人脑恶性胶质瘤微血管内皮细胞的分离培养与体外血管生成特性

目的 建立人脑恶性胶质瘤微血管内皮细胞 (glioma derivedmicrovascularendothelialcells ,GDMEC)体外培养体系并观察其体外毛细血管样结构形成特性。方法 采用胰酶、胶原酶联合消化法分离人脑恶性胶质瘤微血管片段 ,利用结合CD10 5抗体的MACSMicroBeads免疫磁珠内皮细胞分选系统纯化GDMEC ;应用光镜、透射电镜和免疫细胞化学等技术对所获得的GDMEC进行鉴定 ;采用三维培养模型 ,观察GDMEC受血管内皮生长因子 (VEGF)诱导下的小管样结构 (TLS)形成的特性。结果 所获GDMEC呈FⅧ RAg阳性 ,细胞纯度可达 98% ;电镜下见Weibel Palade小体 ;生长状态良好、可传代培养。这些细胞对VEGF刺激具有良好的反应性 ,体外易于形成TLS。结论 本研究摸索并建立了人脑GDMEC的分离培养方法 ,所获GDMEC对肿瘤血管生成研究具有重要价值。

胶质细胞源性神经营养因子(△N39)-R9神经营养活性和透过血脑屏障的研究

为了研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在中枢神经系统疾病中的治疗应用,运用基因突变、蛋白质融合表达和蛋白质纯化技术获得分子质量较小的GDNF(!N39)活性片段.将HIV-1Tat蛋白转导区(proteintransductiondomain,PTD)的9个碱性氨基酸49RKKRRQRRR57模拟物9个精氨酸(R9)与GDNF("N39)活性片段融合表达,获得纯度达95%以上的GDNF(#N39)-R9融合蛋白.将GDNF、GDNF($N39)、GDNF(%N39)-R9分别加入原代培养的中脑多巴胺能神经元和转染GDNF受体GFR&1和Ret的PC12细胞中,观察它们的神经营养活性和毒性.运用脑微血管内皮细胞株B-Endo3,观察GDNF(’N39)-R9蛋白穿越血管内皮细胞膜的功能;运用脑血管内皮细胞和Matrigel铺板模拟血脑屏障,Transwell法检测Tat-GDNF((N39)蛋白穿越脑血管内皮细胞和外周胶质膜的能力.结果显示:GDNF()N39)-R9蛋白具有类似GDNF的神经营养活性,促进原代培养的中脑多巴胺能神经元和稳定表达GFR*1和Ret受体的PC12-GFR+1-Ret细胞株的存活,没有显示毒性,并且能很好地穿过脑微血管内皮细胞层和模拟的血脑屏障.

BMP4在胶质母细胞瘤的多药耐药中的作用及机制研究

背景与目的:近年来的一系列实验证实,骨形成发生蛋白4(bone morphogenetic proteins 4,BMP4)在体内外可以抑制肿瘤的生长,但其机制还不清楚。本研究旨在探讨BMP4在胶质母细胞瘤多药耐药中的作用及机制。方法:检测人脑胶质母细胞瘤和正常脑组织标本中BMP4的表达量;构建多药耐药细胞株并进行鉴定,检测在多药耐药细胞株和正常胶质母细胞瘤细胞株内BMP4的表达量;通过在多药耐药细胞株中高表达BMP4,检测BMP4逆转多药耐药的可能性;通过检测高表达BMP4后耐药相关基因的表达变化,初步筛选出BMP4调节胶质母细胞瘤多药耐药的可能机制。结果:在胶质母细胞瘤内,BMP4表达量降低;多药耐药细胞株构建成功,且与对照组相比,多药耐药细胞株的BMP4表达量明显降低,高表达BMP4可以逆转多药耐药;高表达BMP4后,多药耐药相关的基因中,BCL-2和GDNF表达量明显降低。结论:BMP4可以逆转胶质母细胞瘤多药耐药,其可能机制是通过调节BCL-2和GDNF的表达。

