分次胶原酶消化法分离、培养成人肺微小动脉平滑肌细胞

目的:建立一种简便、高效分离和培养成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法并鉴定该方法培养的传代细胞生物学特性。方法:分次胶原酶消化法与传统胶原酶消化法进行细胞获得率、细胞存活率及培养成功率比较;绘制生长曲线对原代与传代细胞的生长特性进行分析;细胞形态学观察、平滑肌肌动蛋白(SMα-actin)测定及细胞免疫荧光化学法进行细胞鉴定及纯度计算;比较原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、染色体数量及形态。结果:分次胶原酶消化法优于传统胶原酶消化法,细胞获得率(3.10±0.29vs1.20±0.35)×108cells/L、细胞存活率(69%vs21%)及培养成功率(61.5%vs16.7%)(P<0.01);传代细胞长至融合时间7 d快于原代细胞21d;细胞显典型的"峰-谷"状生长,胞浆内表达SMα-actin,细胞纯度达98%以上;原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、二倍体数量(78.13%vs76.47%)及形态无明显差别(P>0.05)。结论:分次胶原酶消化法是一种简便、可行,获得高纯度、功能良好的成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法。经过此方法分离、培养的细胞在10代以内传代培养细胞生物学及遗传学特性稳定,可用于实验。

用胶原酶消化法培养德保矮马耳缘组织成纤维细胞初探

将德保矮马耳缘组织经胶原酶消化法培养成原代细胞,并成功建立起该组织成纤维细胞系。这种细胞贴壁生长,具有密度接触性抑制性质;该方法获得的原代细胞经传代后接种,细胞群体倍增时间(PDT)为35.9h;细胞染色体众数2n=64的细胞数占91.3%～92.8%;乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶分析,没有其它细胞系污染;细菌、真菌、病毒、支原体检测阴性。该系符合ATCC要求的细胞系鉴定项目,成为保护矮马这一国家重要畜禽品种的宝贵遗传资源,并为相关遗传学研究提供了有效的试验材料。同时得出胶原酶消化培养法比组织块培养法在获得原代细胞速度快;组织块培养法的细胞群体倍增时间(PDT)为48h。

组织块培养法及胶原酶消化法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞

目的 建立稳定的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的培养方法。方法 采用显微解剖技术分离出豚鼠耳蜗血管纹 ,分别用组织块法及酶消化法进行培养及纯化。结果 耳蜗血管纹组织块培养后 2天 ,部分组织块边缘有散在的细胞生长 ,这些细胞逐渐增殖形成大片细胞集落 ;耳蜗血管纹组织经胶原酶消化后 1～ 3天 ,可观察到培养皿底由一些细胞组成的细胞岛 ;细胞纯化后大多呈多边形 ,致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应。

胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠RASMCs生长、增殖及分化对比观察

目的比较胶原酶消化法、组织块贴壁法培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RASMCs)生长、增殖及分化的影响。方法选择6~8周龄雄性SD大鼠6只,取胸主动脉及主动脉弓部,保留中膜备用。分别采用胶原酶消化法、组织块贴壁法培养RASMCs。采用α-肌动蛋白免疫荧光染色法鉴定RASMCs,并比较两种方法培养第0、24、36、48、60、72、84、96 h RASMCs生长情况。采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期。采用实时定量PCR法检测细胞表型标志基因表达,包括收缩型标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转胶蛋白(TAGLN)、肌球蛋白重链11(MYH-11)、转录因子1(SP-1)及合成型标志基因骨桥蛋白(OPN)。结果胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离出RASMCs,细胞纯度均在95%以上。培养36、48、60、72 h时,组织块贴壁法分离、培养的RASMCs计数多于胶原酶消化法(P均<0.05)。培养36、48、60、72 h时,胶原酶消化法分离、培养的RASMCs活力优于组织块贴壁法(P均<0.05)。两种方法分离、培养的RASMCs G_1、G_2、S期细胞所占比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。胶原酶消化法分离、培养的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11 mRNA相对表达量均高于组织块贴壁法,OPN mRNA相对表达量低于组织块贴壁法(P均<0.05)。结论胶原酶消化法、组织块贴壁法均成功分离、培养出RASMCs。胶原酶消化法分离、培养的RASMCs生长、增殖较慢,但保持收缩表型;组织块贴壁法分离、培养的RASMCs生长、增殖较快,但有向合成表型转化的趋势。

Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞

背景:建立一种经济、快捷、切实可行的软骨细胞分离培养体系对于软骨体外实验研究有着重要的意义。目的:探讨与改进大鼠关节软骨细胞的培养方法。方法:无菌条件下取新生1周龄SD雄性大鼠双侧髋及膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞并进行原代、传代培养及鉴定。结果与结论:倒置相差显微镜下见原代培养的软骨细胞12h后开始贴壁,3d左右可形成单层,4d左右即可传代。传至第6代后,部分细胞变为梭形;第7代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状,增殖能力减弱。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈异染性,免疫荧光染色显示培养的软骨细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达。说明采用此方法可在短时间内获得大量纯化的大鼠软骨细胞。

改良组织块结合胶原酶消化法培养食管癌细胞

目的:探讨食管癌细胞体外分离培养方法,建立合理、高效的食管癌细胞原代培养模式。方法:应用改良的培养方法,即先将组织用机械法剪碎后再用胶原酶进行消化,对13例新鲜的食管癌组织进行体外培养,观察人食管癌细胞生长情况。结果:改良方法培养的细胞生长率为61%,污染率为15%。结论:改良组织块结合胶原酶消化法成功建立了较为合理、高效的食管癌细胞原代培养模式。

采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞活性及瞬时外向钾电流观察

目的通过观察采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞形态、活性及瞬时外向钾电流,以验证胶原酶Ⅱ循环灌流消化法对心肌细胞急性分离的效果。方法利用自制Langerdorff灌流装置进行主动脉逆行灌流,胶原酶Ⅱ循环灌流消化,分离成年大鼠单个心肌细胞;利用逐步梯度复钙法选出耐钙心肌细胞;在共聚焦显微镜下观察单个心肌细胞的形态、舒缩能力,并用全细胞膜片钳记录心肌细胞瞬时外向钾电流。结果胶原酶Ⅱ循环灌流消化法分离大鼠心肌细胞可获取90%质量良好的细胞,分离出来的心肌细胞边缘锐利、横纹清晰,折光性强,舒缩规律;复钙后仍有60%质量良好的活细胞;用全细胞膜片钳可记录到标准的瞬时外向钾电流。结论采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞活性较好且耐钙,可记录到标准的瞬时外向钾电流。

一种简便分离纯化大鼠胰岛方法的探索

目的 探索可大量获取纯化大鼠胰岛的最佳方法。方法 采用胰管内灌注生理盐溶液 KRBB, 外置胶原酶消化法及用单核细胞分离液Histopaque 1077纯化胰岛。结果 成年Wistar大鼠胰腺消化后能获得 (540±84) 胰岛/胰腺, 纯化后获得 (335±81) 胰岛/胰腺, 纯度可达90%。纯化后的胰岛培养上清液中未检测到胰淀粉酶。胰岛培养1周后, 胰岛素分泌量仍保持较旺盛状态。结论 本方法能获得大量纯度较高且活性好的胰岛, 是一种简便高效的胰岛分离方法。

人髓核细胞分离、传代培养方法的建立及意义

目的建立一种体外分离、培养人髓核细胞(NPCs)的新方法,并探讨其意义。方法采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化法分离人正常NPCs,单层贴壁法进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态。取第1、2、3代NPCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力(以吸光度值表示),连续检测12天。取第2代NPCs,采用免疫组化法检测Ⅱ型胶原(Col-2)、细胞角蛋白18(KRT-18)、KRT-19、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运子1(GLUT-1)、Sox-9、聚集蛋白聚糖(ACAN)、CD24阳性表达率。结果分离的NPCs呈多角形或短梭形,类似于软骨细胞;第4代以后,NPCs细胞突起延长,呈长梭形,生长缓慢,出现老化现象。NPCs生长曲线呈S形:1~2天细胞生长缓慢;3~7天细胞生长迅速,进入对数生长期;8天后进入平台期,细胞增殖缓慢。连续培养12天,第1、2、3代NPCs相同时间点吸光度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。第2代NPCs中Col-2、KRT-18、KRT-19、HIF-1α、GLUT-1、Sox-9、ACAN、CD24阳性表达率均≥85.6%(85.6%~91.2%)。结论单纯0.2%Ⅱ型胶原酶消化法及单层贴壁法可分离、培养人NPCs,并经免疫组化染色鉴定证实;传代3代以内的NPCs细胞形态及增殖能力均无明显改变,可作为椎间盘退变相关研究的种子细胞。

