哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞增殖及HIF-1α表达的影响

目的探索哇巴因(Ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞增殖和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。方法Ouabain(0.05、0.5、2.5、25μmol/L)作用于U87-MG细胞24 h,MTT法检测吸光度值和细胞活力,Western Blot检测HIF-1α表达量。结果不同浓度Ouabain干预24 h后U87-MG细胞吸光度值(OD_(490))与Control组相比,均明显降低(P均<0.01),细胞活力显著下降(P<0.01);与Control组比较,0.05μmol/L Ouabain组HIF-1α蛋白表达量上升(1.27±0.05vs.1.00±0.05,P<0.05),当Ouabain浓度升高至2.5、25μmol/L,HIF-1α表达显著降低(0.28±0.04,0.20±0.03 vs.1.00±0.05,P均<0.01)。结论较高浓度Ouabain可通过抑制HIF-1α表达,促进人胶质瘤U87-MG细胞凋亡。

数字全息显微镜观察哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞的影响

目的应用数字全息显微镜观察哇巴因(ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞的影响。方法不同浓度ouabain(0.05、0.5、2.5、25μM)干预U87-MG细胞,24 h后使用光学显微镜观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞活力,数字全息显微镜观察ouabain作用后细胞的动态变化和运动能力改变。结果与Control组比较,ouabain明显减低细胞活力[0.05μM(75.92±3.21)%,0.5μM(49.61±3.95)%,2.5μM(42.74±3.21)%,25μM(32.86±2.00)%vs.Control(100±0.01)%;P<0.01],减少细胞数量[0.05μM(170.7±4.7),0.5μM(162.3±4.4),2.5μM(142.0±2.6),25μM(110.3±1.2)vs.Control(193.7±2.6);P<0.05或P<0.01],并降低细胞运动能力[0.05μM(809.0±19.8)μm,0.5μM(626.9±23.5)μm,2.5μM(476.7±22.9)μm,25μM(386.5±19.6)μm vs.Control(959.7±18.9)μm;P<0.01],且呈浓度依赖性。结论 ouabain可抑制人胶质瘤U87-MG细胞的生长、降低肿瘤细胞运动能力并最终引起细胞死亡,数字全息显微镜可起到良好的评价作用。

红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响

目的观察红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响,探讨其诱导U87-MG细胞凋亡机制。方法不同浓度红景天苷和喜树碱加入U87-MG细胞中,作用24 h后,MTT法测定U87-MG细胞增殖,流式细胞术检测U87-MG细胞凋亡率,Transwell法检测U87-MG细胞侵袭能力,间接荧光标记法测定细胞内活性氧(ROS)水平,Western blot检测U87-MG细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果与空白对照组比较,各给药组U87-MG细胞生长抑制作用明显,10、50、100μg/m L红景天苷作用U87-MG细胞后,细胞侵袭能力显著下降,10、50、100μg/m L红景天苷作用U87-MG细胞48 h后均能诱导U87-MG细胞凋亡;ROS水平与红景天苷浓度呈正相关;10、50、100μg/m L红景天苷上调Caspase-3、Bax和E-cadherin的表达,下调Bcl-2和N-cadherin和MMP-9的表达。结论红景天苷可诱导U87-MG细胞凋亡、抑制U87-MG细胞的侵袭能力。

