红景天苷对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖及胶原基因表达的影响

目的 探讨红景天苷对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞 (hepaticstellatecell,HSC)增殖、α1(I)型胶原mRNA合成、IκB和NF κB表达的影响。方法 用原位杂交、免疫细胞化学和凝胶电泳迁移率技术 (EMSA)检测HSC的增殖和胶原基因表达。结果 乙醛刺激HSC增殖、α1(I)型胶原mRNA合成 ,使IκB表达下降、NF κB活性增加。红景天苷(0 5～ 2 5mg·mL- 1 )对上述影响有抑制作用 ,且以 1 5mg·mL- 1 组效果最好。结论 红景天苷明显抑制乙醛刺激的HSC增殖及胶原基因的表达。

人α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性研究

目的 :探索器官纤维化形成中调控 型胶原基因高水平转录的启动片段。方法 :从人α1( )胶原基因转录起始点上游 - 2 .5 kb～ + 42 bp的片段中 ,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的质粒组成 6个重组体 ,脂质体法转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞 ,CAT- EL ISA测定细胞 CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性。结果 :- 2 483～ + 42 bp,- 2 6 8～ + 42 bp序列具有强启动 CAT表达活性 ,而 - 10 5～ + 42 bp片段启动CAT活性最低。结论 :人α1( )胶原基因 - 2 483～ + 42 bp,- 2 6 8～ + 42 bp片段有高启动活性 ,是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。

汉防己甲素对矽肺大鼠肺中Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的影响

使用Ｐｒｏα１（Ⅰ）、Ｐｒｏα１（Ⅲ）人胶原ｃＤＮＡ探针，采用ｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ班点杂交技术，观察了染尘２个月、４个月的矽肺大鼠及汉防己甲素治疗１个月和３个月的矽肺大鼠肺组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的ｍＲＮＡ水平的改变情况。实验结果表明，矽肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原ｍＲＮＡ的含量比正常肺组织明显增加（Ｐ＜０．０５），汉防己甲素治疗后Ⅰ、Ⅲ型胶原正常含量则较矽肺组织显著减少。因此，我们认为矽肺病变组织中胶原纤维的积聚是由石英粉尘引起胶原基因表达改变所致；汉防己甲素能直接或间接地抑制胶原基因的转录，从而抑制矽肺病变中胶原蛋白的合成。

降钙素对骨质疏松性骨折修复过程胶原基因表达的影响

目的探索降钙素对骨质疏松性骨折愈合过程中基质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响,阐明降钙素促进骨质疏松性骨折愈合的机制。方法选用96只2个月龄SD雌性大鼠,64只行双侧卵巢切除(OVX)后,随机平分为降钙素组和对照组,其余32只为假手术组;10周后所有大鼠在右侧桡骨下端制作1 mm骨缺损的骨折愈合模型。降钙素组从骨折术前1 w至术后8 w连续每天皮下注射鲑鱼降钙素2 IU/kg,另2组注射等量生理盐水。采用原位杂交技术分析7 d,14 d,28 d,56 d,4个时间、点降钙素对骨折修复过程中基质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响。结果降钙素治疗下,骨基质Ⅰ型胶原mRNA表达的量与对照组比较有显著性差异,假手术组>降钙素组>对照组;Ⅲ型胶原mRNA的表达变化则与之相反。降钙素组软骨性骨痂向骨性骨痂转换时间较对照组缩短。结论降钙素能影响胶原mRNA的表达,明显促进骨质疏松性骨折的愈合。

