胶原蛋白特异性氨基酸测定方法的改进

目的 建立一种快速、准确、可靠的胶原蛋白定量检测方法。方法 采用 6 3 0 0黄金系统氨基酸分析仪 ,在钠柱 90min程序蛋白质水解分析方法基础上 ,根据羟脯氨酸 (HYP)和羟赖氨酸 (HYL)的特性 ,分别建立了HYP和HYL的快速测定方法 ,并用此方法检测了大白兔尺骨中段骨缺损处再生组织内HYP和HYL的含量。结果 用此方法完成HYP和HYL分析的时间均为 1 8min ,比原方法缩短了 72min,且有较好的重现性 (HYPCV :日内 0 .89% ,日间 1 .2 8% ;HYLCV :日内 2 .6 6 % ,日间 3 .48% )、回收率高 (HYP :97.5 % ;HYL :96 .0 9% )。结论 本方法是一种快速、准确、可靠的胶原蛋白定量检测方法 。

猪皮胶原蛋白水解产物中的抗氧化活性肽的分离及其氨基酸组分

利用不同蛋白酶水解猪皮胶原蛋白,根据水解产物对自由基的清除率,筛选最适蛋白酶的组合,筛选抗氧化活性较高的肽类,并进行氨基酸分析。结果表明:胃蛋白酶→木瓜蛋白酶→菠萝蛋白酶为酶解胶原蛋白的最佳组合;分离纯化得到了三种具有较高抗氧化活性的肽;氨基酸组分分析显示:P1′、P2′和P3′组分具有自由基清除作用的关键氨基酸甲硫氨酸、酪氨酸和组氨酸等。

男性骨特异性碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原氨基末端肽与骨密度的关系

目的探讨男性人群血清骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、血清骨钙素（sOC）和血清Ⅰ型胶原氨基末端肽（sNTX）与BMD的相互关系。方法用ELISA方法测定309名20-80岁男性志愿者的血清骨特异性碱性磷酸酶（sBAP）、血清骨钙素（sOC）和血清Ⅰ型胶原氨基末端肽（sNTX）,用DEXA（双能X线吸收法）测定腰椎正位（AP）L1-L4总体、腰椎侧位、股骨颈、Wards区（华氏区）及髋部总体的面积BMD。结果（1）直线相关分析显示,sOC、sNTX与腰椎正位总体BMD呈负相关,r分别为-0.007,-0.100。BAP与腰椎正位总体、腰椎侧位、髋部总体、股骨颈及Wards区BMD均负相关,r分别为-0.190、-0.087、-0.175、-0.128、-0.128（P〈0.05）。（2）校正年龄、体重指数和吸烟的影响后,sOC和各部位BMD相关性消失;sNTX与腰椎正位总体BMD;BAP与腰椎正位总体、髋部总体、股骨颈及Wards区BMD相关性仍存在,r分别为-0.164、-0.171、-0.148、-0.191、-0.105（P〈0.05）。（3）以50岁为切点,将所有样本按年龄分两段,偏相关分析显示50岁以前sOC、sNTX和BAP与各部位BMD无显著相关;50岁以后除腰椎侧位外,BAP与腰椎正位总体、髋部总体、股骨颈及Wards区BMD负相关,偏相关系数分别为-0.206、-0.256、-0.183、-0.126（P〈0.05）。sOC与各部位BMD无显著相关,sNTX与腰椎正位总体显著负相关,偏相关系数为-0.202（P〈0.05）。（4）按BMD分组,方差分析显示50岁以上年龄匹配男性骨质疏松组BAP高于正常对照组与低骨量组,NTX高于正常对照组（P〈0.05）。（5）分别以各部位BMD为应变量,年龄、BMI、吸烟（每日吸烟数量×烟龄）、BAP、sOC和sNTX为自变量,进行多元逐步线性回归分析。年龄、体重指数为各部位BMD的独立决定因子;吸烟为腰椎正位总体、髋部总体及Wards区BMD的独立决定因子。BAP为腰椎正位总体,髋部总体,股骨颈及Wards区BMD的独立决定因子,解释其BMD变化的百分数分别为16.5%、18.0%、13.4%、10.8%。（P均〈0.05）;sNTX为腰椎正位总体BMD的独立决定因子,解释腰椎正位总体BMD变化的15.7%。结论（1）校正年龄、体重指数和吸烟后,50岁以上男性BAP与腰椎正位总体、髋部总体、股骨颈及Wards区BMD,sNTX与腰椎正位总体BMD均呈负相关,BAP与sNTX均为50岁以上男性BMD的独立决定因子。（2）50岁以上男性骨质疏松组BAP显著高于正常对照组与低骨量组,NTX高于正常对照组,较高的骨代谢转换水平与较低的BMD相关联。（3）年龄、体重指数与吸烟均为各部位BMD的独立影响因素。

