牙龈卟啉菌及其胶原酶基因遗传多样性的研究

目的 分析牙龈卟啉单胞菌细菌基因型及其重要毒力因子胶原酶基因PrtC的遗传异质性 ,了解细菌遗传变异与其致病性的相关性。方法 对从不同牙周炎患者口腔中分离出的牙龈卟啉菌进行DNA指纹分析 ,参考菌株为PgATCC332 77。通过PCR反应 ,检测临床菌株中是否存在特异性的胶原酶基因片段 (548bp)。并通过酶切鉴定和DNA序列分析 ,了解PrtC基因遗传多样性的变化。结果 80株牙龈卟啉菌共获得 7种基因型 (Ⅰ～Ⅶ )。所有 2 4株临床菌株和参考菌株PgATCC332 77中均扩增出特异性的胶原酶基因片段。对照菌株中没有得到相应的产物。 4株细菌的序列分析结果与国外的报道相比较 ,发现一些基因序列存在差异 ,出现 6个核苷酸碱基缺失。结论 临床分离的牙龈卟啉菌中可检测到多种基因型 ,且具有个体差异 ,这些菌株具有合成胶原酶的能力 。

COL6A2基因3′-UTR区域功能单核苷酸多态性位点rs1044598参与miR-4252调节中国汉族人群先天性房间隔缺损

目的 :探讨COL6A2基因3′非翻译区(3′-UTR)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点对先天性房间隔缺损(congenital atrial septal defect,ASD)发病风险的影响及其可能的作用机制。方法:搜索Pub Med及Hapmap数据库获得COL6A2基因3′-UTR区域中国汉族人群最小等位基因频率>0.05的SNP位点,随后通过mi RNA-SNP功能网站预测SNP位点的功能情况并与本课题组前期ASD全基因组关联研究数据库比对,研究SNP位点与ASD的发病关联,最后对可能的功能位点进行功能学研究。结果:rs1044598位点AA基因型较野生TT基因型显著减少了36%的患病风险。HEK293T细胞、H9C2细胞以及SD乳鼠原代心肌细胞荧光素酶报告基因转染实验证实,mi R-4252与COL6A2基因rs1044598不同基因型表达质粒共转染后,荧光强度在3个细胞系中均有显著差异(P<0.05)。结论:COL6A2基因rs1044598位点的变异可能与ASD的发病风险相关。mi R-4252可通过与COL6A2的3′-UTR区域发生有效结合而下调基因的表达,而rs1044598位点的变异参与这一机制并减少ASD的发生。

螺旋体传染病：问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

[目的：通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA（LA0872），以及制备抗胶原酶的多克隆抗体，观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达，为研究其致病机制奠定基础。方法：以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板，用PCR扩增colA，产物克隆到表达载体pET-28b（＋）中，构建含coLA的重组质粒；将重组质粒转入E．coli Rosetta（DE3）菌株内，IPTG诱导表达后用Ni—NTA His-Bjnd寨和屡析梓绅化雷绢蛋白;

养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌。本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法。经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3种致病弧菌核酸的阳性对照样品分别扩增出大小为737bp、382bp和271bp的预期产物,其灵敏度是102～103CFU/mL。将该方法应用于检测人工感染后的养殖大黄鱼病鱼肝脏和肾脏,结果在6份组织样本中,5份检出原始感染菌株,与API20E鉴定结果相符;对弧菌病流行季节采集的未发病的16份养殖大黄鱼组织样本和16份水体样本进行抽检,结果在1份大黄鱼组织样本中检出哈维氏弧菌,7份水体样本中检出这3种弧菌中的1种或2种,鉴定结果与API20E鉴定结果符合率为93.75%。说明该方法不仅可以检测发病鱼,还可以检测无病症带菌大黄鱼以及带菌水样,且说明海洋水体中存在着大黄鱼弧菌病的致病菌。结果说明,多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,可以缩短检测时间,降低检测成本,该方法的建立对养殖大黄鱼弧菌病的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义。

基于DNA环介导等温扩增技术快速检测溶藻弧菌的研究

溶藻弧菌是引起海产鱼类、虾、贝等细菌性疾病的主要病原之一,严重危害水产养殖业的发展,建立快速、准确的检测方法对防控溶藻弧菌及保障水产养殖安全具有重要意义。本研究引入环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以溶藻弧菌胶原酶基因为靶基因,建立了溶藻弧菌LAMP快速检测方法,45～60min内即可完成检测。试验结果显示,该LAMP方法可特异性检测溶藻弧菌,且灵敏度高,对纯培养溶藻弧菌的检测灵敏度约10CFU/mL,对污染水产品中溶藻弧菌的检测灵敏度为19CFU/mL。本研究建立的溶藻弧菌LAMP检测方法操作简便、检测快速,具有良好的实用性。

Polymerase Chain Reaction Analysis of the Clonality of Porphyromonas Gingivalis and Collagenase Gene

目的 :本研究旨在分析牙龈卟啉菌基因型和其重要毒力因子胶原酶基因 (collagenasegene ,PrtC)的遗传异质性 ,了解细菌遗传变异与其对牙周致病性的相关性。方法 :采用随机引物聚合酶链反应 (AP -PCR)的方法 ,对从 2 4例牙周炎患者口腔中分离的 79株牙龈卟啉菌和参考菌株ATCC332 77进行DNA指纹分析。并随机选择 2 4株临床菌株 ,进一步检测是否存在特异性的胶原酶基因片段。对照菌株为伴放线放线杆菌Y4和中间普氏菌ATCC2 5 6 11,通过酶切鉴定和DNA序列分析 ,了解PrtC基因遗传多样性的变化。结果 :80株牙龈卟啉菌共获得 7种基因型 (I—VII) ,以VII所占比例最高 (2 5 .8%)。 2 4株临床菌株和ATCC332 77中均扩增出特异性的胶原酶基因片段 (5 48bp)。将 4株细菌的序列分析结果与国外的报道相比较 ,发现一些基因序列存在差异 ,其中有 6个核苷酸碱基缺失。结论 :临床分离的牙龈卟啉菌中可检测到多种基因型 ,存在明显的个体差异 ,这些菌株具有合成胶原酶的能力 ,不同菌株胶原酶基因之间存在遗传异质性的变化。