M2型巨噬细胞衍生外泌体促进小胶质细胞M2型极化

背景:目前对于M2型巨噬细胞衍生外泌体的研究多集中于促进伤口愈合及成骨细胞的增殖和分化,而很少有研究关注其对小胶质细胞表型的调控作用。目的:探讨M2型巨噬细胞衍生外泌体对于小胶质细胞的表型调控作用及分子机制。方法:①提取骨髓原代巨噬细胞,用50 ng/m L白细胞介素4刺激巨噬细胞24 h促进巨噬细胞M2型极化,流式细胞术和细胞免疫荧光鉴定M2型巨噬细胞标志物CD206;②提取和鉴定M2型巨噬细胞衍生外泌体;③将小胶质细胞BV2随机分为3组:对照组、脂多糖组、治疗组,对照组不做处理,脂多糖组加入500 ng/m L脂多糖干预24 h,治疗组同时加入500 ng/m L脂多糖和25μg/m L M2型巨噬细胞衍生外泌体干预24 h,ELISA检测培养上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素10的分泌量,q RT-PCR检测细胞中诱导型一氧化氮合酶、精氨酸酶1、白细胞介素1β和白细胞介素10的m RNA表达,Western blot检测诱导型一氧化氮合酶、精氨酸酶1的蛋白表达以及核因子κB信号通路相关蛋白表达。结果与结论:①ELISA结果显示,与对照组相比,脂多糖组肿瘤坏死因子α分泌明显增多;与脂多糖组相比,治疗组肿瘤坏死因子α的分泌减少而白细胞介素10的分泌增多;②q RT-PCR结果显示,与对照组相比,脂多糖组白细胞介素1β、诱导型一氧化氮合酶m RNA表达升高;与脂多糖组相比,治疗组白细胞介素1β、诱导型一氧化氮合酶m RNA表达降低,白细胞介素10、精氨酸酶1 m RNA表达升高;③Western blot结果显示,与对照组相比,脂多糖组诱导型一氧化氮合酶蛋白表达升高;与脂多糖组相比,治疗组诱导型一氧化氮合酶蛋白表达降低,而精氨酸酶1蛋白表达升高;(4)与对照组相比,脂多糖组核因子κB信号通路中P65、p-IκB-α蛋白表达降低;与脂多糖组相比,治疗组P65、p-IκB-α蛋白表达升高。结果表明:M2型巨噬细胞衍生外泌体可以显著抑制脂多糖诱导小胶质细胞的炎症反应,促进抗炎因子白细胞介素10的表达,抑制促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达,促进小胶质细胞表型由M1型向M2型极化,其机制可能与M2型巨噬细胞衍生外泌体抑制核因子κB信号通路激活有关。

Müller细胞胶质间质转化在视网膜纤维化疾病中的作用

胶质细胞间质转化(GMT)指胶质细胞在各种因素刺激下逐渐获得间质细胞表型和特征的生物学过程,与视网膜纤维化疾病密切相关。Müller细胞是视网膜上最主要的大胶质细胞,在受到各种病理因素刺激时被激活并发生转分化。目前,已有研究表明,Müller细胞GMT与糖尿病视网膜病变、特发性黄斑前膜(iERM)、年龄相关性黄斑变性(ARMD)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)等多种疾病密切相关。尽管GMT相关调控机制尚不完全明确,但其作为一个潜在的干预靶点,具有良好的研究前景。了解Müller细胞GMT在视网膜疾病中的研究进展,能够为多种视网膜疾病的早期诊断和治疗提供新思路,对于全面揭示细胞转型家族在视网膜疾病中的交互作用具有重要的临床和科学意义。

