小鼠肝组织经胶原酶Ⅳ不同时长原位消化后Kupffer细胞的分选效果及其肿瘤细胞吞噬功能观察

目的 观察小鼠肝组织经胶原酶Ⅳ不同时长原位消化后Kupffer细胞的分选效果及其肿瘤细胞吞噬功能。方法 用0.04%胶原酶Ⅳ进行小鼠肝脏原位灌注及肝脏组织消化,根据消化时间长短(5、10、20 min)分为5 min消化组、10 min消化组、20 min消化组。Percoll密度梯度离心后获取肝脏非实质细胞(NPC),通过台盼蓝染色计算细胞活率;免疫细胞磁珠分选(MACS)分选Kupffer细胞后通过台盼蓝染色计数Kupffer细胞总数,除以NPC总数,获得Kupffer细胞MACS分选后占比;光学显微镜观察Kupffer细胞形态学变化;流式细胞术分析Kupffer细胞在MACS分选前占NPC总数的比例,再用Kupffer细胞MACS分选后占比除以分选前占比得到MACS分选得率。体外共培养MACS分选所得Kupffer细胞与肿瘤细胞,流式细胞术检测Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。结果 胶原酶Ⅳ灌注后的肝组织在0.04%胶原酶Ⅳ中于37℃继续消化5 min时NPC总活率、MACS分选的Kupffer细胞数目及Kupffer细胞占NPC的比例、MACS分选得率和细胞形态分析都显示提取效果更佳;且消化5 min时Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬活性显著高于消化10 min和20 min消化组。结论 适当的胶原酶Ⅳ消化时间对Kupffer细胞肝脏原位灌注结合MACS提取是有利的,而且也更有助于Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。

采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型

目的 利用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型 ,并研究血肿形成速度和血肿形成大小的影响因素。方法 使用健康雄性 2 0 0～ 2 5 0gWistar大鼠 ,随机分组 ,分别脑内尾状核注射不同容积Ⅳ型胶原酶 肝素生理盐水溶液、单纯Ⅳ型胶原酶生理盐水溶液、单纯生理盐水 ,于术后 6h、12h、2 4h、3d、7d分别观察冰冻切片连续切片血肿大小。结果 单纯生理盐水注射仅引起 12h内的针道渗血 ,单纯胶原酶生理盐水注射 3d可以形成直径 3mm左右的血肿 ,Ⅳ型胶原酶 肝素生理盐水注射 2 4h可形成直径 3mm左右的血肿。结论 Ⅳ型胶原酶 肝素生理盐水注射可以建立理想稳定的脑出血动物模型 。

抗Ⅳ型胶原酶单抗在人肺癌裸鼠移植模型中的免疫显像

背景与目的:基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)在肿瘤生长和转移的多个环节发挥着重要作用,Ⅳ型胶原酶作为MMPs家族的重要成员之一已成为肿瘤研究的新靶点。本文通过荷瘤裸鼠的显像实验,评价抗Ⅳ型胶原酶单克隆抗体3G11的体内特异性分布。方法:用Iodogen法将131I或125I标记亲和纯化的单抗3G11,ELISA检测标记前后单抗的活性变化。131I-3G11在3种不同体系(生理盐水,小牛血清,裸鼠血清)中37℃温育,检测体外稳定性。每只正常BALB/c小鼠静脉注入388.5kBq125I-3G11,测定单抗的药动学指标。建立人高转移PG肺癌细胞移植肿瘤模型的BALB/c(nu/nu)裸鼠每只静脉注入6.44MBq131I-3G11,进行免疫显像。结果:单抗3G11经亲和纯化后纯度大于98%,碘标记使单抗活性降低10%～20%。单抗3G11的体内代谢呈二室模型分布,T1/2α为7.2h,T1/2β为345.2h。131I-3G11标记物体外72h能基本保持稳定,在荷瘤裸鼠体内72h显像清晰,至120h效果更明显。结论:显像实验证明单抗3G11对肿瘤组织有较好的特异性和亲和性。