碱性成纤维细胞生长因子拮抗转化生长因子-β_1对人α1(I)胶原基因的启动激活

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)对人α1 ( )胶原基因启动子活性的影响 ,以及与转化生长因子 - β1 (TGF- β1 )之间的相互作用 ,为防治增生性瘢痕提供依据。 方法 正常皮肤及瘢痕成纤维细胞原代、传代培养。采用 Fu GENE转染试剂 ,分别瞬间转染含人α1 ( )胶原基因 5'端序列 - 2 .5 kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体 ph COL2 .5至正常皮肤及瘢痕成纤维细胞。 ELISA法测定 b FGF及 TGF- β1 作用 2 4小时后 ,转染ph COL2 .5的两种成纤维细胞的报告基因 CAT表达量。 结果 b FGF能抑制转染 ph COL2 .5重组体的正常皮肤及瘢痕成纤维细胞 CAT表达量 ,且能拮抗 TGF-β1 对转染 ph COL2 .5重组体的两种成纤维细胞 CAT表达的上调作用。与对照组相比有统计学意义 (P<0 .0 5)。 结论 正常皮肤及瘢痕成纤维细胞中 ,b FGF均能抑制人 α1 ( )胶原基因的启动转录 ,且能拮抗 TGF-β1 对人α1 ( )胶原基因启动活性的上调作用 ,b

波长585nm脉冲染料激光对成纤维细胞增殖以及其前胶原基因mRNA表达的影响

以不同能量密度的脉冲染料激光照射体外培养的正常皮肤的成纤维细胞,照射后继续培养24h,分别以MTT法检测其增殖功能,以定量PCR(LightCycler)法检测其细胞内不同类型的前胶原基因及SMADs mRNA的表达.结果显示能量密度为5 J/cm2和7 J/cm2的脉冲染料激光能抑制体外培养的正常皮肤的成纤维细胞的增殖功能(P<0.05),在能量密度为5 J/cm2时能显著抑制I型前胶原基因1α(P<0.01)以及SMAD 2,3,4,7 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01),下调I型前胶原基因1α与III型前胶原基因mRNA的比率.在能量密度为6,7 J/cm2时能抑制III型前胶原基因α1mRNA的表达(P<0.05),而对I型前胶原基因1α,2α的表达与对照无显著性差异.提示波长585 nm脉冲染料激光对成纤维细胞的增殖及其胶原产生的某些相关基因的表达具有直接的作用,且与能量密度有关.

丹参酸乙对大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原基因表达的影响

目的 :探讨丹参酸乙 (SA B)对血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )孵育的新生大鼠心脏成纤维细胞功能的影响。 方法 :将培养的心脏成纤维细胞分成四组 :空白对照组 ;AngⅡ组 :培养基中加了 10 7mol/LAngⅡ ;SA B10 6mol/L组 :培养基中加 10 7mol/LAngⅡ+ 10 6mol/LSA B ;SA B10 4mol/L组 :培养基中加 10 7mol/LAngⅡ + 10 4mol/LSA B。加药后 2 4h分别作3 H TdR细胞增殖测定和采用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)测定Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的转录水平。结果 :10 4mol/LSA B可有效抑制由AngⅡ引起的心脏成纤维细胞的增殖。 10 5mol/LSA B可抑制胶原Ⅲ型mRNA的表达量 ,而 10 6mol/LSA B和 10 5mol/LSA B都可显著抑制胶原Ⅰ型mRNA的表达。结论 :丹参酸乙可逆转由AngⅡ引起的心脏成纤维细胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达水平。

人Ⅰ型胶原基因第一内含子调节转录的研究

人Ⅰ型胶原α１（Ⅰ）链（ＣＯＬⅠＡ１）基因内含子序列在不同细胞内有不同的转录调节活性．报道了含人ＣＯＬⅠＡ１基因内含子Ⅰ不同区段（＋５４４～＋８５５和＋８２０～＋１０９３）的重组质粒ｐＳＣＥＰＣＡＴ和ｐＳＣＩＰＣＡＴ的构建并转染人胚肌腱成纤维细胞和Ｔｃａ８１１３舌癌细胞．地高辛标记抗ＣＡＴＥＬＩＳＡ检测结果显示：ｐＳＣＥＰＣＡＴ在两种细胞均获表达；ｐＳＣＩＰＣＡＴ在人成纤维细胞未表达，但在舌癌细胞其表达量明显高于ｐＳＣＥＰＣＡＴ．这表明人ＣＯＬⅠＡ１基因内含子Ⅰ＋５４４～＋８５５区段增强氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）表达；＋８２０～＋１０９３区段则抑制人成纤维细胞但显著增强舌癌细胞的ＣＡＴ表达．