BDNF和VEGF在人脑胶质瘤中的表达

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，因手术难以全切，术后易复发，治疗十分困难[1]。寻找针对胶质瘤治疗的有效手段仍有重要的现实意义。研究表明胶质瘤的发生与脑源性神经营养因子（brain—derived neurotropie factors，BDNF）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）有关，但具体机制不明，本研究采用免疫组化和免疫印迹技术法检测正常脑组织及胶质瘤中BDNF和VEGF的表达情况，进一步探讨二者与胶质瘤生成的关系，为研究胶质瘤提供新的实验依据。

脑源性神经营养因子促进人脑胶质瘤细胞株生长的研究

目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)在人脑胶质瘤U87-MG细胞株生长中的作用及其可能的促血管生成机制。方法:脑胶质瘤U87-MG细胞株给予BD-NF蛋白刺激或BDNF抗体处理,采用realtime PCR检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达,采用Transwell小室侵袭试验检测细胞侵袭能力,采用Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞术分析细胞凋亡。结果:BD-NF蛋白刺激后VEGFmRNA表达随着时间的延长而上调,与对照组相比,8h时增高了2.1倍,16h时增高了2.5倍。细胞侵袭力增加,紫色细胞计数对照组为317±16.1,8h为419±12.5,16h为511±10.1,差异有统计学意义,P<0.01。细胞凋亡率8h为2.28%,16h为2.04%,差异无统计学意义,P>0.05。BDNF抗体作用组与之相反,VEGFmRNA表达降低,8h时降低了0.88倍,16h时降低了0.78倍。紫色细胞计数8h为212±18,16h为195±17.7。细胞凋亡率8h为22.4%,16h为29%,差异有统计学意义,P<0.01。结论:BDNF在体外能够上调VEGFmR-NA表达,促进细胞侵袭,抑制细胞凋亡。

3,4-二羟基苯甲醛作用星形胶质细胞减轻脑微血管内皮细胞和神经元氧糖剥夺/再灌注损伤

目的:从神经血管单元(NVU)细胞间相互联系的角度,探讨天麻活性成分3,4-二羟基苯甲醛(3,4-DD)作用星形胶质细胞(Ast)对脑微血管内皮细胞(BMEC)和神经元氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤的保护作用。方法:从乳鼠分离、培养BMEC和Ast。采用Transwell小室分别构建Ast与BMEC、Ast与PC12细胞共培养体系。将共培养细胞分为对照组、模型组、丁苯酞(NBP)干预(1×10^(-4) mol/L)组、3,4-DD干预(1×10^(-7) mol/L)组。药物组预先给予相应药物干预24 h后,模型组和药物组细胞均诱导OGD/R损伤。采用细胞电阻仪测定各组Transwell小室内侧细胞的跨内皮电阻(TEER)值;试剂盒检测BMEC、PC12细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性;ELISA检测培养基中脑源性神经营养因子(BDNF)的含量;PCR检测BMEC细胞闭锁蛋白(Occludin)及PC12细胞磷脂酶C-γ(Plc-γ)的mRNA表达。结果:(1)Ast-BMEC共培养体系:与对照组相比,模型组TEER值、LDH活性、BDNF含量显著降低(P<0.01),Occludin mRNA表达显著增加(P<0.01)。与模型组相比,3,4-DD干预组TEER值、LDH活性、BDNF含量以及Occludin mRNA表达均显著升高(P<0.01),NBP干预组LDH活性、BDNF含量及Occludin mRNA表达亦显著增加(P<0.01)。3,4-DD干预组TEER值较NBP干预组明显升高(P<0.01)。(2)Ast-PC12共培养体系:与对照组相比,模型组TEER值、LDH活性、BDNF含量显著降低(P<0.01),Plc-γ mRNA表达显著增加(P<0.01)。与模型组相比,3,4-DD干预组LDH活性、BDNF含量及Plc-γ mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01),NBP干预组LDH活性及Plc-γ mRNA表达亦显著升高(P<0.01)。结论:3,4-DD通过促进Ast释放BDNF,作用于BMEC和神经元,维持细胞间结构,增强神经元突触可塑性,进而减轻OGD/R损伤。