溶瘤新城疫病毒抑制IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞的迁移和侵袭

目的:探讨溶瘤新城疫病毒(NDV)对IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其可能的机制。方法:将U87MG细胞分为对照组、IL-6组、NDV组、NDV+IL-6组,其中IL-6组与NDV+IL-6组用75 ng/mL IL-6预处理1 h,其余组用DMEM预处理1 h,后分别用DMEM、75 ng/mL IL-6、1 HU NDV、1 HU NDV+75 ng/mL IL-6处理24 h。MTT法、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测IL-6、NDV对U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响,WB法检测各组细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和MMP2蛋白的表达水平。结果:与对照组相比,IL-6组细胞迁移率显著升高(P<0.05),侵袭细胞数目显著增多(P<0.01);与IL-6组相比,NDV+IL-6组U87MG细胞增殖率显著降低(P<0.05),细胞迁移率和侵袭细胞数目均显著降低(均P<0.01)。WB实验结果显示,与对照组相比,IL-6组p-STAT3/STAT3比值显著升高(P<0.01),NDV组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值显著降低(P<0.05,P<0.01),MMP-2蛋白表达量显著降低(P<0.01);与IL-6组相比,NDV+IL-6组p-STAT3/STAT3比值、MMP-2蛋白表达量均显著降低(均P<0.05)。结论:NDV能抑制IL-6对人脑胶质瘤U87MG细胞迁移和侵袭的诱导作用,其机制可能与JAK2/STAT3信号通路的参与调控有关。

槐定碱抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖和侵袭及机制研究

探讨槐定碱抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖和侵袭及机制。方法 根据实验方式进行分组,分为对照组、槐定碱组、氯喹+槐定碱组。对槐定碱抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖、侵袭能力、迁移能力及活性氧蛋白水平激发情况进行分析,其中细胞增殖的抑制作用利用MTT法检测、侵袭能力利用Transwell小室法检测、细胞的迁移能力利用细胞划痕试验检、活性氧蛋白水平利用Western-blot法检测。结果 与对照组中的超微结构结构相比,U251恶性胶质瘤细胞株在经过槐定碱处理后,其胞质中出现大小不等的自噬体,而这部分自噬体中含有溶酶体、胞质等未消化的细胞器。MTT法检测发现在使用槐定碱试剂进行干预后,槐定碱组中槐定碱对U251恶性胶质瘤细胞生长的半数抑制浓度为(16.45±2.41),高于氯喹+槐定碱组的(2.67±0.56)及对照组的(1.01±0.03);通过Transwell小室检测细胞迁移率发现槐定碱组低于氯喹+槐定碱组及对照组(P<0.05);LC3Ⅱ/Ⅰ、活性氧水平分析中槐定碱组高于氯喹+槐定碱组及对照组(P<0.05);同时Person相关性分析提示活性氧与细胞中呈正相关性(r=0.431,P<0.05)。结论 通过分析发现,槐定碱能够通过调节、诱导自噬来抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖、侵袭、迁移,并涉及细胞中活性氧水平的改变。

大黄酚调控Wnt/β-catenin通路对胶质瘤U87细胞增殖、凋亡、侵袭能力及EMT的影响

目的:探讨大黄酚调控Wnt/β-catenin信号通路抑制胶质瘤细胞的作用机制。方法:体外培养人脑胶质瘤细胞U87,用不同浓度(0、50、100、200μmol/L)的大黄酚处理后,采用CCK-8法检测U87细胞增殖能力;划痕法检测细胞迁移能力;Transwell法检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及Wnt通路上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白β-catenin、E-cadherin、vimentin、MMP-9蛋白表达。结果:大黄酚能抑制U87细胞增殖、迁移及侵袭,诱导凋亡(P<0.05),下调Bcl-2、β-catenin、vimentin与MMP-9的表达水平,上调Bax与E-cadherin的表达水平(P<0.05),并呈浓度依赖关系。结论:大黄酚能抑制胶质瘤细胞U87增殖、迁移及侵袭能力,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

下调RNA甲基化酶NSUN2表达对脑胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的探讨下调NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NSUN2)表达对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法体外培养正常胶质细胞HEB、胶质瘤细胞系(A172、U251、U87),免疫印迹法检测NSUN2蛋白表达水平;用shNSUN2慢病毒(sh-NSUN2组)及shRNA scramble慢病毒(sh-CON组)感染U87细胞下调NSUN2表达,用CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移。结果与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系A172、U251、U87的NSUN2蛋白表达量均明显增高(P<0.05)。与sh-CON组比较,sh-NSUN2组NSUN2蛋白表达水平、细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力均明显降低(P<0.05)。结论胶质瘤NSUN2呈高表达,下调其表达明显抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。