内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对肿瘤细胞侵袭和增殖的抑制作用

背景与目的:侵袭转移是恶性肿瘤细胞的重要特性,Ⅳ型胶原酶(包括基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9)在恶性肿瘤转移扩散中发挥着极其重要的作用。我们通过胞内抗体技术,阻断Ⅳ型胶原酶的分泌,以期达到抑制恶性肿瘤细胞侵袭转移的效果。方法:构建编码可在内质网滞留的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的表达载体pcDNA3.1-ER.scFv,并转染入人巨细胞肺癌PG细胞系内。Westernblot检测pcDNA3.1-ER.scFv的表达,免疫共沉淀实验分析胞内抗体ER.scFv在PG细胞内与靶蛋白相互作用情况,明胶酶谱检测Ⅳ型胶原酶的分泌,以及体外侵袭和增殖实验。结果:ER.scFv在PG细胞内表达,而且能够识别和结合靶蛋白基质金属蛋白酶9。通过胞内抗体的基因转染,显著抑制了Ⅳ型胶原酶的功能和活性。ER.scFv转染的PG细胞较野生型和空白质粒组,侵袭能力明显降低,抑制率为76.3%(P<0.05),在Matrigel上进行细胞培养,ER.scFv对PG细胞有明显的抗增殖效果。结论:内质网滞留型胞内抗体技术可以在蛋白加工、分泌这一关键通路中抑制肿瘤细胞Ⅳ型胶原酶的活性,进而抑制了肿瘤侵袭和增殖,在肿瘤基因治疗中具有应用前景。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)在大肠杆菌的表达及其抗肿瘤活性

目的制备抗IV型胶原酶单链抗体(scFv),用于构建小型化抗肿瘤抗体靶向药物。方法构建重组表达质粒pET-scFv,并在大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,分步透析复性。ELISA法、免疫细胞化学染色法检测scFv对靶抗原和肿瘤细胞的结合活性,明胶酶谱法检测对IV型胶原酶活性的抑制作用。Boyden Chamber法测定对肿瘤细胞侵袭的影响。动物试验肿瘤模型检测在小鼠体内的抗肿瘤活性。结果表达的单链抗体scFv(3G11)以包涵体的形式存在,经变性和复性后,对抗原IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应呈阳性,抗体亲和常数为6×107/mol/L。不仅可以抑制HT-29细胞和HT-1080细胞分泌的Ⅳ型胶原酶活性,还可以体外抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制程度与浓度呈剂量依赖关系。scFv(3G11)4mg/kg对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤率为49.4%(P<0.01)。结论scFv(3G11)保留了完整抗体的抗原结合和抑制活性,能够与肿瘤细胞特异性结合,并在小鼠体内有中度抑瘤效果。scFv(3G11)的相对分子质量远小于完整抗体,可作为肿瘤靶向药物的理想载体。

表位九肽库的构建及人Ⅳ型胶原酶特异结合肽的筛选

将人工合成的编码九肽的随机序列ＤＮＡ片段克隆进丝状噬菌体表达载体ｆＵＳＥ５，经多次电击转化和表达，获得肽段与噬菌体ｐⅢ蛋白融合并展示在噬菌体表面的随机序列九肽表位肽库。库容量达１０１０个克隆。以Ⅳ型胶原酶为靶蛋白，采用亲和纯化筛选模式，从中筛选出Ⅳ型胶原酶结合肽。进一步ＥＬＩＳＡ检测筛选出与Ⅳ型胶原酶特异结合的２０个阳性克隆。序列分析发现一组肽含有ＷＤＸＸＤ的共同序列，一组含有ＷＶＧＸＸＲ的共同序列。其中ＷＤＸＸＤ的序列与Ⅳ型胶原酶单链抗体可变区序列同源。结果表明，多肽库是筛选蛋白特异结合肽的有力工具，表位九肽库的构建和筛选方法的建立为进一步应用筛选具有高亲和力的特异结合肽奠定了基础。

检测腹水中血管内皮生长因子和Ⅳ型胶原酶对鉴别良恶性腹水的意义

目的 检测腹水中血管内皮生长因子 (VEGF)和IV型胶原酶 ,为临床腹水定性诊断提供依据。方法 收集各种类型腹水 ,采用ELISA法检测VEGF含量 ,用明胶酶谱法检测IV型胶原酶活性。结果 恶性腹水中VEGF水平为 ( 64 0 .74± 2 64 .81)pg/ml ,明显高于肝硬化腹水和结核性腹水 (P值均 <0 .0 1)。肝硬化腹水和结核性腹水不能检出基质金属蛋白酶 2 , 9(MMP 2 , 9) ,而恶性腹水MMP 2检出率为 87.0 % ,MMP 9检出率为 78.3 % ,且MMP 2活性高于MMP 9活性 (P <0 .0 5 )。结论 恶性腹水VEGF水平显著升高且IV型胶原酶阳性。VEGF、IV型胶原酶对良、恶性腹水的鉴别诊断有重要价值 。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的表达及其对肿瘤细胞侵袭的抑制作用