贝伐珠单抗用于多形性胶质母细胞瘤一线治疗不具有经济性

研究背景及临床问题多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种罕见但侵袭性强的脑肿瘤,治疗选择少且患者治疗结局差。贝伐珠单抗是一种作用于血管内皮生长因子的人源化单抗,可用于多种肿瘤,发挥抗血管生成的作用。2009年,美国食品药品管理局已批准贝伐珠单抗用于复发性GBM的二线治疗,最近的研究数据也表明,

PD-ECGF、HGF在胶质瘤中的表达及与肿瘤血管生成的关系

目的探讨胶质瘤组织中血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、肝细胞生长因子(HGF)的表达及与肿瘤血管形成的关系。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定了30例胶质瘤和6例正常脑组织的PD-ECGF mRNA水平,用NIH Image软件量化分析目标PCR条带的面积与吸光度;采用原位杂交法检测HGF mRNA的表达;用免疫组化法检测CD34的表达,计算徽血管密度(MVD),并结合临床和病理资料进行分析。结果胶质瘤组织中PD-ECGF基因呈过度表达,高级别(Ⅲ～Ⅳ级)胶质瘤组织中PD-ECGF mRNA的平均表达水平(0.73±0.18)显著高于低级别(Ⅰ～Ⅱ级)胶质瘤(0.47±0.33)及正常脑组织(0.11±0.17),三组比较差异有显著性(P=0.000);生存时间≥2年组中PD-ECGF mRNA的表达水平(0.47±0.29)低于生存时间<2年组(0.81±0.11),差异有显著性(P=0.001)。HGF mRNA在正常脑组织均未见表达,在低级别和高级别胶质瘤组织中阳性率分别为35.7%和75.0%,差异有显著性(P=0.0301;生存时间≥2年组中HGF mRNA的阳性表达率(27.8%)低于生存时间<2年组(83.3%),差异有显著性(P=0.003)。MVD在正常脑组织、低级别和高级别胶质瘤组织中分别为(8±4)个、(20±7)个和(29±6)个,差异有显著性(P=0.000);MVD和PD-ECGF mRNA、HGF mRNA之间存在显著正相关(r_1=0.390.P_1=0.033;r_2=0.514,P_2=0.004),PD-ECGF mRNA和HGF mRNA之间存在显著正相关(r=0.370,P=0.044)。结论胶质瘤中MVD比正常脑组织显著增高,显示了胶质瘤丰富血供的肿瘤血管生成特征。PD-ECGF、HGF在胶质瘤中的表达显著增强,在肿瘤血管生成中起着重要作用,能共同调节胶质瘤的血管形成,可用于判断胶质瘤的生物学行为,并对判断预后有指导意义。

miR-19a对血肿瘤屏障通透性的影响

目的研究miR-19a对血肿瘤屏障通透性的影响。方法将miR-19a模拟物转染至人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3,应用real-timePCR法检测miR-19a的表达。用过表达miR-19a的hCMEC/D3细胞和人U251胶质瘤细胞建立体外血肿瘤屏障模型,跨内皮电阻测量系统检测血肿瘤屏障跨内皮阻抗值的变化;Western blot和免疫荧光法检测体外血肿瘤屏障hCMEC/D3细胞中,紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达。结果经miR-19a模拟物转染后,hCMEC/D3细胞中miR-19a的表达水平显著升高;血肿瘤屏障跨内皮阻抗值显著下降;体外血肿瘤屏障hCMEC/D3细胞中,紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达水平显著降低,在细胞膜上呈不连续分布。结论 miR-19a过表达能显著增加血肿瘤屏障的通透性,其机制之一可能与降低紧密连接相关蛋白相关。