环孢素A增强三氧化二砷诱导的胶质瘤细胞U87-MG自噬性死亡

目的:探讨环孢素A(cyclosporine A,CsA)联合三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对脑胶质瘤细胞U87-MG自噬性死亡的影响。方法:CsA联合ATO作用U87-MG细胞后,应用MTT法检测细胞的存活率及ATO半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50),FCM法检测细胞周期的改变,荧光显微镜下观察及FCM法定量分析经吖啶橙(acridine orange,AO)活体染色后细胞质内酸性自噬泡(acidic vesicular organelles,AVO)的形成情况;Western印迹法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1和自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达水平。结果:小剂量CsA(2μmol/L)联合ATO可明显抑制U87-MG细胞的生长,CsA可增加ATO诱导的细胞自噬性死亡,使ATO的IC50值由单独作用时的4.28μmol/L降低至联合作用时的1.28μmol/L;与对照组相比,CsA联合ATO作用后G2/M期细胞明显减少(P<0.05);AO活体染色可见,CsA联合ATO作用可显著增加细胞内的AVO形成,与CsA、ATO单独作用组相比差异有统计学意义(P<0.01);Western印迹可见CsA联合ATO作用后细胞内Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达明显上调,与对照组和单独作用组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CsA可以增强ATO诱导的恶性脑胶质瘤细胞U87-MG的自噬性死亡,为恶性脑胶质瘤的治疗提供新的方向。

环状RNA同源性蛋白激酶3靶向微RNA-338促进胶质瘤细胞侵袭、迁移的实验研究

目的探讨人血清环状RNA同源性蛋白激酶3(CircHIPK3)靶向微RNA-338(miR-338)对胶质瘤细胞U251细胞侵袭、迁移的影响。方法2021年2-12月,在武汉大学人民医院科研中心将U251细胞分为空白(NG)组、CircHIPK3阴性对照(shcontrol)组、HIPK3敲减(sh-CircHIPK3)组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测U251细胞中CircHIPK3、miR-338表达水平;Transwell检测细胞迁移与侵袭;划痕法检测细胞迁移;流式细胞术检测细胞周期;通过Circular RNA Interactome、RegRNA2.0、CircBank Database网站预测CircHIPK3(ID:hsa_circ_0000284)的靶向miRNA并用双萤光素酶实验验证,蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达。结果与NG组、sh-control组比较,sh-CircHIPK3组中CircHIPK3(1.00±0.00、1.06±0.26比0.56±0.06)表达水平显著降低(P<0.05),miR-338(1.00±0.00、1.12±0.19比1.89±0.28)表达、G1期细胞比例[(58.72±0.36)%、(58.45±0.27)%比(64.72±0.47)%]升高(P<0.05),U251细胞侵袭数目[(164.89±12.55)个、(165.77±12.16)个比(80.13±11.37)个]、划痕愈合率[(25.66±2.37)%、(26.38±2.53)%比(10.36±1.53)%]、迁移细胞数目[(196.72±18.75)个、(194.65±17.86)个比(95.58±8.66)个]、S期细胞比例[(26.45±0.39)%、(26.57±0.41)%比(20.72±0.18)%]明显降低(P<0.05);miR-338是CircHIPK3的靶基因。与NG组、sh-control组比较,sh-CircHIPK3组MMP-2(1.31±0.23、1.33±0.20比0.61±0.05)、MMP-9(1.16±0.22、1.15±0.21比0.85±0.19)蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论沉默CircHIPK3通过靶向上调miR-338表达能抑制胶质瘤细胞U251细胞迁移和侵袭。

