rhBMP-2在体内诱导成骨中I,II型胶原及碱性磷酸酶的表达

目的 对 rh BMP- 2在诱导成骨中 Collagen I,II及碱性磷酸酶 (AL P)的表达进行研究 .方法 将含 rh BMP- 2 0 .5mg的松质骨载体植入 5 5只 BAL B/ c小鼠的右侧股部肌袋内 ,分别于术后 3～ 2 1d共 8个时间点取材 ,采用免疫组织化学方法对新生骨组织中的 I,II型胶原进行检测 ;对 AL P活性进行定量分析 ,观察 rh BMP- 2在诱导成骨中 Collagen I,II及AL P的表达情况 .结果 1II型胶原的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随的 ,但是 ,肥大、变性的软骨细胞并不表达 II型胶原 ;2作为成骨细胞成熟标志物的 I型胶原、AL P在软骨形成期即有表达 ,但是随着成骨细胞的出现 ,骨组织的形成 I型胶原仍表现为高表达 ,而 AL P的表达则呈下降趋势 .结论 在诱导成骨中 rh BMP- 2促进了 Collagen I,II及AL P的表达 .

I型和II型胶原在正常角膜和圆锥角膜中的表达

目的 观察正常人及圆锥角膜中 I、II型的表达 ,探讨胶原 I、II型在圆锥角膜病变中的变化。方法 采用免疫组织化学 - SA BC法检测角膜组织中胶原 I、II型胶原的表达。结果 胶原 I型在正常角膜和圆锥角膜的上皮层、实质层及内皮层均有阳性表达 ,但圆锥角膜比正常角膜的表达弱 ;而胶原 II型在正常角膜和圆锥角膜组织的基质层和 Bow m an层均可检测到 ,但圆锥角膜中 II型胶原表达减低 ,在圆锥角膜基质斑块状瘢痕区 II型胶原呈强阳性表达。结论 I、II型胶原的减少会导致角膜的稳定性降低 ,使角膜的机械抵抗力减弱 ,并使角膜前凸变薄。

反相高效液相色谱法测定软骨中的II型胶原蛋白

建立了高效液相色谱法测定软骨中Ⅱ型胶原蛋白的方法。以ZORBAX300SB-C18为色谱分离柱,流动相:A为5%乙腈、0.05%TFA,B为80%乙腈(v/v),采用线形梯度洗脱;检测波长:220nm;流速:1mL/min,柱温:35℃;进样量:10μL。该方法对Ⅱ型胶原的检出限为0.02mg/mL,线性范围20～250μg/mL,样品测定的变异系数为0.51%,加标回收率为99.13%～100.06%。该方法具有快速准确、重现性好、所需样品用量少、易于自动化的优点,从而为Ⅱ型胶原提供了一种新的测定方法。

Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞

背景:椎间盘为负重却缺乏血运的组织,在体外培养过程中存在表型丢失问题,因而容易发生退行性改变,但椎间盘退变的机制尚不明确。目的:探讨兔髓核细胞分离、贴壁培养、扩增和鉴定的方法,并观察髓核细胞在不同代次的生长特性。方法:应用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合的方法,分离、纯化髓核细胞并进行体外扩增,用倒置显微镜观察各代细胞的形态、生长状况,计数细胞数量,并绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红染色后光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达情况,并进行细胞鉴定。结果与结论:成功的实现了兔髓核细胞体外分离、培养及扩增。生长特性观察发现,髓核细胞第1-3代细胞增殖能力强,活力旺盛,但随着传代次数的增加,细胞增殖能力程逐渐下降的趋势。分离培养的髓核细胞阳性表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。体外采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合,可获得高纯度的髓核细胞,培养的髓核细胞呈类圆形或多角形生长,第1-3代细胞生长活性较强。