根据Ⅰ型胶原氨基端末肽、Ⅰ型胶原羧基端末肽、骨钙素及骨特异性碱性磷酸酶早期诊断骨不连

背景:对血液中骨代谢标志物的浓度进行检测以对骨折愈合情况进行评估具有使用简单、创伤小、变异小的特点,如何找到一种合适的标志物以预测骨不连的发生是当前该领域研究的热点。目的:建立骨折不愈合动物模型,探讨实验性骨折不愈合的生化指标变化规律。方法:选取五六月龄纯种新西兰大白兔20只,随机均分为2组,骨缺损组在左前臂桡骨中段截除1.5 cm(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔;骨折组只是在前臂桡骨中段造成骨折。2组分别于术前、术后2-8,10,12周进行前臂的X射线片检查观察桡骨缺损区愈合情况,并抽取血清采用生物素双抗体夹心ELISA法检测骨吸收特异标志物(包括Ⅰ型胶原羧基端末肽、Ⅰ型胶原氨基端末肽、人抗酒石酸酸性磷酸酶5b)及骨形成特异标志物(包括骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶)的表达变化。结果与结论:1分析2组手术前后骨代谢指标的变化发现,骨缺损组骨代谢一直持续在较高水平,骨不连早期诊断的临床预测可以依赖于多个血清生化指标的同时跟踪监测;2除人抗酒石酸酸性磷酸酶5b意义不大之外,骨缺损组中I型胶原羧基端末肽在术后第5周均值最高,骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原氨基端末肽在术后4或5周均值明显下降,可以说明Ⅰ型胶原羧基端末肽、Ⅰ型胶原氨基端末肽、骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶能快速随骨形成和骨吸收而迅速改变,敏感地反映体内骨代谢的具体状态;3系统性监测生化指标如Ⅰ型胶原羧基端末肽、骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原氨基端末肽的变化能反映兔骨折不愈合的早期进程,它们是否均可以作为反映骨吸收与骨形成的敏感性、特异性较强的指标,是否可以早期诊断兔骨不连,需要进一步深入探讨。

部分哺乳动物和鱼类胶原蛋白中氨基酸的组成和含量的比较

采用日立L-8800型氨基酸自动分析仪分析了部分哺乳动物e和e各氨基酸含量的差异为胶原蛋白的合理开发应用提供参考。结果表明各样品中均含有18种氨基酸,其中必需和半必需氨基酸有8种,但苏氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)和羟脯氨酸(Hyp)含量有明显差别。

