乌鳢鱼皮中胶原蛋白的提取工艺及特性研究

该研究利用醋酸和胃蛋白酶结合从乌鳢鱼皮中提取胶原蛋白。采用单因素试验和正交试验考察了醋酸浓度、料液比、酶用量、提取时间等条件对胶原蛋白提取率的影响。结果表明,当醋酸的浓度为0.5 mol/L,胃蛋白酶的添加量为鱼皮质量的1%,提取时间48 h,料液比1∶70,胶原蛋白提取率达到51.2%。通过氨基酸组成分析、圆二色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对胶原蛋白的结构进行测试,发现该法提取的胶原蛋白具有典型Ⅰ型胶原蛋白特征,其三螺旋结构保持完整,分子质量约为340 kDa。成品中蛋白质含量>95%,羟脯氨酸的含量>5%,灰分<1%(均为质量分数),可用于医用材料、化妆品、功能食品等领域。

补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响

背景:胶原蛋白是含量最为丰富的胞外基质成分,与骨骼肌细胞外基质的结构、功能密切相关,但补充由生物工程技术生产的重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen,rhC)对骨骼肌细胞外基质的影响及机制尚不清楚。目的:探讨补充rhC对离心运动后骨骼肌细胞外基质重塑的影响及作用机制。方法:将104只8周龄健康雄性C57小鼠随机分为对照组(生理盐水)、rhC低剂量组(0.2 g/kg)、中剂量组(1.0 g/kg)和高剂量组(2.0 g/kg),连续7 d灌胃干预后每组选取2只小鼠,解剖各脏器进行苏木精-伊红染色判断炎性浸润情况,其余小鼠于第8天进行离心运动,分别在离心运动后即刻(0),24,48,96 h观察细胞外基质结构变化,检测小鼠抓握力、血清肌酸激酶活性、骨骼肌组织基质金属蛋白酶2,9,14和基质金属蛋白酶抑制剂2的蛋白水平。结果与结论:①苏木精-伊红染色观察短期补充rhC对心脏、肝脏、脾、肾无显著影响;②一次性离心运动后,rhC中、高剂量组小鼠抓握力恢复率显著升高(P<0.01);③各组肌酸激酶变化趋势一致,组间无显著性差异;④rhC低剂量组细胞外基质恢复进程快于对照组,rhC中、高剂量组肌束膜较为完整;⑤rhC高剂量组基质金属蛋白酶9蛋白水平显著降低(P<0.05);⑥rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶14蛋白水平显著降低(P<0.05);⑦rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶2蛋白水平显著降低(P<0.05);⑧rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白水平显著升高(P<0.05);⑨rhC各剂量组基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶抑制剂2比值显著降低(P<0.05)。该研究发现连续7 d预补充1.0,2.0 g/kg rhC可通过调节基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂来抑制运动后骨骼肌细胞外基质降解,从而促进小鼠骨骼肌力量恢复。

沙丁鱼鱼鳞胶原蛋白肽的制备及其抗氧化活性研究

目的优化沙丁鱼(Sardinapilchardus)鱼鳞胶原蛋白肽的制备工艺和评价不同分子量大小胶原蛋白肽的抗氧化活性。方法以沙丁鱼鱼鳞为原料,通过酶工程结合单因素与响应面实验优化胶原蛋白肽制备工艺,采用超滤膜分级分离鱼鳞胶原蛋白肽,并通过体外自由基化学体系分析对比不同分子量大小(10、5、1 kDa)的胶原蛋白肽的抗氧化活性。结果采用碱性蛋白酶进行酶解鱼鳞,胶原蛋白肽的得率最高;最优酶解工艺参数为:碱性蛋白酶加酶量7526 U/g、料液比1:20(g/mL)、pH 10.5、酶解温度67℃、酶解时间4 h,此条件下鱼鳞胶原蛋白肽得率最高,达43.44%±1.59%。通过超滤获得的分子量小于1k Da的鱼鳞胶原蛋白肽对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羟基自由基(hydroxyl radical,·OH)的清除能力最强,其半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为0.72 mg/mL和1.76 mg/mL;分子量为1~5 kDa的鱼鳞胶原蛋白肽对超氧阴离子自由基(superoxide radical,O^(2-)·)的清除效果最好,其IC50为1.45 mg/mL。结论碱性蛋白酶能够有效制备鱼鳞胶原蛋白肽,且小于1 kDa的鱼鳞胶原蛋白肽抗氧化活性最好。