m6A基因模型预测胶质母细胞瘤患者的预后

目的:构建m6A相关胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)预后模型,识别受m6A调控的潜在预后生物标志物。方法:从TCGA和GEO中分别收集了GBM的表达、临床表型和生存数据,m6A2Target中获取m6A调控因子。获得m6A调控因子与TCGA-GBM基因交集。根据TCGA-GBM表达,计算正常-癌症间差异的基因。基于差异的m6A调控因子进行一致性聚类,识别亚型,构建亚型间差异的预后相关基因模型,并进行验证。结果:从m6A2Target中获取了21个m6A调控因子,与TCGA-GBM包含的基因交集有19个。其中6个m6A调控因子在GBM显著上调。基于差异的m6A调控因子的表达进行一致性聚类,得到cluster1/2共2个亚型。且cluster2亚型中患者的免疫评分以及基质评分均显著高于cluster1,但cluster1的整体肿瘤纯度显著高于cluster2。生存分析发现,cluster2生存预后更差。cluster1和cluster2之间显著差异表达的基因共6591个,单因素cox回归和多因素cox回归筛选到171个显著预后相关基因。LASSO-cox回归构建预后风险模型显示在训练集(TCGA-GBM)及测试集(GSE121720)中均具有较好的模型效能。结论:多个m6A因子在GBM患者中存在显著差异,且基于m6A分型的2组患者存在预后不同,并基于m6A的组间差异构建了预后模型可指导患者的5年生存率。

胶质母细胞瘤中癌-睾丸抗原OY-TES-1的表达对M2型巨噬细胞极化的影响

目的探讨胶质母细胞瘤(GBM)中癌-睾丸抗原OY-TES-1的表达对M2型巨噬细胞极化的影响。方法体外培养人GBM细胞U251与人外周血单核细胞THP-1,构建稳定下调OY-TES-1的U251稳转株(U251-SH-OY-TES-1组),将转染无关序列的U251作为对照(U251-SH-NC组)。48h后取两组上清液与THP-1细胞共培养,加入U251-SH-NC组上清液的THP-1细胞为SH-NC组,加入U251-SH-OY-TES-1组上清液的THP-1细胞为SH-OY-TES-1组。通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法分别检测两组OY-TES-1mRNA和蛋白相对表达量,确定转染效率。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液中人白细胞介素-10(IL-10)、人转化生长因子-β(TGF-β)表达水平。通过流式细胞术检测CD206表达水平。结果RT-qPCR与蛋白免疫印迹法检测结果显示,U251-SH-OY-TES-1组OY-TES-1mRNA和蛋白的相对表达量低于U251-SH-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示,两组培养液中TGF-β、IL-10水平随培养时间的增加呈上升趋势。第0天、第2天SH-OY-TES-1组培养液中TGF-β水平显著低于SH-NC组(P<0.05),IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。第4天SH-OY-TES-1组培养液中TGF-β、IL-10水平显著低于SH-NC组(P<0.05)。流式细胞术结果显示,与SH-NC组比较,SH-OY-TES-1组CD206水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论GBM中OY-TES-1高表达能够促进M2型巨噬细胞的极化。

Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压致大鼠视网膜损伤中作用

目的观察Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压(AOH)大鼠视网膜中变化及其抑制对视网膜损伤的影响。方法建立大鼠AOH青光眼模型,分为正常对照(Ctrl)、AOH和AOH+玻璃体内注射胶质毒素α-氨基己二酸(AAA)后再灌注1、3和5d组,以及单纯AAA和AOH+PBS对照组。TUNEL染色检测细胞凋亡,GFAP免疫荧光染色反应Müller细胞反应性胶质化程度,Thy-1染色标记视网膜神经节细胞(RGCs)。结果 AOH可致大鼠视网膜内丛状层和内核层明显变薄、神经节细胞层内细胞排列紊乱和数量减少,并诱发Müller细胞反应性胶质化(GFAP表达增加)。同时,AAA抑制Müller细胞反应性胶质化可明显缓解AOH所致RGCs丢失和凋亡发生。结论 Müller细胞反应性胶质化参与AOH所致视网膜损伤,抑制其反应性胶质化可能是改善高眼压性青光眼视网膜病变的一种有效治疗方法。