目的:制备抑制肿瘤细胞侵袭转移的单链抗体片段,用于构建小型化的免疫偶联物。方法:应用噬菌体呈现技术,以产生抗Ⅳ型胶原酶单抗的杂交瘤细胞为基础克隆构建单链抗体(scFv)基因。以表达质粒pET30a+为载体在大肠杆菌中进行诱导表达。ELISA法测定表达产物的免疫反应性,明胶酶谱法测定表达产物对靶酶活性的影响。BoydenChamber测定表达产物对肿瘤细胞侵袭的影响。结果:表达的单链抗体以包涵体形式存在,经变性和复性后,检测表明表达产物保留了对抗原的免疫反应性,对高转移性人肺癌PG细胞分泌的Ⅳ型胶原酶有抑制作用。同时在体外能抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制率与表达产物的剂量浓度相关,1mg/ml浓度的片段具有68%的抑制率。结论:运用基因工程手段获得的单链抗体片段保留了亲本抗体的若干特性,对Ⅳ型胶原酶有抑制作用,并能抑制肿瘤细胞的侵袭。

尿Ⅳ型胶原酶免疫测定法的建立及其在糖尿病肾病中的应用

目的 通过建立一种简便、灵敏的双抗体夹心酶联免疫吸附法 (ELISA)检测尿Ⅳ型胶原 (ⅣC) ,探讨糖尿病 (DM )患者肾小球基底膜代谢状况以及尿ⅣC对糖尿病肾病 (DN)的诊断价值。方法 检测 5 0名正常人和 12 7例DM患者的血清ⅣC及尿ⅣC。并将 12 7例DM患者根据其 2 4h尿白蛋白 (Alb)排泄率 (UAE)分成 3组 :UAE <30mg/ 2 4h(A组 )、30mg/ 2 4h <UAE <30 0mg/ 2 4h(B组 )、UAE >30 0mg/ 2 4h(C组 )。 结果 双抗体夹心ELISA检测尿ⅣC ,灵敏度为 1.2ng/ml;批内变异系数 (CV)为 5 .4 %～ 10 .6 % ,批间CV为 7.8%～18.5 %。在 3组DM患者中 ,A组患者血清、尿ⅣC的阳性率分别为 2 8.3%、31.7% ,明显高于对照组 (P <0 .0 1) ;C组 19例DM患者中有 18例已发展为DN ,尿ⅣC的阳性率 (6 3.2 % )显著高于A组 (2 8.3% ) (P <0 .0 1) ,C组血清ⅣC的阳性率 (36 .8% )与A组 (31.7% )比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 本研究建立了一种简便、灵敏的检测尿ⅣC的ELISA方法 ,该法对DN的诊断具有较高的敏感性和特异性。

肝纤维化时Ⅳ型胶原酶与金属蛋白酶组织抑制因子-1的表达

目的 研究肝纤维化时Ⅳ型胶原酶（ＭＭＰ２）和金属蛋白酶组织抑制因子１（ＴＩＭＰ１） 在肝组织与贮脂细胞（ＦＳＣ） 中的表达，探讨其对肝纤维化的作用。方法 分别从正常和ＣＣｌ４ 肝纤维化大鼠的肝组织及ＦＳＣ中提取ＲＮＡ，应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测ＭＭＰ２ 与ＴＩＭＰ１ ｍＲＮＡ 水平。结果 正常肝脏ＦＳＣ不表达ＭＭＰ２ ，仅肝纤维化时才转录；肝组织中无论是正常或肝纤维化时均存在ＭＭＰ２ ｍＲＮＡ，并在肝纤维化时表达增加，但无显著性差异（ Ｐ＞０ ．０５） 。ＴＩＭＰ１ 在正常与肝纤维大鼠的肝组织或ＦＳＣ中均表达，肝纤维化时肝组织和ＦＳＣ的ＴＩＭＰ１ ｍ ＲＮＡ 水平与正常相比显著升高（ Ｐ＜０ ．０５，Ｐ＜ ０．０２） 。结论 ＦＳＣ 表达ＭＭＰ２对肝纤维化发生具有重要意义，而ＴＩＭＰ１ 表达增加可能是导致肝纤维化过程中胶原降解减少的主要原因之一。

胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点

目的对比人胚胎干细胞(hESC)培养过程中不同的酶消化细胞的特点,探讨适合hESC长期体外培养的消化传代方法。方法将正常生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上的hESC分别用0.05%胰酶-EDTA和Ⅳ型胶原酶消化,重新接种,了解两种酶消化后的细胞存活率、克隆形成数量、细胞产量、冻存-复苏后细胞的存活率以及长期传代后细胞核型情况。结果用0.05%胰酶-EDTA消化传代后形成的克隆大小均一,每代第3d可获得碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数(21.2±3.5)个/10倍视野,每次传代时hES细胞产量可达(4.56±1.29)×105/cm2,传代时细胞存活率高达95.60%,经冻存-复苏后也有81.20%细胞存活率。用Ⅳ型胶原酶消化组每代仅可获得低浓度胰酶消化组AP阳性克隆数的一半,克隆大小不均,细胞产量也比低浓度胰酶消化组少,传代时细胞存活率和复苏后细胞存活率和低浓度胰酶组相似。分别用两种酶处理传代十余代,核型均无异常。结论两种酶消化均适用于hESC培养,二者作用特点不完全相同,分别适用于不同的实验需要。

抗Ⅳ型胶原酶抗体Fv片段与力达霉素融合蛋白的免疫活性

目的融合蛋白Fv-LDP是通过基因工程方法制备,其抗体部分为抗Ⅳ型胶原酶抗体3G11的单链抗体scFv,相当于"弹头"的载体部分为力达霉素辅基蛋白LDP。本实验研究了融合蛋白Fv-LDP的免疫学活性。方法采用间接ELISA方法和免疫细胞荧光方法检测融合蛋白Fv-LDP的免疫学活性,明胶酶谱实验观察融合蛋白Fv-LDP对肿瘤细胞分泌明胶酶的影响,重组基膜侵袭实验分析融合蛋白Fv-LDP对肿瘤细胞侵袭能力的影响,通过制备兔抗Fv-LDP多抗,应用免疫组织化学技术检测融合蛋白Fv-LDP与人乳腺癌组织的免疫反应性。结果融合蛋白Fv-LDP与Ⅳ型胶原酶、纤维肉瘤HT-1080细胞、结肠癌HT-29细胞、肺癌PG细胞等均具有免疫反应性,3种细胞中以HT-1080细胞的相对亲和力最高,其次是PG细胞,HT-29细胞。免疫细胞荧光结果显示,肿瘤细胞HT-1080胞质着绿色荧光,表明融合蛋白Fv-LDP结合于肿瘤细胞的胞质部位。融合蛋白Fv-LDP可有效抑制肿瘤细胞分泌明胶酶,可明显抑制肿瘤细胞对人工基膜的侵袭,并呈剂量依赖性。人乳腺癌组织免疫组化结果显示,融合蛋白Fv-LDP与乳腺癌癌细胞胞质部位结合,阳性着色部位与MMP-9抗体的染色一致。结论融合蛋白Fv-LDP基本保留了完整单抗3G11对明胶酶的免疫活性,又因其携带有"弹头"的载体蛋白LDP,可以用烯二炔发色团进行强化,因此,有可能用于制备抗肿瘤抗体药物。

人脑胶质瘤Ⅳ型胶原酶的表达

目的 研究 型胶原酶的表达与人脑胶质瘤恶性生物学行为的关系 .方法 采用明胶酶谱分析法对 41例人脑胶质瘤和 5例脑组织中 型胶原酶的含量进行检测 .结果 型胶原酶的含量随胶质瘤的恶性进展而增加 ,在正常脑组织与 , 级胶质瘤间其含量无显著性差异 (P>0 .0 5 ) ,而在 , 级与 级及 级与 级胶质瘤间其含量均有显著性差异 (P<0 .0 1) .结论 型胶原酶的过表达可能与胶质瘤的恶性发展有关 。

Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶及TIMP-1在喉癌组织中的表达

目的 探讨Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶及组织基质金属蛋白酶抑制剂 -1(TIMP-1)在喉癌组织中的表达及意义。 方法 应用免疫组化方法对44例喉癌组织及22例喉癌旁正常组织中Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶(包括MMP-2和MMP -9)及TIMP-1的表达进行了检测。结果 与正常组织相比 ,喉癌组织中Ⅳ型胶原的表达明显降低 ,MMP -2、MMP -9及TIMP-1的表达明显增高,差别均有显著性意义(P<0.01) ;喉癌组织中Ⅳ型胶原表达的阳性率 ,有颈淋巴结转移者低于无颈淋巴结转移者(P<0.05) ,Ⅲ～Ⅳ期低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05) ,G2～3 低于G1(P<0.01) ;MMP-2表达水平 ,Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05) ,G 2～3 高于G 1(P<0.01) ,N0 与N1～3 间无显著差别(P>0.05) ;MMP-9的表达水平 ,N1～3 高于N0(P<0.05) ,在Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期、G 2～3 与G 1 间无显著差别 (均P>0.05)。 结论 Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶及TIMP