青光安有效组分对兔青光眼术后滤过道瘢痕组织中胶原纤维、成纤维细胞特异性蛋白-1、结缔组织生长因子及转化生长因子-β1表达的影响

目的观察青光安4种有效组分对兔青光眼术后滤过道瘢痕组织中胶原纤维、成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1)、结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响,对比青光安4种有效组分及青光安混悬液抗滤过道瘢痕化的效果。方法采用青光眼滤过手术制作动物模型。实验兔按体质量随机分为空白组(A组)、模型组(手术对照组,B组)、丝裂霉素C组(C组)、有效组分1组(D组)、有效组分2组(E组)、有效组分3组(F组)、有效组分4组(G组)和青光安混悬液组(H组)。各给药组给予相应药物。观察各组兔滤过道瘢痕组织中胶原纤维、FSP-1、CTGF、TGF-β1水平。结果术后C、E、H组兔眼压回升缓慢,眼压值较术前和A组差异均有统计学意义(P<0.05);胶原纤维面积比值除B、D、G组外,其他各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);FSP-1表达除B、G组外,其他各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);CTGF表达除B、D、G组外,其他各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);TGF-β1表达除B、G组外,其他各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论青光安有效组分2、丝裂霉素C及青光安混悬液通过抑制胶原纤维、FSP-1、CTGF、TGF-β1的表达,降低肌成纤维细胞和成纤维细胞的增殖,从而减少滤过道瘢痕组织的增生,有明显抗青光眼术后滤过道瘢痕化的作用,青光安有效组分2和青光安混悬液抑制滤过道瘢痕化效果基本相当。

骨特异性碱性磷酸酶联合Ⅰ型前胶原氨基端延长肽和其特殊序列在糖尿病骨质疏松中的应用

目前认为1型糖尿病可降低骨密度（BMD），导致骨质疏松（OP），但2型糖尿病对BMD的影响仍有争议。本文拟探讨骨特异性碱性磷酶酶（BAP）、总Ⅰ型前胶原氨基端延长肽（TPINP）和其特殊序列（β-CTx）水平与2型糖尿病OP的关系。

利用皮边角料提取食品级胶原蛋白/多肽(Ⅰ)──氨基酸组成分析和分子量测定

研究利用皮边角料提取食品级胶原蛋白 ,不仅能解决制革固体废弃物的污染 ,而且可为皮胶原生物质的非制革利用 ,提供一些研究思路。着重介绍从皮边角料中提取的胶原蛋白 /多肽的氨基酸组成分析和分子量测定的方法 ,及其与制备工艺的关联性。

胶原蛋白肽氨基酸组成对小鼠肠道吸收的影响研究

研究了胶原蛋白肽氨基酸组成对其在小鼠体内吸收程度的影响。利用离子交换层析分别制备出富含碱性和酸性氨基酸的胶原蛋白肽,小鼠灌胃后检测了血清中羟脯氨酸和胶原蛋白降解后的多肽相对丰度的差异。氨基酸组成分析结果表明阳离子交换层析制备的胶原蛋白肽(CPC)富含精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys),含量比未经过层析分离的多肽(CPo)分别高12.2%和7.4%。阴离子交换制备的多肽(CPA)中Arg和Lys含量比CPo低18.3%和26.5%。通过离子阱质谱技术从CPC中检测到9种含Arg或Lys的多肽,其含量远大于CPA中的含量。动物实验结果表明CPC在小鼠体内吸收高于CPA,小鼠血清中CPC在吸收峰值时Hyp的浓度是CPA的1.39倍,采用三重四级杆质谱(TSQ)从CPC灌胃后小鼠血清中检测出含Hyp的寡肽(Ser-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp),3种寡肽分别是CPA灌胃后小鼠血清中浓度的2.1、1.48和1.51倍,初步证明了氨基酸组成是影响胶原蛋白肽在小鼠体内吸收的重要因素。

革屑提取胶原蛋白制备含氨基酸水溶肥的研究

以废弃革屑为原料,采用氧化钙水解革屑提取胶原蛋白,采用硫酸将胶原蛋白水解成便于植物吸收的氨基酸和小分子肽,螯合金属铁、锌、铜、锰,制备了微量元素型含氨基酸水溶肥料。硫酸的最佳水解工艺为:水解温度110℃,硫酸用量为胶原蛋白的1.25倍,水解率可达91%。液体中游离氨基酸总量为231g/L,高出行业指标131%。制备的微量元素型含氨基酸水溶肥料符合液体产品的技术指标和重金属限量要求。