大肠癌细胞的原代培养方法

目的:探讨大肠癌细胞体外分离培养方法,建立合理、高效、稳定的短期大肠癌细胞原代培养模式。方法:取60例大肠癌(T3或T4,且CT示肿瘤直径>2.0 cm)的新鲜肿瘤组织,随机分为黏膜层取材组与浆膜层取材租,分别采用组织块法、机械分离法、胰酶消化法、胶原酶消化法进行体外培养大肠癌细胞,对不同方法及培养条件进行比较并加以改进。结果:黏膜层取材组优于浆膜层取材组(P<0.05),胶原酶消化法优于胰酶消化法(P<0.05),胰酶消化法优于机械分离法(P<0.05),胶原酶消化法是最优的人类大肠癌细胞原代培养方法,细胞培养成功率达到66.7%。结论:通过黏膜层取材的胶原酶消化法可成功建立较为合理、高效、稳定的短期大肠癌细胞原代培养模式。

脂肪源性干细胞无酶分离培养方法的研究

目的探索适合临床治疗应用的脂肪源性干细胞(ADSCs)分离培养方法。方法分别采用无酶分离法和胶原酶消化法从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养细胞,对比分析分离的间充质干细胞特性。结果无酶分离法所需时间仅为胶原酶消化法的1/3,分离的细胞在细胞形态学、增殖能力、免疫表型、分化潜能等特性与胶原酶消化法分离培养的细胞一致。结论无酶分离法能够从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养出ADSCs,是一种安全可靠、适合临床应用的ADSCs分离培养方法。

肺泡型细胞培养方法的改良及其应用

目的研究不同方法对体外培养肺泡型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响。方法采用不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织,低密度接种,常规浓度含血清培养和无血清培养,抗大鼠IgG包被与不包被,倒置显微镜观察细胞生长,检测细胞活力,免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞。结果两种方法消化、分离组织,肺泡型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异。结论不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡型上皮细胞功能的需要,从而简化了体外培养肺泡型上皮细胞的程序。

肺泡Ⅱ型细胞培养方法的探讨

目的 :研究不同方法对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响。方法 :不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织 ,低密度接种 ,常规浓度含血清培养和无血清培养 ,抗大鼠IgG包被与不包被 ,倒置显微镜观察细胞生长 ,检测细胞活力 ,免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞。结果 :两种方法消化、分离组织 ,肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异。结论 :不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的需要 ,从而简化了体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞的程序。

SD大鼠成骨细胞培养方法的改良

目的：建立大鼠成骨细胞的分离、培养方法,并进行改良.方法：分别应用酶消化法、传统的植块法和采用胶原酶消化结合骨片贴附法进行成骨细胞原代培养,通过细胞形态学、Von Kossa钙结节染色和免疫印迹对细胞纯度进行鉴定,通过生长曲线对3种方法取得的原代细胞生长情况进行比较.结果：3种培养方式均可获得高纯度成骨细胞,应用胶原酶消化结合骨片贴附法可以长期获得具有稳定生物学特征的成骨细胞.结论：胶原酶消化结合骨片贴附法可以较长期获得高纯度成骨细胞.

不同培养方法对小鼠脂肪干细胞成骨分化的影响

目的比较组织块贴壁法及胶原酶消化法所得脂肪干细胞的成骨分化能力。方法分别采用组织块贴壁法及胶原酶消化法原代培养小鼠脂肪干细胞,观察细胞形态及细胞增殖情况,并进行细胞鉴定,比较两者成骨分化能力。结果两种方法所得脂肪干细胞在形态学上无差异,培养至第3代,细胞生长状态良好,生物学特性稳定,CD44、Sca-1表达率>90%,CD31表达率<10%,具有较好的成脂、成骨分化能力;组织块贴壁法培养所得脂肪干细胞增殖率高于胶原酶消化法(P<0.05);组织块贴壁法培养所得脂肪干细胞矿化结节、ALP活性及钙离子浓度高于胶原酶消化法(P <0.05)。结论组织块贴壁法相对胶原酶消化法在脂肪干细胞培养及成骨诱导分化过程中更具优势。

人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化

为优化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)原代及传代的培养方法,建立一种简便且能够获得数量较多及活力良好的HUVEC培养体系。分离脐静脉并插管,用0.1%的II型胶原酶灌注消化分离内皮细胞。M199完全培养基悬浮并接种于细胞培养瓶,37℃,5%CO2培养。待细胞铺满80%时,0.25%胰酶-EDTA消化传代培养。倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,姬姆萨染色法鉴定内皮细胞的形态,vWF因子相关抗原免疫荧光法鉴定内皮细胞。比较不同胶原酶消化时间、不同接种密度、不同胰酶消化时间、不同培养基组分对细胞得率、形态和纯度的影响。结果表明,原代培养时,II型胶原酶最佳消化时间为15min,最佳接种密度为1×106 mL-1;传代培养时,胰酶最佳消化时间为2min。倒置显微镜下观察和姬姆萨染色结果显示,贴壁内皮细胞呈长梭形,且呈单层铺路石状排列。免疫荧光检测结果表明,细胞胞浆呈绿色荧光,为vWF因子阳性细胞,DAPI衬染细胞核呈蓝色,显示内皮细胞纯度接近100%。本实验成功建立了HUVEC原代分离培养的优化体系,纯度高、活力好,为后续研究做好了准备。