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤活性

目的研究抗Ⅳ胶原酶基因工程单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤效果。方法明胶酶谱法、Western-blot法研究顺铂对肿瘤细胞分泌Ⅳ胶原酶蛋白的影响,MTT法、实验动物肿瘤模型研究scFv (3G11)与顺铂联合在体外和体内试验中的抗肿瘤效果。结果顺铂可抑制肿瘤细胞分泌的Ⅳ胶原酶活性,scFv (3G11)与顺铂联合在体外试验中可抑制人肝癌BEL-7402细胞的生长,体内试验中对小鼠移植性肝癌H22有显著的抑制作用,药物相互作用指数(CDI值)<1。结论scFv (3G11)和顺铂联合应用对肝癌的治疗有协同作用。

Ⅳ型胶原酶在糖尿病大鼠肺组织表达及PKC活性变化的研究(英文)

目的 :探讨Ⅳ型胶原酶 (MMP2 及MMP9)在糖尿病大鼠肺组织表达的变化及蛋白激酶C(PKC)的作用。方法 :STZ腹腔注射制作糖尿病大鼠模型 ,4周后观察肺组织的病理改变 ,免疫组化方法检测MMP2 及MMP9在糖尿病大鼠肺组织表达的变化 ,采用改良的Takay法测定PKC活性 ,蛋白质免疫印迹分析 (Western -blot)及免疫组化方法检测TGF - β1表达含量的变化。结果 :DM大鼠 4周后肺泡间隔及毛细血管壁增厚 ,肺间质胶原成分增多 ,肺组织PKC活性增强 ,TGF - β1表达增多 ,MMP2 及MMP9表达下降。结论 :在糖尿病大鼠肺组织高糖环境下 ,PKC被激活导致TGF - β1表达增高 ,MMP2 、MMP9表达下降 ,引起细胞外基质 (ECM )合成降解失调 ,可能参与了糖尿病肺部并发症的发生及发展。

抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)_2与Fab′片段的抗肿瘤作用

目的研究抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)2、Fab′片段对小鼠肝癌22(H22)及小鼠Lewis癌肺转移的治疗作用。方法ELISA实验检测3G11及其片段与多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶的免疫反应性,明胶酶谱法测定其对HT-1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的影响,MTT法测定其对H22细胞的细胞毒作用。用小鼠肝癌22及小鼠Lewis肺癌模型评价单抗3G11及其片段抑制肿瘤生长及抗肿瘤转移活性。结果单抗3G11及其片段对多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶均呈阳性反应,单抗3G11抑制肿瘤细胞HT-1080分泌Ⅳ型胶原酶的活性。单抗3G11对H22细胞有微弱的细胞毒作用。单抗3G1130mg/kg对小鼠移植性肝癌的抑制率为51·8%,F(ab′)210mg/kg为49·9%,Fab′20mg/kg为39·3%。F(ab′)2片段10mg/kg对小鼠Lewis癌肺转移的抑制率为76%。结论抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其片段对小鼠移植性肝癌22生长以及对小鼠Lewis癌肺转移有中度抑制作用,可能用于研制抗体靶向药物。

Ⅳ型胶原酶的研究进展

Ⅳ型胶原酶是一类在肿瘤的生长、向远端侵袭和转移过程发挥重要作用的基质金属蛋白酶 ,本文就Ⅳ型胶原酶的结构 ,活性调节及其与信号传导 ,肿瘤侵袭和转移 。

Ⅳ型胶原酶与糖尿病肾病

Ⅳ型胶原酶作为基质金属蛋白酶家族的成员之一 ,可降解肾小球基底膜和系膜基质的主要结构成分———Ⅳ型胶原。糖尿病中糖、脂代谢紊乱、血流动力学异常及转化生长因子 β等细胞因子的水平升高 ,均可使肾小球局部Ⅳ型胶原酶的含量及活性下降 ,使细胞外基质降解减少 ,导致肾小球基底膜增厚和系膜基质堆积 ,在糖尿病肾病的发生。

Ⅳ型胶原酶与肿瘤的侵袭和转移

肿瘤的发生是一复杂过程，包含了血管生成、肿瘤侵袭与转移等多个步骤。在此过程中，肿瘤细胞分泌许多蛋白水解酶以降解基底膜和细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）就是其中一类Zn^2＋依赖的内源性蛋白水解酶。Ⅳ型胶原酶是MMPs家族的一个成员，主要降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原成分，与肿瘤的侵袭和转移关系密切，是近年来国内外研究的一个热点。