人U87-MG脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的应用不同数量U87-MG细胞接种裸鼠脑内,建立裸鼠脑胶质瘤模型,观察其生长特性。方法采用立体定向技术,分别将3.0×10^(10)·L^(-1)、4.0×10^(10)·L^(-1)、5.0×10^(10)·L^(-1)浓度的人脑胶质瘤细胞U87-MG单细胞悬液,接种于18只♂裸鼠的右侧尾状核区,每只接种体积为5μL,另取6只裸鼠作为对照,接种同体积Hanks液。观察不同接种量实验鼠的生存状态、成瘤情况及脏器转移灶、带瘤生存期,测量肿瘤的最大径,计算肿瘤体积,将获取的全脑标本制作病理切片,行HE染色和免疫组化检查。结果各接种量的实验组成瘤率均为100%,未见颅外转移病灶,3组裸鼠的平均生存时间分别为(46.50±3.27)d、(38.50±3.28)d、(30.67±3.51)d;病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型;免疫组化GFAP和S-100蛋白呈阳性表达。结论立体定向脑内定量注射U87-MG细胞制备的人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型成瘤率高、颅内生长稳定、颅外远隔部位转移率低,与人脑胶质瘤病理学及形态学特征相似,能为研究胶质瘤的发生、发病机制、生物学特性以及探寻有效的治疗措施提供可靠的动物模型。

秋水仙碱对胶质瘤细胞系化疗敏感性的影响

目的探讨秋水仙碱对胶质瘤细胞系化疗敏感性的影响及其机制。方法采用不同浓度的替莫唑胺(TMZ)处理人脑胶质瘤细胞系U87和A172细胞,构建TMZ耐药细胞系U87/TR和A172/TR,再使用秋水仙碱(10、30 ng/ml)干预1、2、3 d,采用细胞计数法、BrdU法和流式细胞术检测细胞活力、细胞增殖和细胞周期。生物信息学方法分析胶质瘤组织差异表达的微小RNA(miRNAs),并预测其靶基因;然后,采用qRT-PCR检测U-87/TR和A172/TR细胞中这些miRNAs的表达情况,调控miRNAs的表达以观察秋水仙碱效应的变化。结果秋水仙碱显著抑制U87/TR和A172/TR细胞的增殖活力(P<0.05),呈时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05),而且显著阻滞U87/TR和A172/TR的有丝分裂,使细胞阻滞在G0/G1期。30ng/ml秋水仙碱显著增加TMZ对U87/TR和A172/TR细胞增殖的抑制效果(P<0.05),明显降低TMZ的IC50值(P<0.05)。生信分析显示,胶质瘤组织miR-330-3p、miR-491-5p、miR-6782-5p、miR-31-5p、miR-330-5p、miR-137和miR-433-3p呈差异表达,秋水仙碱明显上调U87/TR和A172/TR细胞miR-330-3p的表达(P<0.05)、明显抑制miR-330-3p靶基因ErbB的表达(P<0.05)。抑制miR-330-3p表达明显逆转秋水仙碱的生物学效应(P<0.05)。结论秋水仙碱可以抑制TMZ耐药的胶质瘤细胞的增殖,其机制可能涉及到miR-330-3p/ErbB信号通路的调节。

