一种山茶刺盘孢Colletotrichum camelliae实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

【目的】建立一种快速检测茶树炭疽病病原菌山茶刺盘孢(Colletotrichumcamelliae)的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】以茶树炭疽病病原菌山茶刺盘孢(C. camelliae)为检测目标,根据刺盘孢属ApMat基因片段设计特异性引物,建立q PCR检测技术体系,验证引物特异性,测试反应的灵敏度,绘制标准曲线,并采集田间病叶测试检测效果。【结果】设计的四组引物对中,引物对CcF/CcR特异性最好,扩增效率最高;用于定量检测C. camelliae的灵敏度为10 pg/μL,DNA浓度的对数(X)与Ct值(Y)之间的线性关系为Y=-3.529 6X+36.938(R^(2)=0.9957,E=92.01);该体系检测C.camelliae溶解曲线对应的特异峰值Tm为(85.5±0.5)℃;用该体系在人工接种C. camelliae的病斑组织和田间病叶中检测到了C. camelliae的存在。【结论】建立的q PCR反应体系可特异性定量检测C. camelliae,并可应用于田间病害的早期诊断。

细胞壁降解酶在球刺盘孢侵染过程中的作用

为明确球刺盘孢Colletotrichum coccodes产生的细胞壁降解酶(CWDEs)在其侵染马铃薯过程中的作用,本文对球刺盘孢离体和活体条件下产生的CWDEs种类及活性进行检测,并通过RT-qPCR测定了球刺盘孢侵染过程中多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的表达情况。通过定性测定发现,球刺盘孢能够产生果胶酶、纤维素酶和蛋白酶;定量测定发现,球刺盘孢可产生羧甲基纤维素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶(β-Glu)、PG和聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)。在活体条件下,球刺盘孢可在马铃薯茎秆内产生PG、PMG和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE),且酶活分别于接种后48、72 h和144 h达到最大值,分别为26.50、77.61 U/mL和0.16 U/mg。分别将羧甲基纤维素钠和果胶诱导后的酶液接种至马铃薯茎秆可引起植物组织浸腐,与球刺盘孢引起的典型症状相似。除此之外,球刺盘孢的4个PGs基因均在其侵染后24 h和48 h显著共上调表达。综上所述,该研究结果表明,果胶酶在球刺盘孢致病过程中发挥重要作用。

臭椿炭疽病菌盘长孢刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)生物学特性研究

本研究测定了不同培养基、碳源、氮源、温度、pH条件下臭椿盘长孢刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)菌株SQD-107的生长、产孢和孢子萌发情况。该菌株在PSA培养基上生长最快、产孢最多;在供测碳源中病原菌对蔗糖、葡萄糖利用较好,供测氮源中对硝酸铵、氯化铵利用较好。菌丝生长的适宜温度范围为10～35℃,最适25℃;产生分生孢子的适宜温度范围为10～30℃,最适25～30℃;孢子萌发的适宜温度范围为5～35℃,最适25℃。在pH3～10的范围内该菌均能生长和产孢,菌丝生长最适pH7～8;产生分生孢子最适pH为7,孢子萌发最适pH6～8。孢子的致死温度为60℃,持续时间10min。

海南橡胶树暹罗刺盘孢菌群体遗传结构分析

暹罗刺盘孢菌Colletotrichum siamense是引起海南橡胶树炭疽病的重要病原之一,为了明确海南橡胶树暹罗刺盘孢菌群体的遗传结构,本研究对海南5个市(县)的橡胶树暹罗刺盘孢菌的ITS序列进行分析。结果表明,58个病菌样品可推导出11种单倍型,其中单倍型H11包含样品数最多且在5个市(县)均有分布,其次为单倍型H4,在4个市(县)有分布。遗传分化指数(Fst)表明保亭种群与其他种群的遗传分化较大。AMOVA分析显示,遗传变异主要发生在种群内,占总变异的93.9%。对所有地理种群病原菌ITS序列的核苷酸不配对进行分析,表明病菌未经历过大规模的种群扩张。系统发育分析表明,来自相同地区的病菌单倍型并没有聚在一起。研究结果表明海南橡胶树暹罗刺盘孢菌种群具有丰富的遗传多样性。