Siglec-E影响小白菊内酯靶向MAPK/NF-κB通路抑制小胶质细胞M1极化

目的探讨唾液酸结合样凝集素E(sialic acid binding lectin E,Siglec-E)对小白菊内酯(parthenolide,PTL)抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠小胶质细胞(BV2)M1极化作用的影响。方法①从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)获取Siglece相关小鼠脑组织单细胞测序数据,分为野生型组(WT,n=3)和敲除型组(Siglece^(-/-),n=4)。从中筛选出小胶质细胞并分析相关差异基因及通路富集。通过shRNA干扰技术构建BV2细胞株模型,得到NC-shRNA BV2和Siglece-shRNA BV2细胞并检测Siglec-E(Siglece)表达水平。②将NC-shRNA和Siglece-shRNA细胞分别分为Control组、LPS组、PTL组和PTL+LPS组(n=3),采用RT-qPCR检测小胶质细胞M1极化标志物iNOS、IL-1β和IL-6的mRNA水平。将Siglece^(fl/fl)和Cx3cr1^(cre)小鼠交配,获得小胶质细胞特异性Siglec-E缺失(Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre))小鼠,并建立LPS诱导的神经炎症模型。③将出生4 d的各9只WT和Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre)雄鼠分成Control组、LPS组和PTL+LPS组(n=3)。采用RT-qPCR、免疫荧光技术和Western blot验证敲除效果以及极化相关通路,研究Siglec-E影响PTL抑制小胶质细胞M1极化的机制。结果与NC-shRNA组比较,Siglece-shRNA组中Siglec-E表达显著降低(P<0.01),说明SiglecE敲除细胞模型建立成功。在LPS刺激的条件下,与Control组比较,NC-shRNA细胞和Siglece-shRNA细胞的iNOS、IL-1β和IL-6的mRNA水平均显著上调(P<0.01)。PTL与LPS共同作用下,NC-shRNA细胞中上述M1极化的标志物均明显下降(P<0.05)。而对于Siglece-shRNA细胞,上述M1极化的标志物无显著下调。PTL对BV2细胞JNK、IκB蛋白的磷酸化具有抑制作用(P<0.01),也可抑制NF-κB核转位,而下调Siglec-E则会减弱该作用。与WT组小鼠比较,Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre)小鼠小胶质细胞Siglec-E表达显著降低(P<0.01),PTL对Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre)小鼠小胶质细胞NF-κB磷酸化水平的抑制作用也降低。结论小胶质细胞Siglec-E缺失会减弱PTL靶向MAPK/NF-κB通路对其M1极化的抑制作用。

miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/Akt信号通路对高糖诱导视网膜Müller细胞活化及凋亡的影响

目的检测微小RNA-26a-5p(microRNA-26a-5p,miR-26a-5p)对PTEN/PI3K/Akt信号通路及高糖刺激的视网膜Müller细胞凋亡的影响,探讨糖尿病视网膜神经损伤的潜在机制。方法采用不同浓度的葡萄糖刺激视网膜Müller细胞构建糖尿病视网膜神经损伤模型,采用CCK-8及流式细胞仪观察细胞增殖及凋亡情况,细胞转染过表达miR-26a-5p模拟物,Real-time PCR检测miR-26a-5p、PTEN、PI3K、Akt的表达情况,ELISA测定细胞上清液中IL-1β及IL-6的水平,采用Graphpad 8.0软件处理数据。结果高糖刺激视网膜Müller细胞生长活跃,与对照组相比,50 mmol/L高糖刺激Müller细胞活力在12 h、24 h时逐渐增加,48 h时活力减弱,细胞凋亡增加,组间差异有统计学意义(P<0.05)。高糖刺激后视网膜Müller细胞中miR-26a-5p水平下降,PTEN的表达显著升高,PI3K及Akt水平下降,IL-1β及IL-6的水平明显升高,过表达miR-26a-5p后,PTEN水平降低,PI3K/Akt及炎性因子降低,细胞凋亡减少(P<0.01)。结论miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/Akt的表达,影响炎症因子释放,减轻高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡。