FHL2通过MGMT影响胶质母细胞瘤U87细胞对替莫唑胺的耐药性

目的:探讨干扰四个半LIM结构域蛋白2(FHL2)的表达对胶质母细胞瘤U87细胞中O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)表达的影响,以及对U87细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法:利用慢病毒感染技术分别将携带不同FHL2干扰序列的慢病毒(shFHL2-1#、shFHL2-4#)及其阴性对照(shN)感染U87细胞,分别命名为shFHL2-1#、shFHL2-4#和shN组;采用siRNA转染技术将siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN转染至U87细胞,为siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN组,qPCR和WB法验证FHL2或MGMT的敲低效果。用TMZ处理上述各组细胞(以DMSO处理组为对照),随后以CCK-8法和细胞克隆形成实验检测TMZ处理前后FHL2或MGMT敲低组细胞的增殖情况,FCM检测TMZ处理前后FHL2敲低组细胞的凋亡情况,WB法和免疫荧光法检测敲低FHL2对U87细胞中MGMT表达的影响,WB法检测TMZ处理对各组细胞中FHL2和MGMT表达水平的影响。结果:成功构建敲低FHL2或MGMT表达的U87细胞。与shN组相比,shFHL2-1#、shFHL2-4#组U87细胞的增殖能力减弱、凋亡水平升高(均P<0.01),MGMT表达水平明显降低(均P<0.01)。经TMZ处理后,与相应的DMSO处理组相比,shN组细胞中FHL2和MGMT的表达水平显著升高(均P<0.05),而细胞的增殖和凋亡均无显著变化(均P>0.05);shFHL2-1#、shFHL2-4#组细胞中FHL2和MGMT的表达水平无显著改变(均P>0.05),但细胞增殖能力进一步显著降低、凋亡水平进一步显著升高(均P<0.01)。敲低MGMT使U87细胞增殖减慢(P<0.01),而siMGMT-1#、siMGMT-4#组细胞经TMZ处理后增殖能力进一步降低(均P<0.01)。结论:干扰FHL2表达使得U87细胞增殖减慢而凋亡加剧、MGMT表达下调,提示FHL2可能通过影响MGMT的表达调控U87细胞对TMZ的耐药性。

人U87-MG脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的建立成瘤率高、可靠稳定的人U87-MG脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型,为研究人脑胶质瘤的发病机制和治疗方法提供操作平台。方法采用立体定向技术,分别将2.5×105个/5μL体外培养的人脑胶质瘤细胞U87-MG单细胞悬液,接种于15只雄性裸鼠的右侧尾壳核区,另取6只裸鼠作为对照,接种同体积Hanks液。分别于接种后7,14,21,28 d行活体动物体内荧光成像和核磁共振扫描动态观察肿瘤大小,之后采用心脏灌注技术固定裸鼠脑组织,将获取的全脑标本制作病理切片,行HE染色和免疫组化检查。结果接种U87-MG的裸鼠均于造模后14 d开始脑内出现肿瘤,成瘤率100%,直至28 d肿瘤持续增长,35 d内该造模裸鼠全部死亡,平均生存时间(30.67±2.03)d;病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型;接种后14 d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。结论立体定向脑内定量注射U87-MG细胞制作的人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型,简便易行、经济实用、成瘤率高、重复性好、颅外远隔部位转移率低、与人脑胶质瘤病理学及形态学特征相似,能为研究胶质瘤的发生、发病机制、生物学特性以及探寻有效的治疗措施提供可靠的动物模型。

U87-MG细胞中沉默NIN1/RPN12结合蛋白1同源物在宫颈癌及癌前病变中表达及其与高危型人乳头瘤病毒DNA负荷量相关性分析

目的探讨U87-MG细胞中沉默NIN1/RPN12结合蛋白1同源物(NOB1)在宫颈癌及癌前病变中表达及其与高危型人乳头瘤病毒(HPV)DNA负荷量相关性。方法选取2019年1月至2021年3月于本院就诊的120例宫颈病变患者作为研究对象,其中72例宫颈上皮内瘤病患者作为宫颈上皮内瘤病组,48例宫颈癌患者作为宫颈癌组;另选取同期50例体检的宫颈正常女性作为宫颈正常组。3组均进行NOB1检测及高危型HPV检测,比较3组宫颈组织中NOB1基因阳性表达率、高危型HPV DNA负荷量及阳性率,比较宫颈癌患者不同参数的NOB1基因和高危型HPV表达情况,分析NOB1基因阳性表达与高危型HPV DNA负荷量相关性。结果3组NOB1基因阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组NOB1基因阳性表达率高于宫颈癌上皮内瘤病变组、宫颈正常组,宫颈癌上皮内瘤病变组高于宫颈正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组高危型HPV DNA负荷量比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组高危型HPV DNA阳性率高于宫颈癌上皮内瘤病变组、宫颈正常组,宫颈癌上皮内瘤病变组高于宫颈正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌患者组织学分级、淋巴结转移NOB1基因阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌患者不同年龄、组织学类型、肌层浸润、分期的NOB1基因阳性表达率比较差异无统计学意义;宫颈癌患者不同年龄、组织学类型、组织学分级、肌层浸润、分期、淋巴结转移的高危型HPV DNA阳性表达率比较差异无统计学意义。Spearman相关性分析结果显示,宫颈癌患者NOB1表达与高危型HPV DNA负荷量呈正相关(r>0,P<0.05)。结论宫颈癌组织中NOB1基因阳性表达,可增加疾病恶性程度和淋巴结转移风险,与高危型HPV感染密切相关。