毛细管气相色谱测定胶原蛋白和卵清蛋白氨基酸

讨论了纳克量级(ppb)的18种氨基酸在石英毛细管住气相色谱的分离和定量测定。用此法对胶原蛋白和卵清蛋白水解氨基酸进行了定量。结果的精确度为0.8～7.3%。氨基酸的衍生化采用N-TFA-butyl系统,分二步完成,第一步在酸性介质中用亚丁醇酯化;第二步是用三氟醋酐酰化。氨基酸回收率在85%以上。蛋白质水解在6N恒沸点盐酸中充氮气,在145±2℃加热4小时完成。

氨基酸组成及分子表面属性对胶原与盘状结构域受体DDR2结合能力的影响

本工作利用ELISA实验和细胞黏附实验研究了不同物种来源的胶原样本与盘状结构域受体DDR2及人舌鳞癌细胞CAL-27的结合能力,并进一步探讨了氨基酸组成对胶原与细胞受体DDR2结合能力的影响。结果表明,不同来源的胶原样本与DDR2及CAL-27细胞的结合能力存在显著性差异,其中,哺乳动物胶原的结合能力明显大于鱼类胶原,各鱼类胶原之间也存在差异性。通过分析胶原蛋白的氨基酸组成与胶原-受体DDR2结合能力之间的相关性可知,胶原-DDR2结合能力与天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酸性氨基酸、带电荷极性氨基酸、非极性氨基酸呈负相关,与羟脯氨酸、亚氨基酸、羟基化率(%)、不带电荷极性氨基酸、总极性氨基酸呈正相关(P<0.05)。与此同时,进一步研究了胶原蛋白分子的表面属性对胶原-受体DDR2结合能力的影响。分析表明,较低的Zeta电位绝对值或较高的亲水性均有助于胶原与DDR2的结合。

荧光免疫分析法、酶联免疫吸附试验和乳胶增强免疫比浊法检测胃蛋白酶原的敏感度和特异性分析

目的观察分析检测胃蛋白酶原(PG)使用荧光免疫法(TRFIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶增强免疫比浊三种检测方法分析其特异性和敏感性。方法使用以上三种检测方式检测129名胃癌患者称之为胃癌组和147名正常患者称之为正常组,对比分析其血清当中的PG亚群PG1和PG2的含有量以及两者之间的比值(PGR)。结果在敏感度上TRFIA为76.79%,ELISA为72.88%,乳胶增强免疫比浊为74.57%,差异无统计学意义(P>0.05)。在特异度上TRFIA为74.15%,ELISA为82.99%,乳胶增强免疫比浊为76.87%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论三种检测方式特异性敏感度差异无意义,无可比性,因此三种检测方式的选择主要看医院已有的设备和检测费用,ELISA成本较低可作为基层医院首要选择,有全自动生化分析仪的规模较大医院可选择乳胶增强免疫比浊方法,而配有先进荧光免疫分析仪的医院可选择TRFIA方式。