复合酶酶解法制备中华草龟皮胶原蛋白肽的工艺优化

该研究探讨了不同种类蛋白酶对中华草龟皮胶原蛋白酶解液的水解度和DPPH自由基清除率的影响,并进一步研究了复合蛋白酶对胶原蛋白的酶解效果。此外,通过正交试验优化了复合酶酶解条件。结果表明,由胰蛋白酶和碱性蛋白酶按1∶1组成的复合酶对龟皮胶原蛋白进行酶解,可显著提高酶解液的水解度和DPPH自由基的清除率(P<0.05);优化的复合酶酶解工艺为复合酶添加量5000 U/g、酶解pH值7.5、酶解温度50℃、酶解时间3 h,在该酶解工艺条件下,水解度达(51.19±2.45)%,DPPH自由基清除率达(51.78±2.21)%。影响复合酶酶解效果的主次顺序为酶添加量>酶解pH值>酶解时间>酶解温度。

大黄素对胶原诱导性关节炎大鼠的骨保护作用:基于抑制铁死亡和降解基质金属蛋白酶

目的探讨大黄素对类风湿关节炎(RA)铁死亡相关信号通路介导的骨保护作用机制。方法除正常组外,使用200μL不完全弗氏佐剂乳化的牛二型胶原构建胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的类风湿关节炎模型。21 d后分为正常组(Normal)、模型组(Model)、甲氨蝶呤组(MTX,0.2 mg/kg,3次/周)、大黄素(Emo)高(80 mg·kg^(-1)·d^(-1))、低(40 mg·kg^(-1)·d^(-1))剂量组,10只/组。记录大鼠造模之后的关节炎评分和足趾体积;使用丙二醛(MDA)试剂盒检测组织MDA含量;用番红固绿染色法、苏木精-伊红染色法对踝关节石蜡切片进行染色,光镜下观察大鼠踝关节组织形态学改变;用免疫组织化学法对踝关节切片的基质金属蛋白酶(MMP)3、13进行染色,光镜下观察大鼠踝关节MMPs的表达;Western blot法检测大鼠踝关节组织中长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白重链1(FTH1)的蛋白质含量。结果与正常组相比,模型组大鼠的关节炎评分指数、足趾肿胀度增高(P<0.05);软骨表面粗糙,软骨细胞丢失、排列杂乱稀疏;MDA含量和ACSL4的蛋白质含量升高,SLC7A11、GPX4、FTH1的含量降低(P<0.05);踝关节MMP3和MMP13的表达量升高;与模型组相比,MTX组和大黄素(40 mg/kg、80 mg/kg)组的关节炎评分指数、足趾肿胀度降低(P<0.05),软骨表面相对光滑平整,软骨细胞排列整齐,MDA含量升高(P<0.05);MTX组和大黄素高剂量组ACSL4的蛋白质含量降低,SLC7A11、GPX4、FTH1的含量升高(P<0.05)。结论大黄素能有效控制CIA大鼠关节炎症、改善关节骨侵蚀。调节铁死亡相关信号通路ACSL4、SLC7A11、GPX4、FTH1的含量,降低MMP3和MMP13的表达,可能是其抑制RA骨破坏的重要机制和途径之一。

酶-超声波辅助提取海蜇胶原蛋白及其组成分析

为确定酶-超声波辅助提取海蜇胶原蛋白的最佳工艺,采用单因素实验和响应面实验对工艺进行优化,考察胃蛋白酶添加量、提取时间、超声时间、超声功率对海蜇胶原蛋白得率的影响,并对胶原蛋白的氨基酸组成和结构进行分析。结果表明,酶-超声波辅助提取海蜇胶原蛋白的最佳条件为胃蛋白酶添加量1%、提取时间48 h、超声时间32 min、超声功率318 W,此时海蜇胶原蛋白得率为38.03%。甘氨酸是海蜇胶原蛋白中的主要氨基酸,为24.96%,海蜇胶原蛋白的紫外吸收峰位于235 nm处。在酰胺A、B带以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带中,有海蜇胶原蛋白的典型红外光谱特征吸收峰。该研究为海蜇深加工提供了理论基础。