KDELR2调控CCNE2对胶质瘤U87细胞增殖的影响

观察赖氨酸-门冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸受体2(Lys-Asp-Glu-Leu Receptor 2, KDELR2)调控CCNE2(cyclin E2)的表达以及对胶质瘤U87细胞增殖影响。方法 常规培养胶质瘤U87细胞,阴性对照病毒CON290(KDELR2-NC)、LV-KDELR2-RNAi(KDELR2-KD)、阴性对照病毒CON077(CCNE2-NC)、LV-CCNE2(CCNE2-OE),按照实验分组KDELR2-NC+CCNE2-NC(NC+NC)、KDELR2-KD+CCNE2-NC(KD+NC)、KDELR2-NC+CCNE2-OE(NC+OE)、KDELR2-KD+CCNE2-OE(KD+OE)分别加入慢病毒,通过qRT-PCR检测各组CCNE2的mRNA改变情况;Western blot检测CCNE2蛋白表达;CCK-8和克隆形成实验检测不同组别U87细胞增殖情况;流式细胞术检测U87细胞周期和凋亡变化。结果 干扰KDELR2后,CCNE2的mRNA以及蛋白表达明显降低;干扰KDELR2后能够减少U87细胞G1/S期跨越,增加细胞凋亡,从而抑制细胞增殖;过表达CCNE2能够部分逆转KDELR2下降对U87细胞周期、细胞凋亡、增殖的影响。结论 KDELR2高表达调控U87细胞中CCNE2 mRNA以及蛋白水平的表达,从而影响其细胞G1/S期进程、凋亡以及增殖。

基于TGFβ1介导的上皮-间充质转化探讨重楼皂苷Ⅰ抑制胶质母细胞瘤侵袭、迁移的分子机制

目的采用生物信息学与实验验证探究重楼皂苷I调控上皮-间充质转化(EMT)抑制胶质母细胞瘤(GBM)侵袭、迁移的作用机制。方法通过肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库筛选胶质母细胞瘤的差异表达基因(DEGs)并进行富集分析,探究其发病相关的作用机制。将预测得到的重楼皂苷I靶点与疾病的DEGs取交集,构建蛋白互作网络,筛选药物发挥治疗作用的关键靶点进行富集分析并通过分子对接进行验证,以明确重楼皂苷I治疗胶质母细胞瘤的潜在分子机制。基于以上生物信息学结果,进行体外实验验证。以不同浓度的重楼皂苷I分别干预人胶质母细胞瘤细胞系LN229和U251后,细胞增殖与细胞毒性检测法(CCK-8)检测细胞活性;Transwell实验检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;Immunoblotting法检测转化生长因子β1(TGFβ1)、钙黏蛋白1(CDH1)、钙黏蛋白2(CDH2)、波形蛋白(VIM)的蛋白表达水平。通过基因表达谱交互分析数据库(GEPIA)分析胶质母细胞瘤与正常组织中CDH2、TGFβ1、VIM的表达差异,预测其对患者生存情况的影响。结果基于生物信息学蛋白互作分析,筛选出CDH1、CDH2和TGFβ1等7个关键靶点,富集分析发现与EMT生物过程及TGFβ信号通路关系密切。不同浓度的重楼皂苷I分别干预LN229与U251后细胞活性明显降低(P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,重楼皂苷I可明显抑制LN229和U251细胞的侵袭(P<0.01)及迁移能力(P<0.05,P<0.01),下调TGFβ1、CDH2、VIM蛋白并上调CDH1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖效应(P<0.01)。GEPIA分析发现胶质母细胞瘤组织中CDH2、TGFβ1和VIM表达水平明显高于正常组织(P<0.05),其中TGFβ1和VIM的高表达可能是影响患者无病生存期的关键因素(P<0.05)。结论重楼皂苷I可通过TGFβ1介导的EMT进程,抑制LN229与U251细胞的侵袭与迁移能力,为临床精准治疗和中药小分子开发提供了新的研究方向与证据支持。

