α－SMA表达量分别为1.69±0.41、0.89±0.27、1.46±0.42，变性胶原组Fb的α－SMA表达量明显高于正常胶原组（P〈0.01）。变性胶原组、正常胶原组、普通玻片组Fb的OB钙黏蛋白表达量分别为5.17±0.28、2.21±0.10、4.01±0.56，变性胶原组Fb的OB钙黏蛋白表达量明显高于正常胶原组（P〈0.01）。（6）正常胶原组、变性胶原组与普通玻片组Fb中Ⅰ型胶原的mRNA表达量相近（F＝2.71，P〉0.05）。正常胶原组Fb中Ⅲ型胶原及α－SMA的mRNA表达量明显低于变性胶原组（P〈0.01）。结论变性Ⅰ型胶原影响Fb活性，诱导Fb向肌Fb分化。

非变性Ⅱ型胶原蛋白对老年db/db小鼠骨退行性疾病防治作用

目的探讨非变性Ⅱ型胶原蛋白(UCⅡ)对老年db/db小鼠骨退行性疾病的防治作用及机制。方法将终生喂养的db/db小鼠分为老年模型对照组、胶原蛋白组、阳性对照组,同时以db/m和青年db/db小鼠为正常对照组和青年对照组,干预16周后检测血糖水平、骨形态计量学指数、炎症指标和基质金属蛋白酶(MMP)水平。结果胶原蛋白组小鼠空腹血糖水平显著低于老年模型和青年模型对照组(P<0.05);胶原蛋白组小鼠骨密度(439.11 mg/cm^3)明显高于老年模型对照组和正常对照组(分别为164.20、209.74 mg/cm^3)和阳性对照组(294.42 mg/cm^3)(P<0.05);胶原蛋白组小鼠骨小梁相对体积低于老年模型组、骨小梁数量高于老年模型组,差异有统计学意义(P<0.05);胶原蛋白组小鼠骨小梁分离度明显小于老年和青年模型对照组(P<0.05)。胶原蛋白组小鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)明显低于老年模型对照组(P<0.05);胶原蛋白组小鼠血清中MMP-1、MMP-3水平明显低于老年模型对照组,MMP-3水平明显低于青年模型对照组和阳性对照组(P<0.05)。结论非变性Ⅱ型胶原蛋白可以改善老年糖尿病小鼠的血糖水平,具有增加骨密度、缓解骨质疏松、防治骨关节炎的作用,其机制可能与减轻小鼠炎症反应,降低小鼠血清中MMP水平有关。