苹果与胶孢炭疽菌互作研究进展

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)能够引发苹果苦腐病和苹果炭疽叶枯病,危害叶片和果实,影响果品产量和品质,给苹果产业造成严重的经济损失。对苹果与病原物互作分子机制最新研究进展进行综述,包括苹果上炭疽病的病原菌组成和分类、侵染循环及其引发的果树病害种类,病原菌的致病结构和降解酶类、致病相关基因的挖掘与分析、效应蛋白的筛选与功能分析等致病相关分子机制,苹果被侵染后生理生化变化、激素信号、抗病基因挖掘、miRNA参与的免疫调控机制等抗病相关的研究内容,以期为解析病原菌致病机制及与寄主互作机制,进而为挖掘潜力候选基因,以及病害综合防控和抗病分子育种奠定理论基础。

杨树响应胶孢炭疽菌侵染的转录组学研究

【目的】通过生理指标和高通量转录组数据解析杨树响应病原菌侵染的分子机制,为探究杨树叶片在胶孢炭疽菌侵染下生理及分子响应模式奠定重要的理论基础。【方法】以毛白杨无性系LM50为试验材料,对胶孢炭疽菌侵染后3种抗氧化酶活性(多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)变化模式进行分析;基于RNA高通量测序技术分析关键基因及其表达模式。【结果】病原菌侵染叶片6 d后,丙二醛含量和3种抗氧化酶的活性显著提高。共检测到4547个杨树差异表达基因,其中2262个基因上调,2285个基因下调,差异基因主要富集到糖类、脂类、次生代谢产物、苯丙烷、谷胱甘肽、多种氨基酸、不饱和脂肪酸合成及代谢等生物学通路。WRKY、ERF等转录因子家族表达量明显改变,可能在杨树响应病原菌胁迫过程中发挥了重要作用,其中27个WRKY和23个ERF转录因子表达明显受到激活。MapMan分析结果表明病原菌侵染导致氧化胁迫的产生,植物激素含量也增加,这些激素作为信号激活防御反应,最终诱导大量抗病通路相关基因表达。【结论】27个WRKY和23个ERF转录因子可能在杨树响应病原菌胁迫的过程中起到重要的调控作用,谷胱甘肽、苯丙烷和类黄酮次生代谢通路可能参与杨树响应胶孢炭疽菌侵染过程。

橡胶树胶孢炭疽菌自噬相关基因ATG20的功能

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是引起橡胶树炭疽病的优势小种,橡胶树感染后会大量减产。自噬现象是植物病原真菌中普遍存在的生理过程,自噬过程会受到多个自噬相关基因(ATG)的调控,在病原真菌对逆境的响应、生长发育和致病性方面具有重要作用。本研究克隆了橡胶树胶孢炭疽菌的ATG20同源基因CgATG20,构建了该基因的敲除突变株△CgATG20,并对其致病性、孢子产量、组织侵染情况和自噬情况等进行分析。结果显示,与野生型相比,△CgATG20的致病性、分生孢子产量和对植物的入侵率显著降低。在缺氮条件下,△CgATG20菌丝体中自噬小体的数量显著少于野生型。以上结果表明ATG20在胶孢炭疽菌的生长发育、致病性和自噬中发挥重要作用,这为寻找有效阻断病原真菌发育和侵染途径的防治策略提供了新的靶点。

胶孢炭疽菌侵染秀丽隐杆线虫的特性研究

通过胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)共培养,探讨该植物病原菌对线虫基本生物学特性的影响。结果显示:胶孢炭疽菌对线虫存活率、体长大小、繁殖能力等基本生物学特性产生显著影响,线虫接触胶孢炭疽菌孢子后存活率显著降低,且虫龄大小与其半数致死时间的长短直接相关,L1期为108 h,L4期为144 h;胶孢炭疽菌孢子浓度与线虫存活率呈负相关性;与胶孢炭疽菌共培养的线虫体长大小也明显变短,繁殖能力显著降低;然而,胶孢炭疽菌对线虫运动能力和咽泵速率并无显著影响。结果表明:胶孢炭疽菌对秀丽隐杆线虫可产生一定的伤害作用,具有激活线虫天然免疫系统的可能性,该炭疽菌与线虫互作体系可能成为研究天然免疫进化的有力工具。