miR-370-3p对胶质母细胞瘤U87-MG细胞株增殖能力的影响

目的探讨微小RNA-370-3p(miR-370-3p)对人脑胶质瘤细胞系U87-MG增殖能力的影响及其机制。方法将常规培养的U87-MG细胞分为空白组、无义序列转染组和模拟物转染组,后两组分别转染miRNA无义序列及miR-370-3p模拟物,qRT-PCR法检测其转染效率,免疫印迹法检测转染细胞叉头框蛋白M1(FoxM1)的表达;采用Ed U法评估细胞的增殖能力,采用平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。结果与空白组和无义序列转染组比较,模拟物转染组细胞miR-370-3p表达显著增加(P<0.05),而FoxM1的蛋白表达显著减少(P<0.05);而且模拟物转染组U87-MG细胞增殖能力及克隆形成率均明显减少(P<0.05)。结论 miR-370-3p能够抑制U87-MG细胞的增殖能力,可能与减少FoxM1的表达有关。

FHL2与LDHA相互作用促进胶质瘤细胞的增殖

目的:探讨四个半LIM结构域2(FHL2)蛋白对胶质瘤细胞增殖的影响及其分子机制。方法:利用TCGA和CGGA数据库分析胶质瘤组织中FHL2 mRNA表达水平与患者预后的关系。通过WB法检测人胶质瘤组织标本及人胶质瘤细胞U87、T98G、U251、SNB19、GSC23、A172、LN229、G267和星形胶质细胞NHA中的FHL2蛋白表达水平。利用慢病毒载体构建稳定敲低FHL2的U87细胞和过表达FHL2的SNB19细胞,即U87-shGFP、U87-shFHL2-1#、U87-shFHL2-4#和SNB19-3flag、SNB19-3flag-FHL2组。通过CCK-8法、克隆形成实验检测敲低和过表达FHL2对细胞增殖的影响,免疫共沉淀(Co-IP)和液相色谱-串联质谱(LC/MS)法筛选FHL2在胶质瘤细胞中的相互作用蛋白,并用Co-IP和免疫荧光法验证它们的结合作用和共定位情况。使用酶标仪检测敲低和过表达FHL2细胞内乳酸产量和乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化,WB法分析FHL2、LDHA及p-LDHA在正常脑组织和胶质瘤组织中的蛋白表达差异及其相互关系。在过表达FHL2的SNB19细胞中使用LDHA的小分子抑制剂AT-101,通过CCK-8实验和酶标仪比色法验证FHL2在胶质瘤乳酸代谢中的作用,验证AT-101在胶质瘤中潜在的治疗效果。结果:Co-IP和LC/MS检测发现,FHL2与LDHA在胶质瘤细胞中存在相互作用。FHL2过表达可提高LDHA活性和乳酸生成(均P<0.001),进而促进胶质瘤细胞增殖(P<0.001)。相反,敲低FHL2会降低LDHA活性和乳酸产量(P<0.001或P<0.05)并抑制细胞增殖(P<0.001)。AT101能抑制LDHA活性,并显著抑制FHL2促进胶质瘤细胞的增殖,同时恢复磷酸化LDHA(Y10)水平(P<0.01或P<0.001)。结论:FHL2与LDHA蛋白相互作用,FHL2通过激活p-LDHA(Y10)的表达促进LDHA活性和乳酸产生,进而促进胶质瘤细胞的增殖,靶向这种相互作用可能成为治疗胶质瘤的潜在策略。