胰酶联合Ⅱ型胶原酶分离培养髓核细胞:培养基中葡萄糖浓度的选择

背景:椎间盘退变是脊柱退行性疾病的发病基础,研究椎间盘的退变因素,对脊柱退行性的疾病的预防和治疗有重要意义。目的:采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法体外分离培养兔髓核细胞,并观察髓核细胞在不同葡萄糖浓度培养基中的生长及增殖状况,确立最适宜髓核细胞生长的葡萄糖浓度。方法:胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养兔髓核细胞,倒置显微镜观察细胞形态并计数细胞数量,绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色观察细胞形态。细胞免疫组织化学染色结合免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白表达情况。分别使用0,6.25,12.5,17.5,25 mmol/L葡萄糖培养基培养髓核细胞24 h后,检测各组髓核细胞增殖及凋亡情况。结果与结论:(1)髓核细胞形态:兔髓核细胞染色后镜下观察呈多角形、短梭形,有一两个核仁,随着传代次数增加,细胞伸出伪足,胞体逐渐变细长;(2)基因表达:体外分离培养髓核细胞的Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白多糖基因均可稳定表达;(3)细胞增殖:各组中细胞增殖比率以葡萄糖17.5 mmol/L组最高,显著高于葡萄糖0,25 mmol/L组(P<0.05或P<0.01);(4)细胞凋亡:葡萄糖0 mmol/L组细胞凋亡率最高(P<0.05),其他各组差异无显著性意义(P>0.05)。(4)结果证实:胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法可收获较多的原代髓核细胞,葡萄糖浓度17.5 mmol/L比较适宜髓核细胞体外培养。

人黄韧带细胞体外原代培养方法的比较

目的比较不同的人黄韧带细胞(LFCs)原代培养方法,优化培养条件,提高培养成功率。方法采集成年腰椎间盘突出症患者后路椎间盘摘除术中的黄韧带,分别采用组织块法、酶消化法、胶原酶消化加组织块法体外原代培养LFCs,传代培养;倒置相差显微镜下观察细胞从组织块内迁出时间、细胞形态和生长状态;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定其吸光度(OD)值,评价细胞增殖状况,绘制细胞生长曲线;用免疫荧光染色法检测传3代细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原的表达。结果胶原酶消化加组织块法中组织块解离、贴附和细胞游出状况均优于单纯组织块法或单纯酶消化法,成功率较高。原代培养细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原免疫荧光染色呈阳性。结论胶原酶消化加组织块法可提高LFCs原代培养的成功率。

改良法原代培养人脂肪间充质干细胞及其鉴定

背景:采用常规酶消化法提取人脂肪间充质干细胞,由于消化的时间过长,导致获得的细胞活性变差,为满足组织工程对种子细胞数量的需求,该实验旨在寻找一种改良的人脂肪间充质干细胞培养方法。目的:胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法获取人脂肪间充质干细胞并进行相关生物学特性的鉴定。方法:将脂肪组织剪碎后分别应用胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法、常规胶原酶消化法进行培养;通过锥虫蓝拒染法计数细胞,比较不同方法获取细胞的产量、活力及增殖能力;利用流式细胞仪检测改良组细胞表面抗原CD105、CD73与CD44的表达;成骨或成脂诱导后,用碱性磷酸酶染色和油红O染色鉴定细胞分化能力。结果与结论:①胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法获取的细胞数量远多于常规酶消化法;②胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法获取的人脂肪间充质干细胞增殖能力强,细胞活力好,比常规酶消化法早1 d进入平台期,传代一次需5 d左右;③第3代改良组人脂肪间充质干细胞CD105、CD73与CD44表达均呈阳性,且纯度均达93%以上;④改良法获取的人脂肪间充质干细胞有良好的成骨与成脂分化能力;⑤结果表明,胶原酶Ⅰ消化法联合组织块培养法较常规酶消化法可获得数量多、活力好、增殖能力强的人脂肪间充质干细胞,且能够稳定传代,具有良好的分化能力,这满足了组织工程学的需求。