鲟鱼内源丝氨酸蛋白酶对肌原纤维蛋白凝胶性能的影响

【目的】探究鲟鱼(Acipenser sinensis)内源蛋白酶对肌原纤维蛋白凝胶性能的影响及作用机制,为鲟鱼鱼糜加工及品质提升提供基础。【方法】在鲟鱼肌原纤维蛋白中添加不同蛋白酶抑制剂,并于55℃下进行劣化降解试验,筛选起主要作用的蛋白酶类型,探究该蛋白酶在不同加热模式、不同加热阶段对肌原纤维蛋白降解的水平和主要化学力的影响,以及在动态流变学中对储能模量的影响。【结果】内源丝氨酸蛋白酶在肌原纤维蛋白劣化降解过程中起主要作用,且在不同加热模式下,额外添加鲟鱼内源丝氨酸蛋白酶粗酶组相比对照组,在凝胶化的过程中伴随蛋白质降解,三氯乙酸(TCA)可溶性肽含量显著增加(P <0.05);内源丝氨酸蛋白酶在凝胶形成过程中主要影响了疏水相互作用;动态流变学实验表明,内源丝氨酸蛋白酶的添加会降低凝胶形成的储能模量;扫描电镜观察表明,添加内源丝氨酸蛋白酶致使凝胶微观结构更为松散。【结论】鲟鱼内源丝氨酸蛋白酶一定程度上降低肌原纤维蛋白的凝胶性能。

基于胃蛋白酶耐受性的变性胶原蛋白定量分析方法

基于胶原蛋白的蛋白酶耐受性,建立变性胶原蛋白的定量分析方法。制备6组已知含量比的变性/非变性胶原蛋白混合样品,在液态胶原pH值约2.0的条件下,添加胃蛋白酶对样品中的变性胶原蛋白进行酶切,使其成为短肽,胃蛋白酶与胶原蛋白的质量比为1∶5,温度为30℃,消化24 h;然后采用NaCl沉淀法(NaCl终浓度为2 mol/L)对样品中的非变性胶原蛋白进行沉淀回收,并通过羟脯氨酸测定法检测其含量比。结果显示,6组样品中非变性胶原蛋白的回收率为89.96%~99.24%,表明本方法可以充分酶解变性胶原蛋白,而非变性胶原蛋白得以沉淀回收,可用于定量分析液态或海绵状、粉末状等酸溶性胶原蛋白原料和产品中变性胶原蛋白的含量比。

黑木耳胶原蛋白酶法提取及分离纯化研究

为获得优质的黑木耳胶原蛋白,本研究通过单因素实验和响应面法对碱性蛋白酶法提取黑木耳胶原蛋白的工艺条件进行优化,并采用盐析、DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤等方法对黑木耳胶原蛋白进行分离纯化。结果表明:在酶解温度55℃、pH 8.5条件下优化得到的黑木耳胶原蛋白最佳提取条件为:碱性蛋白酶(2240 IU/mg)添加量7%、料液比1∶68 g/mL、酶解时间2.0 h,此条件下,黑木耳胶原蛋白得率为0.65%;最佳盐析条件为:4 mol/L NaCl、24 h、15℃;最佳DEAE-52分离条件为:洗脱时间160 min、上样浓度300μg/mL、上样pH 7.2、NaCl洗脱浓度0.2 mol/L;经Sephadex G-75凝胶过滤层析后胶原蛋白纯度可达到72.6%,胶原蛋白回收率74.3%。因此,碱性蛋白酶法及盐析、DEAE-52、Sephadex G-75层析可有效提取纯化黑木耳胶原蛋白,为黑木耳胶原蛋白的深入研究及应用开发提供了理论依据。