RNA干扰Fascin1表达抑制胶质瘤细胞U87MG的侵袭、转移能力

目的:本研究运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异性抑制肌动蛋白结合的细胞骨架蛋白Fascin1的表达,并探讨其对胶质瘤细胞U87 MG的侵袭和转移能力的影响及相关分子机制。方法:将针对Fascin1的小干扰RNA(Fascin1-si RNA)和阴性对照si RNA(Negative-si RNA)转染至人胶质瘤细胞株U87 MG中。实验分为3组:空白对照组(未转染的细胞)、阴性对照组(转染neg-si RNA的细胞)、实验组(转染Fascin1-si RNA的细胞)。用transwell小室法检测Fascin1对U87MG细胞的侵袭和转移能力的影响,蛋白印迹法(Western blot)检测U87 MG细胞中Fascin1、p AKT及p STAT3等蛋白的表达。通过添加针对PI3K通路的抑制剂LY294002和针对STAT3通路的抑制剂JSI-124,证实了这两条信号通路在胶质瘤细胞U87MG侵袭、转移方面的作用。结果:相比空白对照组和阴性对照组,实验组细胞的转移能力降低了约(49±5.8)%及(46±5.4)%(P<0.05),侵袭能力降低了约(42±4.9)%和(43±4.8)%(P<0.05);且相关的PI3K/AKT及STAT3等信号通路的磷酸化减少;添加相应的信号通路抑制剂后,细胞的侵袭、转移能力显著降低(P<0.05)。结论:RNAi抑制Fascin1表达能够降低胶质瘤细胞U87 MG的侵袭及转移能力,并可抑制PI3K/AKT和STAT3信号激活,在一定程度上可逆转胶质瘤细胞的转移和侵袭等肿瘤特性。

槲皮素对胶质瘤U87细胞侵袭、迁移、增殖及其细胞周期的影响

目的探讨黄酮类化合物槲皮素对人胶质瘤U87细胞侵袭、迁移、增殖及其细胞周期的影响。方法将U87细胞分成Q0、Q50、Q100和Q1504个组,Q0组加适量二甲亚砜(槲皮素溶剂)处理,Q50、Q100和Q150组槲皮素的浓度分别为50、100、150μmol/L。分别通过transwell体外侵袭实验、transwell体外迁移实验、Click-iT Edu test技术和流式细胞术检测槲皮素对其侵袭迁移能力,增殖能力及其细胞周期的影响。结果槲皮素处理36 h后,与对照组相比,Q50、Q100和Q150组的侵袭细胞比率分别为:52.08%、24.63%和13.13%,P均<0.05。槲皮素处理12 h后,与对照组相比,Q50、Q100和Q150的迁移细胞比率分别为:49.46%、26.78%和14.56%,P均<0.05。槲皮素处理24 h后,Q0、Q50、Q100和Q150组的增殖细胞百分比分别为25.21%、18.38%、16.74%和15.24%。G0/Gl期C6细胞所占比例分别为71.14%、72.71%、69.29%、66.47%,S期分别为25.32%、22.48%、21.96%、23.32%,G2/M期分别为3.53%、4.80%、8.75%、10.25%;Q100、Q150组的G2/M期细胞比例与Q0组比较,P均<0.05。结论槲皮素能明显降低胶质瘤细胞的侵袭迁移能力;并可通过阻断U87细胞的细胞周期进程来抑制其增殖。