骨质疏松性椎体压缩骨折术后唑来膦酸治疗患者血清骨特异性碱性磷酸酶β胶原降解产物变化与再发椎体骨折的关系

目的探讨骨质疏松性椎体压缩骨折术后唑来膦酸治疗患者血清骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、β胶原降解产物(β-CTX)变化与再发椎体骨折的关系。方法选取2020年4月至2022年3月浙江绿城心血管病医院因骨质疏松椎体压缩性骨折(OVCF)行经皮椎体成形术(PVP)/经皮椎体后凸成形术(PKP)联合唑来膦酸治疗的患者共156例,根据术后2年有无再发椎体骨折分为再骨折组和未再骨折组,比较术前1 d、术后1个月、3个月2组血清BSAP、β-CTX水平变化;采用Logistic回归模型分析OVCF术后再发骨折的危险因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清BSAP、β-CTX对OVCF术后再发骨折风险的预测价值。结果随访2年期间共有29例(18.6%)患者再发椎体骨折。术前1 d、术后1个月、3个月,再骨折组血清BSAP[(23.3±4.3)U/L、(21.6±4.0)U/L、(17.6±3.3)U/L]、β-CTX[(582±55)pg/ml、(535±41)pg/ml、(498±58)pg/ml]水平均高于未再骨折组的BSAP[(18.3±5.0)U/L、(16.7±4.0)U/L、(13.0±2.7)U/L]、β-CTX[(551±53)pg/ml、(503±51)pg/ml、(467±38)pg/ml]水平(P<0.05);与术前1 d相比,术后1个月、3个月,2组血清BSAP、β-CTX水平均降低,且术后3个月低于术后1个月(P<0.05);再骨折组的年龄、Cobb角改变、骨水泥弥散较差占比均高于未再骨折组,术前骨密度值低于未再骨折组(P<0.05)。多因素Logistic回归模型分析发现,术前1 d血清BSAP、β-CTX较高、年龄高、骨水泥弥散较差为OVCF唑来膦酸联合PVP/PKP术后再发骨折的独立危险因素,术前骨密度较高为独立保护因素(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,术前骨密度与血清BSAP、β-CTX均呈负相关(r=-0.524、-0.469,P均<0.01)。ROC结果显示,术前1 d、术后1个月、3个月血清BSAP预测OVCF唑来膦酸联合PVP/PKP术后再发椎体骨折的风险AUC(95%CI)分别为0.856(0.783,0.923)、0.606(0.518,0.690)、0.635(0.547,0.717),血清β-CTX为0.873(0.762,0.941)、0.691(0.607,0.768)、0.703(0.618,0.779),其中术前1 d血清BSAP、β-CTX预测价值最高(P<0.05)。结论术前血清BSAP、β-CTX、年龄、术前骨密度、骨水泥弥散情况均与唑来膦酸联合PVP/PKP治疗OVCF术后再发骨折的相关,且术前血清BSAP、β-CTX水平对预测OVCF术后再发椎体骨折有重要意义。

MMP-2/9和Ⅳ型胶原蛋白与胃癌患者胃液芳香族氨基酸浓度变化的关系

目的探讨基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌患者胃液芳香族氨基酸(aromatic amino acids,AAAs)浓度异常升高之间的关系。方法收集2015年12月~2016年8月胃镜检查120例符合入排标准患者的胃黏膜组织和胃液标本。根据病理诊断结果分为胃癌组(GC,n=29)和胃良性病变组(NGD,n=91)。应用免疫组织化学法和液相色谱串联质谱法对胃黏膜组织中MMP-2/9和ColⅣ蛋白的表达情况及胃液中3种AAAs(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)进行检测。比较MMP-2/9和ColⅣ蛋白在GC和NGD组间表达的差异,并与胃液中3种AAAs的浓度进行相关性分析。结果 (1)GC组MMP-2/9蛋白的表达水平均显著高于NGD组,ColⅣ蛋白的表达水平显著低于NGD组(P均=0.000);MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平呈正相关关系(ρ=0.418,P=0.000),二者均与ColⅣ蛋白的表达水平呈负相关关系(MMP-2:ρ=-0.454,P=0.000;MMP-9:ρ=-0.383,P=0.000)。(2)GC组胃液3种AAAs浓度均显著高于NGD组(P均=0.000)。(3)胃黏膜组织中MMP-2/9蛋白的表达水平与胃液中3种AAAs浓度均呈正相关关系(MMP-2:ρ=0.262、0.295、0.293,P=0.004、0.001、0.001;MMP-9:ρ=0.442、0.437、0.400,P均=0.000),ColⅣ蛋白的表达水平与胃液中3种AAAs浓度呈负相关关系(ρ=-0.283、-0.280、-0.273,P=0.002、0.002、0.003)。结论胃癌组织通过上调MMP-2/9蛋白的表达,降解基底膜和细胞外基质中ColⅣ蛋白,可能是引起胃癌患者胃液AAAs浓度异常升高的原因之一。