M1表型的小胶质细胞外泌体对血脑屏障功能的影响

目的:研究M1表型的小胶质细胞外泌体(M1 microglia-derived exosome,M1-exo)对体外血脑屏障(blood-brain bar⁃rier,BBB)功能及血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达的影响。方法:用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠小胶质细胞来源的细胞系BV2细胞,流式技术检测其向M1型极化情况,分离提取外泌体。用小鼠脑微血管内皮细胞系b.End3细胞与原代培养的小鼠星形胶质细胞构建体外BBB模型,随机分为3组:b.End3细胞正常培养组(b.End3组)、b.End3细胞+25µg/mL正常BV2细胞来源外泌体(BV2-derived exosome,BV2-exo)组(b.End3+BV2-exo组)、b.End3细胞+25µg/mL M1表型的小胶质细胞来源外泌体组(b.End3+M1-exo组)。按实验分组将不同来源外泌体与BBB模型共培养,检测各组的跨膜电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)、荧光黄通过率,免疫印迹法(Western blot,WB)检测紧密连接复合物蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1及JAM蛋白的表达。结果:①小胶质细胞向M1型极化成功,其细胞标志物CD16/32阳性率较对照组明显升高(P=0.023);②与M1-exo共培养后,体外BBB模型的TEER明显下降(P=0.000),对荧光黄的透过率明显增加(P=0.000);③与b.End3组和b.End3+BV2-exo组相比,b.End3+M1-exo组的Claudin-1、Occludin及ZO-1蛋白的表达水平明显下降。结论:M1-exo可以破坏BBB的完整性,影响其功能。

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度降低,差异有统计学意义（P=0.02）;FK506组细胞上清中VEGF的质量浓度高于正常对照组,但差异无统计学意义（P=0.08）.4个组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白相对表达量的总体差异均有统计学意义（F=126.06,P=0.00;F=5.44,P=0.01）,其中高糖组大鼠细胞中VEGF mRNA及其蛋白相对表达量均明显高于正常对照组,而高糖＋FK506组细胞中VEGF mRNA及其蛋白相对表达量均明显低于高糖组,差异均有统计学意义（P＜0.01）,FK506组细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量分别为0.64±0.09和0.68±0.18,均低于正常对照组的0.84±0.07和0.75±0.03,但差异均无统计学意义（P=0.05、0.07）.结论 高糖条件下培养的Müller细胞中VEGF表达明显上调,FK506则可一定程度上抑制高糖培养的Müller细胞中VEGF的表达.

Müller细胞在常见眼底疾病中的研究进展

神经胶质细胞在维持中枢神经系统稳态方面发挥关键作用,Müller细胞作为视网膜中主要神经胶质细胞,在维持视网膜结构和功能正常方面有重要作用。Müller细胞的损伤会导致视网膜功能障碍。近年来许多研究表明视网膜功能是否正常很大程度上取决于Müller细胞。本文综述了近五年来Müller细胞在常见的眼底疾病中的作用及相关机制,以期深入了解Müller细胞在常见的眼底疾病中的影响与价值,为眼底疾病发病机制的研究、筛查、诊断、及预防提供新思路。

视网膜再生中调控Müller细胞重编程的表观遗传修饰和微环境因素研究进展

[背景]Müller细胞(Müller glia,MG)重编程是视网膜再生领域的研究热点.与斑马鱼(Danio rerio)不同,哺乳动物视网膜损伤后MG丧失再生视网膜能力,发生反应性胶质化产生胶质瘢痕,导致哺乳动物MG重编程再生视网膜能力丧失的分子机制仍存在许多不清楚之处.[进展]随着干细胞理论和研究方法的不断进步,越来越多研究利用单细胞测序等技术从转录、表观遗传修饰、细胞外微环境等多层次深入挖掘视网膜再生中MG重编程的调控机制,以期实现哺乳动物的视网膜再生.本文总结了不同物种中已发现的影响MG重编程能力差异的关键分子,着重关注表观遗传修饰和微环境因素.[展望]视网膜再生中MG重编程是受细胞内外多种因素协同调控的复杂过程.对斑马鱼和哺乳动物视网膜再生中MG重编程影响因素进行详细的对比分析,将有助于突破哺乳动物视网膜再生瓶颈,为开发有临床转化潜力的疗法提供新的途径.