小鼠α2(Ⅰ)胶原基因DNA结合蛋白研究

目的 :初步分析小鼠α2 ( )胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp(- 780～ + 5 4bp)序列的 DNA结合蛋白。 方法 :PCR扩增小鼠α2 ( )胶原基因 - 2 5 8～ + 5 4bp,- 5 19～ - 2 48bp,- 741～ - 5 0 1bp片段 ,Dig- d U TP末端标记 PCR产物 ,与经 SDS- PAGE并转印至膜上的胶原产生细胞的核抽提物进行 DNA -蛋白质结合反应 ,以抗 Dig抗体检测结合反应信号。 结果 : 型胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp序列中存在至少 3个不同的核转录因子结合位点 ,相识别 (consensus)的核蛋白因子相对分子质量分别为 12万 ,5万 ,2万。TGF- β1可增强细胞中相对分子质量为 12万的核蛋白因子的表达。结论 :小鼠 α2( )胶原基因上游 - 780～ + 5 4bp这 80 0 bp片段中存在与不同的核蛋白因子结合的序列 ,可能与 Sp- 1有关。TGF- β1通过增强相对分子质量为 12万核蛋白的表达而促进该蛋白与靶调控序列的结合。

针对Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因的二联核酶的构建及体外活性研究

增殖性瘢痕组织中胶原蛋白的合成显著增加从而导致胶原的过度沉积。利用核酶特异地抑制前胶原基因的表达可减少胶原蛋白的合成 ,为瘢痕的研究和防治提供了新的思路。为研究用核酶抑制前胶原基因表达的可能及效果 ,设计并构建了针对α1 (Ⅰ )型及α1 (Ⅲ )型前胶原基因的二个单价核酶串联的二联核酶基因真核表达载体 ,并对其体外切割活性进行研究。结果表明该二联核酶的切割效果明显 ,均能有效地切割底物 。

维拉帕米阻断TGF-β1诱导的α1(Ⅰ)胶原基因启动子的激活

目的 :探讨维拉帕米对α1( )胶原基因启动子活性的影响。方法 :将人α1( )胶原基因启动子重组体 p COL H 1.5、p COL H2 .5转染至大鼠肾小球系膜细胞 ,分别经不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1)和维拉帕米处理后 ,EL ISA法测定细胞 CAT表达水平。结果 :TGF- β1作用后 ,p COL H1.5和 p COL H2 .5的 CAT活性明显增加 ,分别为对照组的 1.4 98和 1.5 5 1倍 ;维拉帕米对两个重组体的 CAT表达均有抑制作用 ,与单纯 TGF- β1组比较 ,维拉帕米加 TGF- β1组 p COL H2 .5的 CAT活性明显降低 (维拉帕米低浓度组 P<0 .0 5 ,高浓度组 P<0 .0 1)。结论 :维拉帕米不仅直接抑制启动子的活性 ,而且还部分阻断 TGF- β1诱导的 α1( )胶原基因启动子激活。

Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究

目的体外研究锤头型α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件.同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响.方法将含α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ),经体外32p标记转录后形成产物靶RNA.同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-g Ⅰ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录,产物(核酶)与各自的32P-靶RNA按不同的条件混和反应,电泳后放射自显影观察结果.将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内,采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响.结果两种核酶在37℃、42℃均能有效切割各自的靶RNA,对Mg2+浓度的要求范围较宽(10～20mmol/L);反应温度从65℃逐渐降至并维持在37℃的条件下核酶切割活性显著提高.Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低,胶原蛋白生成降低,胶原生成明显受抑制.结论针对α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成.