碱性蛋白酶酶解蛋白制备活性肽的质控研究

以胶原蛋白和大豆分离蛋白为主要研究对象,应用体积排阻色谱(SEC)结合多角度激光光散射(MALLS)及示差折光(RI)联用技术对碱性蛋白酶酶解蛋白制备肽段的过程进行了详细分析。在酶解过程中,不同来源的胶原蛋白(牛、鸡)和大豆分离蛋白在分子量分布、体系的分散度及粒径变化规律上表现出了典型的差异。结果表明,牛胶原蛋白在酶解开始时就迅速被降解产生了大量小分子肽段,鸡胶原蛋白相对于牛胶原蛋白在相同的酶解条件下更难产生小分子肽段,大豆分离蛋白随着酶的加入则是表现出了先聚集再降解的特性。SEC-MALLS技术可以有效把控蛋白酶解的过程以及体系中肽段分子量分布,该技术可以为活性肽产品的开发及品质检测提供依据。

木瓜蛋白酶法制备猪骨胶原多肽工艺条件研究

以实验室自制猪骨胶原蛋白粉为原料,以水解度为指标,采用单因素及正交试验,对木瓜蛋白酶法制备猪骨胶原蛋白多肽的工艺条件进行研究。结果表明:木瓜蛋白酶法制备猪骨胶原蛋多肽适宜条件为反应时间4h,反应温度50℃,pH值为5,酶浓度为600U/g,此时,猪骨胶原蛋白水解度约为16.87%,所得猪骨胶原多肽分子量分布在5kD以下,主要分布于1kD～3kD之间。

猪皮胶原蛋白酶解及其酶解产物的抗氧化活性

以新鲜猪皮为原料,利用Alcalase水解胶原蛋白,并对影响Alcalase水解过程的各个因素进行研究,通过对水解度和超氧阴离子自由基(O-2.)清除率的测定,确定Alcalase水解猪皮胶原蛋白的最适条件;研究在最适条件下制备的不同质量浓度的猪皮胶原蛋白酶解液对DPPH自由基和O-2.的清除效果。结果表明:Alcalase水解猪皮胶原蛋白的最适条件为:pH7.5、温度55℃、酶与底物比6000U/g、底物质量浓度40mg/mL,水解时间4h;在此水解条件下,水解度达到9.55%,O-2.清除率达到60.11%;在相应质量浓度10～50mg/mL范围内,猪皮胶原蛋白酶解液的DPPH自由基最大清除率为95.06%,IC50为3.89mg/mL;O-2.最大清除率为65.89%,IC50为16.43mg/mL。猪皮胶原蛋白酶解液具有较强的自由基清除能力。

响应曲面法优化碱性蛋白酶提取林蛙残体胶原蛋白

以提取林蛙油后的剩余林蛙干残体为原料,通过碱性蛋白酶法提取胶原蛋白。以胶原蛋白提取率为指标,对影响胶原蛋白提取pH值、加酶量、酶解温度和酶解时间4因素进行研究,在单因素试验基础上,采用响应曲面分析法,得出最优酶提取工艺条件,并根据实际生产优化为:pH10、加酶量1.5%、酶解温度50℃、酶解时间2.5h,在此工艺条件下,林蛙残体胶原蛋白提取率为55.38%,胶原蛋白成品的纯度64.15%。

木瓜蛋白酶水解猪皮制备胶原多肽的研究

以新鲜猪皮为原料,利用木瓜蛋白酶水解法制备胶原多肽,并对影响木瓜蛋白酶水解过程的各个因素进行研究。通过对猪皮水解度的测定,确定木瓜蛋白酶水解猪皮制备胶原多肽的最适pH为5,最适温度为60℃,最适酶量为0.9%,最适底物浓度为30%,水解时间3h。在此水解条件下,水解度达到14.91%。

Ⅱ型胶原蛋白酶诱导SD大鼠膝骨关节炎模型的建立

目的建立Ⅱ型胶原蛋白酶诱导的SD大鼠膝骨关节炎模型。方法将SD大鼠20只随机分为A组和B组,每组10只。分别于第1、4天给予A组大鼠膝关节腔内注射Ⅱ型胶原蛋白酶,予B组大鼠膝关节腔内注射生理盐水进行造模。观察两组大鼠第1、3和7天体重的变化,以及第1、4、7天膝关节直径的变化,测定第7天大鼠处死后脾脏、胸腺重量和脏器系数,HE染色观察光镜下膝关节组织的一般形态。结果造模后,A组的体重呈下降、减少趋势,B组的体重呈上升、增长趋势。造模后第3、7天,A、B组间体重比较差异有统计学意义。A组造模后的膝关节直径明显大于造模前,前后比较差异有统计学意义(P<0.01)。B组造模后的膝关节直径与造模前差异无统计学意义(P>0.05)。A组造模后的膝关节直径大于B组,差异有统计学意义(P<0.01)。关节组织HE染色光镜下观察显示,A组的关节呈早期骨关节炎的表现,而B组的关节组织无骨关节炎的表现。结论Ⅱ型胶原蛋白酶可成功建立SD大鼠早期膝骨关节炎模型。体重、膝关节直径、脾脏和胸腺重量、脏器系数及膝关节组织病理这几个指标有助于此模型生理病理特点的观察。

胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的工艺优化与过程模拟

实时检测胃蛋白酶提取猪皮胶原过程中的羟脯氨酸含量，通过计算机软件的处理和模拟，进一步优化胃蛋白酶提取猪皮胶原的工艺条件，同时推测胃蛋白酶的一些重要特性。分别在水解0、2、6、10、14、18、22、26h时，对4组不同胃蛋白酶用量（分别为1％，2％，2．5％，3％）的试样取样检测。采用一阶Hill方程可以较好地模拟胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的进程，并且符合米氏方程的特征；用一阶指数衰减方程则可以表征胃蛋白酶水解速率的衰减过程。最后得出2％的胃蛋白酶用量和6-7h的水解时间较为合理。

木瓜蛋白酶水解鱼鳞胶原蛋白的工艺研究

采用木瓜蛋白酶水解提取鱼鳞胶原蛋白,研究酶解过程中酶解时间、酶解温度、加酶量、pH值对鱼鳞蛋白水解度的影响。通过正交试验设计法,最终确定最佳酶解条件为酶解时间6h、酶解温度50℃、加酶量0.20g、pH5.0。

胃蛋白酶法提取草鱼鳞胶原蛋白的工艺研究

以胃蛋白酶,在酸性条件下对鱼鳞中胶原蛋白进行提取,研究加酶量(E/S)、底物浓度和提取时间3个因素对提取效果的影响。分别通过混合均匀设计和正交实验设计法,最终确定出最佳酶提取条件为:胃蛋白酶30mg/g,3%醋酸80mL/g,恒温(18℃)摇床提取48h。

祛瘀生肌中药对大鼠正常创面肉芽组织中Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶表达的影响

目的探讨祛瘀生肌中药对大鼠正常创面肉芽组织影响的差异。方法以120只大鼠皮肤全层缺损创面为模型,采用免疫组化和图像分析相结合的方法,观察生肌化瘀方及其拆方生肌方和化瘀方对创面修复不同时期肉芽组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和Ⅰ型胶原变化的影响。结果正常组Ⅰ型胶原表达水平明显延迟,MMP-1水平在创伤后3～11天里呈阶梯式增高;生肌方早期可以促进创面Ⅰ型胶原及MMP-1分泌,从创伤后3～11天一直维持在较高水平;化瘀方组MMP-1表达在前7天保持较高水平,与生肌方组比较差异有显著性(P<0.05),创伤后11天降低,显著低于正常组和生肌方组(P<0.05);生肌化瘀方小剂量组促进Ⅰ型胶原分泌有两个高峰时期,即创伤后7天和15天,与正常组比较差异有显著性(P<0.05);生肌化瘀方大剂量组在11天时MMP-1表达显著降低,明显低于正常组(P<0.05)。结论祛瘀生肌中药对实验性创面新生肉芽组织中Ⅰ型胶原及MMP-1表达的影响,可能是在创面愈合的过程中,通过抑制MMP-1的分泌,从而使创面Ⅰ型胶原的分泌增加,起到促进创面愈合的作用。

胃蛋白酶提取猪皮胶原的研究

采用酶法提取猪皮胶原,找出最佳工艺条件。在此基础上,以酶用量为主要参数设计试验,对水解过程进行了在线检测,同时用数学方法对该过程进行了模拟分析。结果表明,酶法水解的最佳条件是:酶用量2.0%、pH值2.2、液比50及4℃条件下水解作用8h最为理想。所得到的胶原海绵的总蛋白质含量为(80.62±2.03)%,羟脯氨酸含量为(8.65±0.76)%。