斯高威尔刺盘孢菌次生代谢产物分离纯化及其对大斑凸脐蠕孢菌的抑制作用

采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、薄层层析和高效液相色谱等技术对一株斯高威尔刺盘孢菌Colletotrichum scovillei次生代谢产物进行分离纯化,得到两个化合物1和2,结构经波谱综合解析并与文献数据比对,确认化合物1为未见文献报道的神经酰胺类化合物6-甲基-12-羟基-十四烷基-N-(2′,3′,4′-三羟基丁基)-2E,4Z-二烯酰胺,化合物2为已知化合物sambutoxin。抑菌活性测定结果表明,两个化合物均对大斑凸脐蠕孢菌Exserohilum turcicum具有较强的抑制作用,EC_(50)值分别为11.43μg/mL和18.42μg/mL。离体叶片法测定结果表明,化合物1在800μg/mL质量浓度下对玉米大斑病的相对防治效果可达84.8%,与对照药剂百菌清相当。

希金斯刺盘孢全基因组候选效应分子的预测

希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的十字花科植物炭疽病,影响作物品质并造成严重的经济损失。效应分子在植物病原真菌侵染寄主植物过程中发挥着重要的作用。根据已公布的希金斯刺盘孢的全基因组信息,以其全基因组蛋白序列为材料,通过生物信息学方法,对其候选效应分子及其功能进行了预测和分析。首先利用Signal P、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和Target P程序依次预测出其分泌类型的蛋白,再通过其序列大小和半胱氨酸含量作进一步筛选,最后利用blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对,找出数据库中没有蛋白同源性的序列,从而获得候选效应分子;同时对希金斯刺盘孢全基因组的16 150个蛋白序列进行分析,最终预测到135个符合条件的候选效应分子,而大多数都是功能未知的假定蛋白。本研究采用生物信息学分析方法预测出了希金斯刺盘孢的候选效应分子,为进一步研究这些效应分子的功能奠定了基础,其研究技术和手段也为其它真菌效应分子的预测提供了重要的参考资料。

油茶暹罗刺盘孢菌群体遗传结构分析

暹罗刺盘孢菌是油茶炭疽病病原之一,在我国多个油茶产区均有分布。研究油茶暹罗刺盘孢菌群体遗传结构可为全面、有效防治油茶炭疽病害提供理论依据。本研究对分离自海南、江西、湖南、广西4省(自治区)6个地区暹罗刺盘孢菌菌株的ITS、CAL和GAPDH 3个基因的序列进行群体遗传结构分析。根据拼接的上述3个基因的序列,57个暹罗刺盘孢菌菌株可定义为13个单倍型,其中单倍型H7为主要单倍型,分布于本研究所涉及的所有地区。病菌不同地理种群间的遗传分化较大,AMOVA分析显示,遗传变异主要发生在种群内,病菌未经历过大规模的种群扩张。研究结果表明油茶炭疽病原暹罗刺盘孢菌种群具有丰富的遗传多样性。

银杏内生真菌刺盘孢遗传多样性的初步分析

为了研究银杏内生真菌的刺盘孢菌株的遗传分化，选用了分离自江苏5个县市的14个菌株，利用RAPD技术进行遗传多样性分析。从20个随机引物中筛选出5个引物，扩增出62条DNA带，在此基础上分析并建构了遗传相关聚类图。结果表明，不同地区的刺盘孢菌株其遗传差异性不同，14个菌株可聚为两大类，其中启东、邳州的6株聚为一类，南京、南通和泰兴的8株又聚为一类。所有的14个菌株的相似性系数范围在46％～89％。