骨炎康颗粒对膝骨性关节炎大鼠血清II型胶原、TGF-β1、IL-lβ作用的实验研究

目的通过对膝骨性关节炎(KOA)模型大鼠的实验,观察复方中药骨炎康颗粒对膝骨性关节炎的作用机制。方法选用SD大鼠,随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、骨炎康颗粒治疗组(C组)、西药对照组(D组)。通过左膝关节腔内注入木瓜蛋白酶,造成骨性关节炎病变模型。木瓜蛋白酶注射结束后2周,开始对C、D组分别予以药物骨炎康颗粒、布洛芬灌胃,8周后处死全部大鼠,取A组双侧膝关节及B、C、D组造模侧膝关节制作病理标本,分别行免疫组化(TGF-β1、IL-lβ)染色,观察血清II型胶原、关节软骨及白介素l(1L-lβ)、转移生长因子(TGF-β1)的改变。结果 (1)血清II型胶原结果:骨炎康颗粒能提高血清II型胶原含量;(2)TGF-β1、IL-lβ改变结果:各治疗组均能提高TGF-β1含量,并降低1L-lβ,其中以骨痹颗粒组效果最佳,布洛芬相对较弱。结论骨炎康颗粒可增进软骨基质的合成,抑制软骨基质的分解,促进受损关节软骨的修复。骨炎康颗粒的疗效机理可能在于通过对机体的细胞因子调节,提高血清II型胶原、关节软骨的TGF-β1含量,降低IL-lβ含量,从而直接或间接促进了损伤关节软骨的修复。

非变性II型胶原蛋白的功能研究进展

随着全球老年化趋势,骨关节炎人群大幅度增加,目前的治疗以抗炎(如口服非甾体抗炎药)为主,以减轻疼痛和提高关节舒适度,但长期使用会引起不良反应,亟需发掘能够改善骨关节炎且安全无副作用功能性原料,以满足常年受骨关节炎困扰的人群的需求。本文介绍了非变性II型胶原蛋白的特点和作用机理,并阐述了其临床的功能研究,确认其可以辅助改善骨关节炎的症状,对非变性II型胶原蛋白的市场应用现状进行分析,确定其市场开发前景,为未来产品的开发提供参考。

牛Ⅱ型胶原诱导SD大鼠类风湿关节炎模型的建立

【目的】探讨牛II型胶原诱导SD大鼠构建类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)模型的可行性,为今后深入研究RA提供理想的动物模型。【方法】选择60只4周龄的SD大鼠,依据体重相近的原则随机分组(模型组50只,对照组10只),模型组通过注射牛Ⅱ型胶原建模,并通过体征观察、病理组织切片评价、钼靶影像学检测等判定建模是否成功。【结果】通过尾静脉注射牛Ⅱ型胶原免疫SD大鼠的建模成功率高达90.0%。与对照组SD大鼠相比,模型组SD大鼠体重减轻,活动减少,精神萎靡,先是后足小趾或踝关节红肿,之后炎症漫延至前肢,最终发展成慢性、多发性、对称性关节炎;模型组SD大鼠关节滑膜层次增多,且有大量炎性细胞浸润,软骨及骨组织受损,关节腔结构紊乱;模型组SD组大鼠从初次免疫第10周开始,其关节间隙狭窄、模糊,骨质疏松,关节软骨及骨组织受损。【结论】SD大鼠是研究RA发病机制及研发抗风湿药物的理想动物模型,可丰富该疾病动物模型的选择。

鱿鱼软骨Ⅱ型胶原蛋白提取方法及结构分析

目的从鱿鱼软骨中分离纯化非变性II型胶原蛋白,并对其进行结构表征。方法将鱿鱼软骨冻干后粉碎成200目软骨粉,用4%(w/w)Na OH溶液去除多糖、0.5 M EDTA溶液脱灰对软骨进行前处理,采用胃蛋白酶水解提取,Na Cl盐析用纯水透析后冷冻干燥得到II型胶原蛋白样品。通过氨基酸组成分析、SDS-PAGE电泳、紫外吸收光谱、电镜扫描等对制备的样品鉴定。结果制备的II型胶原蛋白具有3条α1链,分子量112 k Da,在224.5 nm波长处有最大紫外吸收,具有三螺旋结构特征。

益气化瘀补肾法对退变颈椎间盘Ⅱ型胶原mRNA表达的影响

目的 :益气化瘀补肾法对退变颈椎间盘 型胶原 m RNA表达的影响。方法 :健康成年新西兰大白兔 4 2只 ,随机平均分为益气化瘀补肾组、益气化瘀组、补肾组、消炎组、模型对照组、正常对照组。建立颈椎病椎间盘退变模型 ,原位杂交后病理图像分析。结果 :正常对照组髓核组织中 型胶原 m RNA表达的量显著高于模型对照组和消炎痛治疗组 (P<0 .0 1 ) ,与益气化瘀组、补肾组相比较也有显著差异 (P<0 .0 5) ;益气化瘀补肾法与益气化瘀法、单纯补肾法比较有较显著差异 (P<0 .0 5) ,与消炎痛组、模型组比较有非常显著差异 (P<0 .0 1 ) ;益气化瘀法、补肾法对髓核组织中 型胶原 m RNA的表达有一定的增强作用。结论 :颈椎病家兔椎间盘的 型胶原 m RNA表达比正常组显著降低 ,益气化瘀补肾法可以上调 型胶原 m RNA基因的表达 ,使之维持在正常范围 ,说明益气化瘀补肾法对延缓椎间盘的退变有积极作用。