胰酶水解猪皮胶原蛋白及其产物氨基酸分析

采用胰酶水解猪皮胶原蛋白,研究其降解规律及酶解产物氨基酸组成。研究表明:95℃热处理猪皮胶原蛋白10min能显著提高酶解速率;整个酶解过程中,可溶性氮、氨肽氮含量呈增加趋势,但3h后增势变缓,而肽含量在3h后达到最大值;大部分不溶性蛋白在酶解6h后已经变成可溶性多肽和氨基酸;从酶解产物氨基酸组成可表明,采用胰酶水解猪皮胶原蛋白能显著提高其营养价值。

煤工尘肺患者神经元特异性烯醇化酶、纤维蛋白原等指标的表达水平及其在尘肺诊断与进展中的价值

目的:探讨煤工尘肺患者神经元特异性烯醇化酶(NSE)、纤维蛋白原(FIB)等指标的表达水平及其在尘肺诊断与进展中的价值.方法:选取2022年1月至2023年12月河南省第三人民医院收治的119例煤工尘肺患者作为研究对象,纳入研究组;另选取同期80例健康体检者纳入对照组.比较两组患者NSE、FIB、白蛋白与球蛋白比值(A/G)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR),比较不同期别尘肺患者各项检测指标差异,分析各指标联合检测在尘肺病诊断中的价值.结果:研究组患者NSE、FIB、NLR均高于对照组,A/G低于对照组(P<0.05);Ⅲ期尘肺患者NSE、FIB、NLR高于Ⅰ期患者,且NSE高于Ⅱ期患者(P<0.05);NSE、FIB、A/G、NLR联合检测诊断尘肺病的曲线下面积(AUC)为0.893,灵敏度为0.840,特异度为0.812,均高于单一指标检测.结论:煤工尘肺体内NSE、FIB、A/G、NLR异常,且NSE、FIB、NLR与疾病分期有关,各指标联合检测可提高尘肺病检出率.

二层龋坏牙本质胶原蛋白中氨基酸含量测定及其临床意义

目的 探讨牙本质龋损中胶原蛋白的变化特点 ,为临床牙本质龋的预防与治疗提供参考依据。方法 实验采用氨基酸自动分析仪测量正常和二层龋坏牙本质龋胶原蛋白中 1 8种氨基酸含量。结果 (1 )正常与内层龋坏牙本质胶原蛋白中 1 8种氨基酸含量无明显差别。 (2 )外层龋坏牙本质胶原蛋白除甘氨酸明显增高外 ,其余氨基酸含量明显低于正常及龋坏内层牙本质中的胶原蛋白。结论 说明牙本质发生龋损时 ,内层龋坏牙本质中的胶原蛋白 ,在其氨基酸含量及构成比方面无显著改变 ,同正常牙本质胶原蛋白 本质胶原蛋白一样为I型胶原 ;而外层龋坏牙本质中的胶原蛋白则发生了明显变化 。

梅花鹿副产品中氨基酸及胶原蛋白含量的测定与分析

为比较不同梅花鹿副产品中氨基酸及胶原蛋白含量的差异,本研究采用氨基酸自动分析仪测定4种梅花鹿副产品中18种氨基酸的含量,进而换算成胶原蛋白含量。结果表明,鹿鞭中氨基酸总量(84.24%)及必需氨基酸含量(17.08%)最高;胶原蛋白在鹿鞭中含量最高,在鹿骨中含量最低。本研究可为梅花鹿副产品的精深加工与利用提供理论依据。