束状刺盘孢的体外培养条件研究

目的对束状刺盘孢体外培养,观察形态特征。方法将束状刺盘孢接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中分别置于4℃、28℃、35℃和37℃下培养2周,观察生长情况;选取生长最好的菌株分别接种在沙堡弱培养基(SDA)、PDA、察氏培养基(CPA)、胡萝卜琼脂培养基(CDA)和玉米粉培养基(CMA)中,同一温度下培养2周,观察菌落形态及镜下形态。结果菌株在28℃条件下生长最快、菌落发育饱满、产生灰色色素;菌株在五种培养基中生长快慢依次是PDA>CDA>CMA>SDA>CPA,菌落在PDA、CDA和CMA中呈鼠灰色,SDA中呈白色和棕色,CPA中呈白色和鼠灰色,SDA和CPA中未见分生孢子和刚毛产生。结论在PDA、CDA和CMA中28℃条件下,较适合束状刺盘孢生长。

原生质体诱变提高亚麻刺盘孢ST对底物DHEA的耐受性和转化率

采用原生质体诱变技术选育出一株耐高浓度底物去氢表雄酮(DHEA)的高产亚麻刺盘孢菌株(Colletotrichum lini)ST-0317,并研究了其转化特性。以C.lini ST为出发菌株,考察了其原生质体制备与再生的最适条件,随后对其原生质体进行等离子诱变,最终选育得到优势突变株ST-0317。该菌株在底物耐受性提高的同时也具有良好的遗传稳定性,在DHEA投料浓度高达10g/L的条件下,产物7α,15α-diOH-DHEA摩尔得率可达36.9%,比出发菌株提高了50%。

八种杀菌剂对山茶刺盘孢的毒力与田间防效研究

采用菌落直径法测定8种杀菌剂对山茶刺盘孢（Colletotrichum camelliae Massee）的毒力并进行田间药效试验。结果表明，山茶刺盘孢对嘧菌酯、咪鲜胺、多菌灵、三唑酮、苯醚甲环唑和甲基托布津高度敏感，其抑制中浓度（EC50）为0．0924-2．1633μg／mL；对百菌清和代森锰锌为中度敏感，其EC。分别为5．1150p．g／mL和11.3315μg／mL。田间药效试验结果表明，45％咪酰胺EW（375g／hm^2）的防效最高，达到91．32％；其次为25％嘧菌酯SC（150g／hm2）和80％多菌灵WP（675g／hm。）。其防效分别达到86．63％和80．55％；80％甲基托布津WP（500/hH^2）的防效最低，为63．45％。

束状刺盘孢角膜炎的实验研究

目的初步研究束状刺盘孢感染兔角膜的临床表现和组织病理学特征。方法选择15只新西兰白兔,应用基质内直接注射法建立模型。肉眼观察角膜变化,并在接种后第5 d、14 d、21 d处死家兔,对角膜行HE染色和PAS染色,观察其组织病理学改变。结果兔束状刺盘孢角膜炎动物模型成功建立,肉眼可以见到典型的真菌性角膜炎的表现。组织病理学检查,在感染早期即可看到大量真菌病原体生长,菌丝垂直于角膜基质,后期出现新生血管和瘢痕。结论角膜基质内直接注射法复制真菌性角膜炎动物模型成功率高、稳定。兔束状刺盘孢角膜炎有典型的真菌性角膜炎的表现,组织学中菌丝垂直于角膜基质生长。

瓜类刺盘孢诱导物对新疆甜瓜抗病相关酶活性的影响

近年来,应用病毒、细菌、真菌以及病原菌体及其代谢物作为诱导因子,已在多种作物上获得对病害的整体免疫,有些已开始在田间应用。我们也曾应用人工诱导免疫的方法使新疆甜瓜获得对瓜类疫霉病的抗性,但有关植物人工诱导免疫机理的研究,目前国外报道不多,国内尚未见报道。本文以瓜类刺盘孢(Colletotrichum langenarium)培养滤液和菌丝细胞壁作为诱导物,研究了免疫植株相关酶的活性以及可溶性蛋白的变化,探讨了人工诱导免疫的机理。