海藻酸钠三维培养SW1353人软骨瘤细胞株:表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学特征及超微定位

背景:软骨细胞在体外单层培养的去分化改变及其来源困难是目前软骨细胞研究领域中的两大难题,目前关于SW1353人软骨瘤细胞表型和生物学特点及三维培养的相关报道较少。目的:观察SW1353人软骨瘤细胞在海藻酸钠三维培养体系中表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学及超微定位特点。设计、时间及地点:材料-细胞学体外观察,于2004-08/2006-01在中南大学湘雅医学院完成。材料:SW1353人软骨瘤细胞株由ATCC公司提供。方法:细胞复苏后接种,加入含胎牛血清、维生素C的DMEM培养基进行单层贴壁培养。离心后将细胞团块悬浮于低黏性海藻酸钠溶液中,细胞终浓度为2×109L-1,滴入凝胶溶液,聚化获得细胞凝珠,每个凝珠约含20000个细胞。藻酸盐凝胶三维体系培养8周后,柠檬酸钠分解凝胶,收获培养的软骨细胞及上清,并与单层培养的细胞进行比较。主要观察指标:细胞形态及表型变化,细胞生长曲线,细胞上清和海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达,细胞超微结构及Ⅱ型胶原的定位,同位素脉冲追踪活细胞Ⅱ型胶原的合成分泌。结果:①单层培养时,细胞由1周时的多角形变为8周后的条梭状或不规则形,三维培养条件下细胞形态始终以多角形为主。甲苯胺蓝及II型胶原免疫组化染色结果显示,单层培养1周时均呈强阳性表达,8周后转为弱阳性,而三维培养8周后仍均呈强阳性表达。②三维培养条件下细胞生长曲线无明显增殖高峰,单层培养的细胞第8～10天达增殖高峰。③ELISA检测结果显示,单层培养8周后细胞上清中II型胶原的表达明显高于第1周(P<0.05),同时也明显高于三维培养条件下细胞上清及海藻酸钠基质中II型胶原的表达(P<0.05)。④透射电镜下细胞超微结构基本正常,免疫电镜下可见细胞内II型胶原主要定位于粗面内质网膜内,少数分布在线粒体。⑤14C标记的脯氨酸干预后180min,是细胞内合成及向细胞外分泌II型胶原的高峰期。结论:SW1353人软骨瘤细胞在体外长期单层培养会发生细胞表型改变,其在藻酸盐凝胶三维培养体系中生长状态良好,细胞内软骨细胞标志物II型胶原表达丰富,提示SW1353可以作为软骨细胞功能研究的良好模型。

奇壬醇对牛Ⅱ型胶原特异性淋巴细胞的体内和体外作用(英文)

目的观察奇壬醇对牛II型胶原特异性淋巴细胞体内和体外的免疫调节作用,探讨奇壬醇对抗原特异性淋巴细胞的免疫抑制作用机制。方法将Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、奇壬醇组和泼尼松龙组。除对照组外,均复制胶原诱导关节炎大鼠模型,造模当天开始给药。造模30 d后取脾脏和引流淋巴结,制备单细胞悬液,经体外培养48 h后,ELISA法检测培养上清中干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)、IL-4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;在II型胶原诱导下,取正常大鼠淋巴结细胞、脾细胞与不同浓度的奇壬醇共同培养,检测胶原诱导的淋巴细胞增殖及凋亡。结果与模型组相比,奇壬醇组脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α含量降低(P<0.05,P<0.01),IL-10和IL-4水平升高(P<0.05,P<0.01);淋巴结细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α含量降低(P<0.05,P<0.001),IL-10和IL-4水平升高(P<0.05,P<0.001);体外实验中,奇壬醇抑制II型胶原特异性淋巴结细胞增殖,促进II型胶原特异性淋巴结细胞和脾细胞凋亡,均呈剂量依赖关系。结论奇壬醇可通过抑制II型胶原特异性淋巴细胞分泌促炎因子,促进胶原特异性淋巴细胞分泌抗炎因子,抑制胶原特异性淋巴细胞增殖和促进其凋亡,以多条途径发挥免疫抑制作用。