猕猴桃胶孢炭疽病菌的农杆菌介导遗传转化体系构建及荧光标记菌株鉴定

为了明确炭疽病菌对猕猴桃的侵染机制,以猕猴桃胶孢炭疽病菌菌株及含潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的双元载体pCAMBgfp为材料,成功构建了由农杆菌EHA105介导的遗传转化体系并得到了稳定表达绿色荧光的转化子。研究表明,当潮霉素B质量浓度为160μg/mL时可有效筛选阳性转化子;分子鉴定结果证实GFP表达基因已整合至转化子基因组中;荧光观察下继代培养的转化子菌丝及分生孢子均表现出强烈的绿色荧光信号,说明GFP标记在转化子中遗传表达稳定;与野生型菌株相比,2株转化子的菌落形态特征、菌丝生长速率对猕猴桃果实的致病力无明显差异。该研究成功建立了猕猴桃胶孢炭疽病菌的遗传转化体系并得到了稳定表达的荧光转化子,对进一步解析该菌株与宿主之间的互作机理具有重要意义。

苎麻胶孢炭疽菌生物学特性的研究

本研究以苎麻炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)为研究对象,主要研究了温度、pH、培养基成分、碳源和氮源、维生素和光照等因素对病原菌菌丝生长速率和产孢量的影响。结果表明,该菌菌丝生长的温度范围为10~40℃,生长最适温度为25℃。菌丝在pH为3.0~12.0的PDA培养基中均能生长。不同培养基对菌丝生长速率的测试显示,该菌在PDA上生长最快,该菌对各种碳源利用能力不同,其中对麦芽糖的利用率最高。另外,用PDA进行培养,分生孢子生成的温度范围为10~40℃,最适28℃。用不同培养基进行培养,牛肉膏培养基上产孢最多。相同的氮源、碳源不同其产孢量差异很大,硝酸钾和葡萄糖培养基中产孢效果更好。添加维生素B2的液体培养基里可以获得较大的生物量,同时可诱导大量分生孢子的产生。菌丝在12小时光暗交替条件下生长最快,但是分生孢子产量低,而连续黑暗培养更利于分生孢子的生成。本研究结果将为苎麻炭疽病的发生规律、苎麻炭疽病的生物防治和致病机理的研究提供理论基础和依据。

8种杀菌剂对核桃炭疽病病原菌胶孢炭疽菌的室内毒力

由胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的核桃炭疽病是目前危害山东省核桃生产的主要病害。为筛选防治该病害的高效药剂,在确定了最适菌丝生长和分生孢子萌发温度的基础上,采用菌丝生长速率法和孢子萌发法,测定了8种常用杀菌剂对胶孢炭疽菌的毒力,评估了温度对咪鲜胺和戊唑醇毒力的影响,检测了17个胶孢炭疽菌菌株对咪鲜胺和戊唑醇的敏感性,同时评价了这2种杀菌剂的预防和治疗作用。结果显示:在胶孢炭疽菌菌丝生长和孢子萌发的最适温度28℃下,供试8种杀菌剂中,咪鲜胺、戊唑醇和三唑酮对供试菌株菌丝生长的抑制作用最强,平均EC50值分别为0.07、1.45和3.04 mg/L;异菌脲、代森锰锌和咪鲜胺对分生孢子萌发的抑制作用最强,平均EC50值分别为21.07、25.14和25.18 mg/L。咪鲜胺对菌丝生长的抑制作用受温度影响较小,而戊唑醇对菌丝生长的抑制作用随温度降低而增强;供试17个菌株对咪鲜胺和戊唑醇均有较高敏感性,平均EC50值分别为0.08和1.03 mg/L。建议在核桃炭疽病发病的不同时期,轮换使用咪鲜胺、戊唑醇、三唑酮、异菌脲和代森锰锌等杀菌剂,以有效控制该病害。

葡萄胶孢炭疽菌对3种麦角甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂的敏感性

系统比较了从云南省主要葡萄产区采集的57株葡萄胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides对三唑类脱甲基抑制剂烯唑醇、腈菌唑及咪唑类脱甲基抑制剂咪鲜胺的敏感性、交互敏感性及敏感性与生存适合度的相关性等指标。结果表明:供试菌株对咪鲜胺的EC50值在0.01～1.58 mg/L之间,高于其对烯唑醇(EC50值为0.05～25.45 mg/L)和腈菌唑(EC50值为0.49～192.93 mg/L)的敏感性;部分菌株对烯唑醇和腈菌唑的敏感性显著降低,而对咪鲜胺仍保持较高的敏感性;供试菌株对烯唑醇和腈菌唑的敏感性具有显著的相关性,而对咪鲜胺的敏感性与对烯唑醇和腈菌唑的敏感性之间则无显著相关性。低敏感性菌株的致病力和菌落生长速率与敏感菌株无显著差异,具有较高的生存适合度。