禾谷刺盘孢菌在侵染早期与玉米蛋白的互作预测与分析

【目的】研究禾谷刺盘孢菌与寄主玉米的蛋白互作关系,有助于从分子水平了解病菌致病过程及病菌-寄主互作机制。【方法】采用计算方法预测病菌侵染相关蛋白与寄主玉米蛋白的互作,并结合网络可视化工具和GO注释信息对参与互作的蛋白进行深入分析。【结果】预测结果包含了355对互作蛋白,涉及16个刺盘孢菌蛋白和173个玉米蛋白,其中刺盘孢菌蛋白为蛋白酶、锌羧肽酶、木聚糖酶等潜在的致病蛋白,而病菌靶向的寄主蛋白涉及对真菌防御响应、蛋白折叠、蛋白修饰等多种生物过程。对互作蛋白信息的分析则表明预测方法既识别到已知互作,如病菌木聚糖酶与寄主木聚糖酶抑制蛋白的互作,也发现了不少新互作蛋白。【结论】这些结果为明确禾谷刺盘孢菌在侵染早期与寄主的互作机制提供了有用信息。

刺盘孢菌真菌病毒研究进展

真菌病毒是指寄生于各种真菌中的病毒,其中部分弱毒相关病毒可使寄主真菌致病力发生衰退,甚至导致病原群体致病力下降,是一种具有生防潜能的微生物资源。刺盘孢菌(Colletotrichum spp.)可引起植物严重的炭疽病,造成巨大的经济损失。文章归纳总结了刺盘孢菌中真菌病毒的种类和特征:仅有9种刺盘孢菌中存在真菌病毒,且病毒基因组类型均为dsRNA;绝大部分病毒为直径25~50 nm的球状病毒颗粒,另有目前唯一一例线状真菌病毒;序列已知的6例刺盘孢菌病毒中有2例为双分病毒、2例为产黄青霉病毒、2例还未确定归类。通过分析病毒对寄主真菌的影响发现不同病毒对刺盘孢菌表型、生长、产孢和致病力等方面的影响存在明显差异,但仅有2例为能使寄主致病力衰退的弱毒相关病毒。弱毒相关病毒的发现为植物炭疽病的生防研究提供了新契机,但由于存在真菌病毒数量不足、真菌病毒分离鉴定进展缓慢、真菌病毒传播效率低及病毒与刺盘孢菌间的互作研究不够深入等问题,刺盘孢菌应用于田间炭疽病的防治还有一定距离。针对上述问题,未来研究方向可从以下方面着手:采用宏转录组等技术鉴定和发掘更多的真菌病毒;通过遗传转化手段或挖掘可利用的化学物质或传播介体提高病毒的传播效率;建立刺盘孢菌遗传转化体系及病毒反向遗传转化系统、结合多组学手段深入研究病毒与寄主真菌互作,为刺盘孢菌的致病机理研究及真菌病毒的生防利用提供参考。

苜蓿种质材料对亚麻刺盘孢的室内抗性评价

通过盆栽试验,以孢子悬浮液(浓度1×10-6个·mL-1)喷雾接种14d后统计病情指数,测定株高、生物量、相对质膜透性、脯氨酸、可溶性糖和木质素含量,对50份苜蓿(Medicago)种质材料进行苗期抗亚麻刺盘孢的抗性评价,探索室内抗病评价方法,旨在为病害防治和抗病育种提供参考。抗病性等级评价结果表明:对亚麻刺盘孢表现为高抗的材料有:兰热来恩德、干地、呼伦贝尔、吐鲁番、霍纳伊、阿尔贡奎因、龙牧801、杜普梯和西奎尔;表现为高感的有:新疆大叶、法国(M 47)、榆次、南特、沧州和普罗莫。其他指标综合评价结果表明:抗亚麻刺盘孢较强的种质材料有:兰热来恩德、霍纳伊、阿尔贡奎因、龙牧801、敖汉、吐鲁番和西奎尔;抗亚麻刺盘孢较弱的种质有:法国(M 47)、润布勒、武功、草原三号、陇东、新疆大叶、陇中、普罗莫、沧州和榆次苜蓿。综上所述,确定苜蓿苗期抗亚麻刺盘孢较强的种质材料有:兰热来恩德、霍纳伊、阿尔贡奎因、龙牧801、吐鲁番和西奎尔;抗亚麻刺盘孢较弱的种质材料有:榆次、沧州、普罗莫、新疆大叶和法国(M 47)苜蓿。