口服牛Ⅱ型胶原蛋白诱发类风湿关节炎大鼠模型的建立及评价

按照动物建模方案分别给不同组大鼠灌胃一定剂量的阿司匹林,再给大鼠灌胃牛II型胶原蛋白诱导其产生类风湿关节炎;建模期间进行踝关节直径的测量及关节炎指数评分;然后ELISA实验检测大鼠血清中特异性抗体(IgE、IgG)和炎症因子(IL-6、TNF-α和IFN-γ);再进一步观察大鼠踝关节组织病理改变.结果表明:经过不同剂量阿司匹林(5、10 mg·kg-1)处理的大鼠,用牛II型胶原蛋白灌胃后,大鼠踝关节呈现不同程度的肿胀及关节炎症状;10 mg·kg-1处理的大鼠炎症更明显,其血清中特异性抗体(IgE、IgG)和炎性细胞因子IL-6、TNF-a也显著增加,而细胞因子IFN-r显著降低,同时踝关节组织也发生明显炎症病变.这表明10 mg·kg-1处理的大鼠要比5 mg·kg-1处理大鼠更易用于口服食物抗原牛II型胶原蛋白类风湿关节炎的建成.

胶原诱导Wistar和Lewis大鼠类风湿关节炎模型病理特点的比较

目的探讨牛Ⅱ型胶原(CII)诱导Wistar和Lewis大鼠类风湿关节炎(RA)模型的病症表现与病理特点的差异性。方法采用尾根部皮内注射与CFA混合液进行首次免疫,14 d时注射牛2型胶原(CII)与弗氏完全佐剂(IFA)混合液加强免疫,建立Wistar和Lewis大鼠RA模型,观察Wistar-RA组和Lewis-RA组发病情况,测定足肿胀度和血清抗CII抗体效价水平,在第12周进行足趾形态和组织的病理学检查,测定踝关节滑膜VEGF、IL-6、IL-10和IL-17A的表达。结果胶原诱导后,Wistar与Lewis大鼠分别在第10天和14天出现后足肿胀,第21天和24天达到高峰,血清抗CII抗体效价第3周后显著升高(P<0.01),关节炎指数(AI)明显升高(P<0.01);WistarRA组的成模率80%,第5周足肿胀消退并进入平缓期,Lewis-RA组的成模率100%,第7周足肿胀消退并进入平缓期;在12周时两模型组均发现关节严重软骨侵蚀、滑膜增生以及炎症细胞浸润,关节滑膜血管新生和血管翳形成,后肢股骨和胫骨骨密度明显降低(P<0.01),关节滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A表达显著增加(P<0.05,P<0.01),IL-10表达明显下降(P<0.01)。与Wistar-RA组比较,Lewis-RA组足容积和足掌厚度增长持续时间较长,AI高于Wistar-RA组,滑膜血管新生和血管翳形成更明显,踝关节滑膜VEGF表达显著高于Wistar-RA组(P<0.05),而IL-17A表达显著低于Wistar-RA组(P<0.05)。结论 Wistar-RA模型和Lewis-RA模型均出现关节肿胀、变形、活动减少等症状,关节炎指数升高,关节滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A的表达增加,IL-10表达下降,与临床相符。但Wistar-RA模型肿胀持续时间短,而Lewis-RA模型肿胀持续时间长,关节损伤也更为严重,血管新生和血管翳形成更明显;Wistar-RA模型IL-17A表达高,而Lewis-RA模型则VEGF高表达,这可能与其病理特点有关。

Ⅱ,X型胶原对钙磷酸盐生物矿化动力学的影响

为探讨软骨基质成分Ⅱ,X型胶原在软骨内成骨过程中可能起的作用,研究了在Ⅱ或X型胶原存在下,以骨基质Ⅰ型胶原为晶种时钙磷酸盐晶体生长的动力学过程。用FT-IR方法分析了固相产物羟基磷灰石(HAP)。结果表明:Ⅱ或X型胶原的存在对钙磷酸盐在Ⅰ型胶原表面的生长速率有抑制作用,X型胶原的抑制作用大于Ⅱ型胶原。在Ⅱ型胶原存在下,测得其反应级数为4。说明软骨基质Ⅱ,X型胶原在软骨内成骨这一生物矿化过程中可能起积累钙离子的作用,对结晶生长机理与矿化产物无影响。

ELISA测定血清Ⅱ型胶原抗体对类风湿性关节炎的诊断意义

应用ＥＬＩＳＡ测定了５４例类风湿性关节炎患者、９９例非类风湿性关节炎患者以及１００例正常人的血清Ⅱ型胶原抗体，结果阳性率分别为９０．７％、０、０。５４例类风湿性关节炎患者中有７例血清类风湿因子为阴性而Ⅱ型胶原抗体为阳性，且病程均在半年之内。结果表明：Ⅱ型胶原抗体的检测对类风湿性关节炎具有特异性诊断和早期诊断的临床意义。