橡胶胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌对杀菌剂的敏感性测定

云南省橡胶炭疽病危害日趋严重,为了解病原菌耐药性差异,采用生长速率法室内测定了云南省橡胶炭疽病菌——胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletorichum acutatum)对咪鲜胺、多菌灵、甲基托布津、溴菌腈、百菌清和代森锰锌的敏感性。结果表明:胶孢炭疽菌对咪鲜胺、多菌灵和甲基托布津的敏感性高,EC50分别为0.020 9μg/mL,0.050 5μg/mL和0.404 3μg/mL;尖孢炭疽菌同样对咪鲜胺、多菌灵和甲基托布津的敏感性高,EC50分别为0.029 0μg/mL,0.194 6μg/mL and 3.834 7μg/mL,但要显著低于胶孢炭疽菌的敏感性;两种炭疽菌均对代森锰锌不敏感。

胶孢炭疽菌的种内遗传多样性研究

应用RAPD分析对广东不同果树上的胶孢炭疽菌的种内遗传多样性进行研究。结果表明:除部分芒果上的菌株外,20个来源于不同果树上的胶孢炭疽菌都以较高的相似系数聚为一个大群(群I)。说明尽管胶孢炭疽菌具有复合种的性质,但在一定的地理范围内,其遗传背景还是相近的,表现出种的典型特征。6个芒果菌株组成3个小群,且与群I的亲缘关系较远,其分类地位有待进一步明确。

13种萜类化合物对胶孢炭疽菌和链格孢的抑制活性

炭疽菌Colletotrichum和链格孢Alternaria是引起植物病害的重要真菌,给农业生产造成巨大的损失。本研究选取13种萜类化合物,采用菌丝生长速率法对胶孢炭疽菌、链格孢进行抑菌活性分析。研究结果表明:香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对两种病原菌有较好的抑菌活性,其中香芹酚对胶孢炭疽菌和链格孢的抑菌活性最强,IC50分别为40.89μg/mL和18.19μg/mL。本试验为植物精油和天然杀菌剂的开发利用提供理论依据。

根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

本研究基于农杆菌介导的遗传转化方法,建立了芒果胶孢炭疽菌高效的遗传转化体系,获得一批炭疽菌的T-DNA插入突变体,其目的是为炭疽菌的功能基因组学研究和致病相关基因的克隆奠定基础。结果如下:通过摸索并优化了体系的各项因子,在潮霉素筛选浓度为200μg/mL,菌液浓度为OD660=0.15条件下,AS为200μmol/L,选择pH5.5的IM共培养基中转化效果最好;进一步通过对转化子的继代稳定性和PCR检测,结果发现潮霉素抗性稳定遗传和假阳性率低;通过菌落形态观察和产孢能力的测定获得3个菌落形态异常突变体,6个产孢能力下降突变体。

杀菌剂对番木瓜胶孢炭疽菌的室内毒力测定

胶孢炭疽菌引起的炭疽病是番木瓜最主要的田间及采后病害,采用菌丝生长速率法测定了20种杀菌剂对胶孢炭疽菌的室内毒力。结果表明:咪鲜胺、苯醚甲环唑、氟硅唑、腈菌唑+醚菌酯、丙环唑、戊唑醇、烯唑醇、吡唑醚菌酯8种药剂的抑菌效果较好,EC50值在0.01～0.47mg/L之间;其中咪鲜胺对病菌的EC50值最低,抑菌效果明显高于对照多菌灵,成为最具潜力的替代使用药剂,氟硅唑、戊唑醇和丙环唑3种药剂EC50值也较低,抑菌效果仅次于咪鲜胺。

橡胶树重要品系对胶孢炭疽菌抗性评价

橡胶树抗性种质的鉴定与利用是控制橡胶树炭疽病的一项重要措施。采用室内离体橡胶叶接种法、田间种质圃人工接种和自然发病条件下定期田间病害调查方法,2011-2012年在海南省儋州开展46份重要橡胶树种质对胶孢炭疽菌病抗性鉴定和评价。把抗炭疽病程度划分为高度抗病(HR)、抗病(R)、中度感病(MS)、感病(S)和高度感病(HS)共5个级别,根据抗性评价结果分析得出:高度抗病(HR)类型的0份;抗病(R)类型8份,占17.39%;中度感病(MS)类型19份,占41.30%;感病(S)类型16份,占34.78%;高度感病(HS)类型3份,占6.52%。筛选出的抗病品种,是今后可利用的抗性种质资源。本研究结果为炭疽病抗性种质资源的利用、培育及病害管理提供参考数据。

建兰胶孢炭疽菌分生孢子的生物学特性及病害防治药剂的筛选

研究了室内温度、pH值和光照对建兰胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)产孢量和孢子萌发的影响,测定了孢子的致死温度及时间,用田间药效试验法筛选建兰炭疽病的防治药剂.结果表明,该菌产孢和孢子萌发的适宜温度为25-28℃,pH值为中性或偏微酸,光照条件为完全黑暗或12 h光暗交替,55℃水浴中5 min孢子致死.田间药效试验结果表明,4种供试药剂对建兰炭疽病的防治效果均在60%以上,以78%波尔.锰锌可湿性粉剂和10%苯醚甲环唑水分散粒剂的速效性和持续性最好.