苜蓿毁灭刺盘孢菌的主要生物学特性

苜蓿炭疽病是各苜蓿种植区分布较广的毁灭性病害。毁灭刺盘孢（Colletotrichum destructivum）是苜蓿炭疽病的主要病原菌之一。本试验研究了培养基、碳源、氮源、温度、pH、光照、湿度对毁灭刺盘孢菌菌丝生长、分生孢子产生和萌发的影响。结果表明：该菌菌丝适宜生长的培养基为PDA、PSA和V-8汁;适宜温度范围为28~36℃,最适温度为32℃;适宜pH范围为4~6。该病菌在PDA培养基上,分别以麦芽糖和蛋白胨为碳、氮源,在28℃,pH 6的条件下培养时其产孢能力最强。孢子萌发的最适碳、氮源分别为可溶性淀粉和牛肉膏、蛋白胨;最佳温度28℃;最适pH为6。相对湿度98%以上有利于孢子的萌发。持续光照利于菌丝生长、产孢和萌发。

一株刺盘孢属菌的分类鉴定及转化孕酮和雄烯二酮的研究

研究了菌株YNCA0116对孕酮和4-雄烯二酮(4-AD)的生物转化,并对该转化菌株进行形态学和分子生物学鉴定,转化产物经分离纯化后,运用核磁共振(NMR)、质谱(MS)、红外光谱(IR)分析进行结构鉴定。结果鉴定,该菌株为刺盘孢属(Colletotrichum sp.),该菌转化孕酮得到主产物11α,15α-二羟基孕酮和副产物6β,11α-二羟基孕酮,转化4-AD得到11β,15α-二羟基-4-雄烯二酮。刺盘孢属菌株YNCA0116具有转化甾体二羟基化的能力,对不同甾体化合物羟基化特点有差异。

希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体表型筛选及其特性分析

以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株生长缓慢突变体Ch-1-E393和Ch-1-C135、12株菌落形态异常突变体(包括色素异常、菌落扇变或菌丝坍塌现象),另外筛选到1株致病缺陷突变体Ch-1-G090。致病性测定结果表明,致病缺陷突变体Ch-1-G090接种拟南芥后,叶片发病明显减弱,且未产生水渍状病斑。显微观察发现该突变体分生孢子在叶片上仅能产生少量初生菌丝,不能正常形成次生菌丝。Southern杂交显示,致病缺陷突变体Ch-1-G090为T-DNA双拷贝插入;通过Inverse-PCR法获得插入T-DNA的侧翼序列,明确该突变体T-DNA插入位点分别为假定蛋白(Ch063_10682)和RNA加工蛋白FCF1(CH063_10671)编码区。

刺盘孢属真菌PCR检测方法的建立

【目的】刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是重要的植物病原菌,引起植物炭疽病。建立刺盘孢属真菌PCR检测方法。【方法】比对分析刺盘孢属及其近似属的ITS序列,设计刺盘孢属特异性引物,建立PCR扩增体系,验证引物的特异性和灵敏度。【结果】设计出刺盘孢属特异性引物ITS-c3/c4,建立了刺盘孢属常规PCR检测体系。建立的PCR体系能从刺盘孢属菌株中扩增出449bp的特异性条带,刺盘孢属的近似属菌株未能扩增到条带。灵敏度试验可检测到DNA的浓度为2.2pg/0x0E?SymbolmA@0x0FL。【结论】用建立的PCR体系对炭疽病梨果实样品进行检测,可从发病组织中检测到刺盘孢属真菌。建立的PCR方法可靠、灵敏度高,能够快速、准确检测出刺盘孢属真菌。