Tb(Ⅲ)与Ⅱ型胶原的相互作用

提取并分离纯化了Ⅱ型胶原，研究了Ｔｂ（Ⅲ）与Ⅱ型胶原的相互作用，结果表明Ⅱ型胶原对Ｔｂ（Ⅲ）有配位作用，并能极大地增强其荧光强度．用荧光滴定法和Ｓｃａｔｃｈａｒｄ作图法确定了Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）的结合常数和结合部位数，结果表明Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）有两类结合部位．其结合部位数和结合常数分别为０．７；３．１×１０５和１．３；１．０×１０５．

白花蛇舌草对Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠类风湿性关节炎的治疗作用

目的:探讨白花蛇舌草(HD)对Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠类风湿性关节炎(CIA)的治疗作用。方法:取SD大鼠60只随机分为对照组10只、造模组50只,造模组于背部皮内注射II型胶原乳剂建立CIA大鼠模型,采用大鼠关节炎评分法评价其模型是否复制成功。造模组再随机分为模型组、雷公藤多苷(GTW) 6 mg/kg组、白花蛇舌草3、6、12 g/kg组,每组10只,每天灌胃给予相应的试剂。每周观察关节炎指数和痛阈,于连续干预28 d后,各组大鼠眼眶静脉取血,观察白细胞介素1β(IL-lβ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)及护骨素(OPG)水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠关节炎指数,血清IL-lβ、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平均明显升高(P<0.05),光照阈值明显降低(P<0.05);与模型组比较,雷公藤多苷组、白花蛇舌草低、中、高剂量组关节炎指数,血清IL-lβ、TNF-α、PGE_2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平均明显降低(P<0.05),光照阈值明显升高(P<0.05)。结论:白花蛇舌草可明显降低CIA模型大鼠关节炎指数,升高痛域阈值,下调IL-lβ、TNF-α、PGE_2、RANKL、OPG水平,从而有效的防治CIA。

改进型胶原诱导的小鼠关节炎动物模型的建立

为了克服胶原诱导的关节炎(CIA)模型的诸如造模时间长,发病率偏低,发病严重程度较低,动物个体间疾病严重程度差异大等缺点,本试验探索采用抗Ⅱ型胶原(CII)/CD3双特异抗体联合胶原免疫来建立一个改进型CIA模型。本试验首先通过化学连接方法制备了抗CII/CD3双特异抗体。体外研究发现,该双特异抗体较好地保持了与CII以及小鼠CD3分子的结合能力,并且能同时有效地结合CII和CD3分子。体内试验发现,在胶原诱导的基础上给予抗CII/CD3双特异抗体,早在胶原免疫后25 d左右小鼠即开始发病,发病率高达100%,关节炎指数评分可以达到并稳定在10分左右的水平,并且个体间炎症严重程度差异较小。该改进型模型相对于常规CIA模型具有明显优势。该模型的成功建立,为深入揭示类风湿关节炎的发病机制、筛选和评价类风湿关节炎治疗药物,提供了更适宜的动物模型。

血清Ⅲ型前胶原对诊断肝纤维化的初步探讨

用￣（１２５）Ⅰ标记Ⅲ型前胶原（ＰＣⅢ）放射免疫法测定健康献血员３３例±ｓ，为８５．０±１７．５ｍｇ／Ｌ，急性黄疸型肝炎１１例为１４８±５０．１ｍｇ／Ｌ，慢性迁延性肝炎１４例为１３３±３１ｍｇ／Ｌ，慢性活动性肝炎２４例为１５７±５９μｇ／Ｌ，肝硬化１７例为１７８±８３．７μｇ／Ｌ，检测结果与健康献血员相比较，均有显著性差异（Ｐ＜０．０１），其中以慢性活动性肝炎、肝硬化的升高更为显著。提示ＰＣⅢ可作为诊断肝纤维化的血清学指标。

非变性Ⅱ型胶原蛋白改善犬骨关节炎的研究

本研究以骨关节炎犬为研究对象,探讨非变性II型胶原蛋白的作用效果。结果发现,与安慰剂相比,每天饲喂40mg非变性II型胶原蛋白3个月后,有效改善骨关节炎犬的整体疼痛,跛行疼痛和四肢疼痛,且具有安全无毒的特点,可用于犬类等宠物关节炎改善的营养补充剂。