橡胶树胶孢炭疽病菌致病相关基因CgATG8的功能分析

ATG8是病原真菌中细胞自噬过程中的重要基因,并参与致病过程。基于橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组数据库,采用PCR和RT-PCR扩增得到橡胶树胶孢炭疽病菌的CgATG8基因并进行序列分析。采用Split-Marker Recombination法获得该基因的敲除转化子。表型分析结果表明,缺失该基因后,橡胶树胶孢炭疽病菌的致病力丧失,产孢能力、孢子萌发率、附着胞形成率和膨压均降低,而且孢子萌发和附着胞的形成延迟。

草莓胶孢炭疽菌CFEM候选效应子的生物信息学鉴定及其侵染过程中的转录分析

病原真菌通常分泌效应子到寄主组织中调控寄主的生理过程,从而有利于其侵染。CFEM(common in several fungal extracellular membrane)蛋白是真菌所独有的,且与致病性密切相关。本研究利用Pfam数据库对草莓胶孢炭疽菌全基因组进行搜索,鉴定获得22个CFEM蛋白。对CFEM蛋白的信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位进行分析,结果表明仅有8个CFEM蛋白为分泌蛋白。对CFEM分泌蛋白在不同侵染阶段的转录情况进行转录组学及RT-PCR分析,结果显示8个CFEM蛋白在侵染后不同时期均有表达。其中,1个CFEM分泌蛋白于附着胞形成期特异表达,2个于活体寄生阶段特异表达,2个于死体寄生阶段特异表达。综合上述分析结果,预测这8个分泌蛋白可能为草莓胶孢炭疽菌的效应子。本研究为深入解析植物病原真菌CFEM效应子提供了理论依据。

胶孢炭疽病菌对不同核桃品种的致病性测定

为确定胶孢炭疽病菌对核桃不同品种致病性的差异,给炭疽病的综合防治提供一定的理论依据,采用室内接种测定胶孢炭疽病菌(Gloeosporium fructigenum Berk)对12个品种的果实和14个品种的叶片的致病力。结果表明:(1)放置菌碟的方法接种较喷雾和直接挑菌丝发病早,扩展快,试验结果可靠,故选用放置菌碟的方法接种;(2)胶孢炭疽病菌对‘中林1号’‘、扎343’‘、晋丰’3个品种果实的致病性最强,病斑直径>10 mm,其次是‘中林5号’、‘辽核1号’、‘香玲’、‘鲁光’、‘京861’、‘金薄香1号’和‘辽核4号’,对‘丰辉’和‘绿波’的致病性最弱。(3)与果实相比,叶片发病早,接种后3天开始发病,其中‘丰辉’、‘辽核4号’和‘绿波’3个品种的叶片病斑最大,直径达20 mm左右,抗病性最好的是‘京861’‘、辽核1号’和‘辽核3号’3个品种,病斑直径在10 mm左右。

芒果胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的室内毒力测定

采用生长速率法对芒果胶孢炭疽菌、尖孢炭疽菌进行12种常用杀菌剂室内毒力测定。结果表明,咪鲜胺的效果最好,其EC50值分别为0.12 mg/L(胶孢炭疽菌)、0.13 mg/L(尖孢炭疽菌);其次是92%丙环唑原药;80%代森锰锌可湿性粉剂对二者的EC50值均最大,抑菌效果最差。因此,建议生产上使用咪鲜胺、丙环唑等抑菌效果较好的药剂来防治芒果炭疽病。

CgRGS7调控胶孢炭疽菌分生孢子产量、附着胞形成及致病性

【目的】G蛋白信号调控因子(regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白信号转导通路中的负调控因子,参与多个G蛋白信号通路介导的细胞内过程,目前对于胶孢炭疽菌相关RGS蛋白的生物学功能研究较少。【方法】本研究通过同源重组获得CgRGS7基因的敲除突变体,并对其生物学功能进行初步分析。【结果】CgRGS7基因编码620个氨基酸,具有7个跨膜结构域和1个RGS功能域。CgRGS7敲除突变体与野生型菌株相比,表现为分生孢子产量降低且孢子呈多端萌发,附着胞形成率下降以及致病性减弱。【结论】CgRGS7参与调控胶孢炭疽菌分生孢子产量,同时影响芽管的形态发育、附着胞形成及致病性。