1例成骨不全患者Ⅰ型胶原基因突变的检测

目的对1例成骨不全(OI)患者Ⅰ型胶原基因(COL1A1和COL1A2)进行基因突变检测,为研究中国人群的OI基因突变特点提供线索。方法患者具有OI典型的蓝巩膜、易骨折、牙本质发育不全等临床表现,临床诊断为OI,提取患者外周血基因组DNA,对所有启动子区、外显子及外显子-内含子边界区进行DNA测序,通过序列特异引物PCR(PCR-SSP)法进一步验证,以患者的父母、妹妹及200例体检健康者作为对照。结果 DNA测序结果显示,OI患者COL1A1基因45号外显子发生单核苷酸替代突变(c.3263 G>A,p.Gly1088Glu),而患者的父母、妹妹及200例健康对照者未发现相同的突变位点。同时PCRSSP也证明了此位点的杂合性。结论 c.3263 G>A突变位点是一个OI患者COL1A1基因的新突变位点,与OI临床表型具有一定相关性。

骨仙片对小鼠骨折愈合的ⅠⅡ型胶原基因表达影响的实验研究

目的 :采用基因技术 ,旨在从分子水平探讨骨仙片的作用机理。方法 :取 1 2 0只昆明小鼠造成桡骨1 .5 mm缺损骨折 ,随机分为两组 :服药组及未服药组各 60只 ,在术后 2 w及 4w,分别进行骨痂总 RNA的分离提取 ,通过与 、 型胶原质粒探针 ( p Mco1 1 a-1及 p Mco1 1 2 al-1 )斑点杂交 ,比较 型胶原 m RNA表达的变化。结果 : 型胶原 m RNA表达在术后 2 w明显小于 4w, 型胶原 m RNA表达术后 2 w明显大于 4w,提示 型胶原 m RNA表达代表骨形成及塑形的特征标志 , 型胶原 m RNA表达代表软骨修复的特征标志。 型胶原 m RNA表达量 ,服药组 >未服药组 , 型胶原 m RNA表达量 ,服药组 <未服药组 ,提示服药组骨形成迅速 ,由软骨修复期提早进入骨修复及塑形期。结论

克矽平对矽肺组织胶原基因表达的抑制作用

使用Ｐｒｏａ＿１（Ⅰ），Ｐｒｏａ＿１（Ⅲ）人胶原ｃＤＮＡ探针，采用ｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ斑点杂交技术，观察了染石英尘２个月、４个月矽肺大鼠及克矽平（ＰＶＮＯ）治疗１个月、３个月后肺组织中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ水平的改变情况。结果表明，矽肺组织中Ⅰ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ含量比正常肺组织明显增加（Ｐ＜０．０５）；经克矽平治疗后两型胶原ｍＲＮＡ皆显著减少。我们认为矽肺病变中胶原蛋白的积聚是由石英粉尘引起胶原基因表达改变所致。药物ＰＶＮＯ能直接或间接地抑制胶原基因的转录，从而抑制矽肺病变时胶原蛋自的合成。

实验性矽肺纤维化组织中Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达

在制备人和小鼠的Ｐｒｏαｌ（Ⅰ）、Ｐｒｏαｌ（Ⅲ）前胶原ｃＤＮＡ探针的基础上，采用ｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ斑点杂交及原位杂交技术，观察了二氧化硅诱导二个月和四个月的矽肺纤维化大鼠肺组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的ｍＲＮＡ水平和分布情况。实验结果表明，肺纤维化组织中Ｐｒｏαｌ（Ⅰ）、Ｐｒｏαｌ（Ⅲ）ｍＲＮＡ含量比正常肺组织明显增加（Ｐ＜０．０５），两型ｍＲＮＡ在正常肺组织主要分布于肺泡间隔的成纤维细胞中，而在病变组织主要分布于细胞性结节和增厚间质的成纤维细胞中。我们认为二氧化硅诱导的矽肺纤维出组织中胶原纤维的增生和积聚与胶原基因的表达密切相关。

地塞米松抑制TGF-β_1对人α1(Ⅰ)前胶原基因的转录激活

目的:探讨地塞米松与TGFβ1之间的相互作用及对人α1(I)前胶原基因启动转录的影响。方法:人皮肤及瘢痕成纤维细胞原代、传代培养。采用FuGENE转染试剂,分别瞬间转染含人α1(Ι)胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5至人皮肤及瘢痕成纤维细胞。ELISA法测定地塞米松及TGFβ1作用24h后,转染了phCOL2.5的2种成纤维细胞的报告基因CAT表达量。结果:地塞米松能抑制转染了phCOL2.5重组体的人皮肤及瘢痕成纤维细胞CAT表达量,且能拮抗TGFβ1对转染了phCOL2.5重组体的2种成纤维细胞CAT表达的上调作用(P<0.05)。结论:在正常皮肤及瘢痕成纤维细胞中,地塞米松均能抑制人α1(Ι)前胶原基因的启动转录,且能拮抗TGFβ1对人α1(Ι)前胶原基因的转录激活。

地塞米松对人α1( Ⅰ )胶原基因启动子活性的影响

目的 :探讨地塞米松对人α1( )原胶原基因调控序列的作用。方法 :用组织块法原代培养人皮肤成纤维细胞并进行传代培养作为本研究的模型细胞。 (1)采用 Brd U掺入的 EL ISA法 ,测定经不同浓度地塞米松处理 2 4h后成纤维细胞的增殖情况。 (2 )构建含长短不一的人α1( )原胶原基因 5′侧翼序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的 3种重组质粒 ;以脂质体法转染人皮肤成纤维细胞 ;EL ISA法测定不同浓度地塞米松作用 2 4h后 ,转染了 3种重组质粒的成纤维细胞的 CAT表达量。结果 :(1)在加入 2 % FCS或 10 % FCS的培养条件下 ,1× 10 - 9～ 1× 10 - 4 m ol/ L 地塞米松处理 2 4h后 ,各浓度组成纤维细胞增殖值之间以及与对照组之间差异均无显著性 (P>0 .0 5 )。 (2 ) 3种重组体转染成纤维细胞 ,并经地塞米松处理 2 4h后 ,转染细胞的 CAT相对表达量测定 :地塞米松组与对照组之间、地塞米松较高浓度组 (1× 10 - 5 m ol/ L)与较低浓度组 (1× 10 - 6mol/ L)之间 ,差异均有显著性 (P<0 .0 5 )。结论 :地塞米松在 1× 10 - 9～ 1× 10 - 4 mol/ L 浓度范围内 ,对所研究的模型细胞——人皮肤成纤维细胞增殖无明显作用。地塞米松对胶原基因启动序列具有负性调控作用 ,且存在剂量依赖关系。

低氧对人胚肺成纤维细胞增殖及I型前胶原基因表达的影响

目的阐明低氧在血管壁构形重组中的作用及川芎嗪的疗效机理。方法用细咆计数法及非放射性细胞增殖检测法观察2%低氧对人胚肺成纤维细胞增殖的影响;用Northern印迹杂交法检测2%低氧对人胚肺成纤维细胞Ⅰ型前胶原基因表达的作用及川芎嗪对基因表达的影响。结果低氧24.48及72h能明显促进人胚肺成纤维细胞增殖;低氧24h Ⅰ型前胶原基因表达明显升高;川芎嗪(30μg/ml及10μg/ml)可抑制上述基因表达的升高。结论低氧对人胚肺成纤维细胞有直接利激作用,通过促进其增殖及前胶原基因表达而影响肺血管构形重组和损伤组织的修复。

地塞米松抑制转化生长因子β_1对人α_1(Ⅰ)前胶原基因的转录激活

目的 探讨地塞米松与转化生长因子 β1 (TGFβ1 )之间的相互作用及对人α1 (Ⅰ )前胶原基因启动转录的影响。方法 人皮肤及瘢痕成纤维细胞原代、传代培养。采用FuGENE转染试剂 ,分别瞬间转染含人α1 (Ⅰ )胶原基因 5′侧翼序列 - 2 5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)的重组体 phCOL2 5至人皮肤及瘢痕成纤维细胞。ELISA法测定地塞米松及TGFβ1 作用 2 4h后 ,转染了phCOL2 5的 2种成纤维细胞的报告基因CAT表达量。 结果 地塞米松能抑制转染了 phCOL2 5重组体的人皮肤及瘢痕成纤维细胞CAT表达量 ,且能拮抗TGFβ1 对转染了 phCOL2 5重组体的 2种成纤维细胞CAT表达的上调作用 (P <0 0 5)。结论 在正常皮肤及瘢痕成纤维细胞中 ,地塞米松均能抑制人α1 (Ⅰ )前胶原基因的启动转录 ,且能拮抗TGFβ1 对人α1 (Ⅰ )