癫痫活化Smad信号促进小胶质细胞M2型极化的作用

目的研究癫痫对小鼠脑组织海马中小胶质细胞M2型极化的影响和机制。方法40只C57小鼠随机分为对照组(CON组,12只)及癫痫组[戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)组,28只],CON组给予生理盐水,PTZ组给予PTZ,隔日腹腔注射,共28 d。诱导癫痫过程中,观察小鼠行为、癫痫发作级别、持续时间及结局,造模结束后取材,进行相应实验。HE染色及尼氏染色观察小鼠脑组织海马区细胞形态及存活情况,免疫组织化学染色观察小鼠脑组织海马区小胶质细胞形态变化,Western blot检测小鼠脑组织Iba-1、Bax、Bad、p-Bad、Cleaved caspase-3、Arg-1、CD163、CD206、M-CSF、GFAP、Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4蛋白表达。结果HE染色及尼氏染色显示,CON组细胞呈圆形,排列整齐;PTZ组小鼠脑组织海马区细胞深染、核固缩,形状不规则,排列紊乱。Western blot结果显示,PTZ组小鼠脑组织内Bax、Bad、p-Bad、Cleaved caspase-3、GFAP蛋白表达均增高(P均<0.05);小胶质细胞标记物Iba-1蛋白表达增高,M2型标记物Arg-1、CD163、M-CSF蛋白表达均增高(P均<0.05),CD206未见明显差异;Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4蛋白表达均增高(P均<0.05)。免疫组织化学结果显示,CON组海马区Iba-1阳性细胞形态表现为分枝状,且分枝清楚,而PTZ组海马区Iba-1阳性细胞形态为分枝状、去分枝状或阿米巴样。结论癫痫促进小鼠海马区细胞凋亡,导致脑损伤,升高Smads蛋白表达水平,促进小胶质细胞向M2极化。

Müller胶质细胞在视网膜神经损伤中的作用研究进展

Müller胶质细胞(Müller glial cells,MGCs)是视网膜中的主要神经胶质细胞,呈放射状横跨整个视网膜。MGCs与视网膜神经元紧密接触,相互作用,参与维持视网膜内稳态。在视网膜神经损伤后,MGCs启动多种调控途径应答视网膜内环境改变和损伤,产生视网膜神经保护作用,如:调节神经递质释放,释放神经保护因子及抗氧化因子,重编程进行内源性修复。但在视网膜持续损伤状态下,MGCs增生也能加重神经元功能障碍和丢失。因此,正确认识MGCs对病理刺激的反应及其产生的保护和损害作用,对于研究视网膜神经损伤性疾病的机制及指导疾病治疗具有重要意义。本文围绕MGCs在视网膜神经损伤及修复过程中的作用展开综述,旨在为视网膜神经保护提供新的策略。

罗格列酮对糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用以及对Müller细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及炎症因子表达的影响

目的通过建立糖尿病大鼠模型,研究罗格列酮对糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用以及对Müller细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及炎症因子表达的影响。方法取健康清洁级雄性SD大鼠36只,分为对照组、糖尿病组、罗格列酮治疗组,每组12只大鼠。糖尿病组及罗格列酮治疗组大鼠建立糖尿病模型;罗格列酮治疗组每天给予罗格列酮3 mg·kg^(-1)灌胃,糖尿病组和对照组每天给予等体积的生理盐水灌胃。12周后,对大鼠体质量、血糖进行评估。免疫荧光检测大鼠视网膜Müller细胞活化标志物GFAP的表达。利用Western blot对细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、GFAP的表达变化进行半定量分析。结果与对照组相比,糖尿病组及罗格列酮治疗组大鼠体质量明显降低,血糖明显升高(均为P<0.01)。与糖尿病组相比,罗格列酮治疗组大鼠体质量无明显变化(P>0.05),但血糖降低(P<0.01)。对照组、糖尿病组、罗格列酮治疗组GFAP免疫荧光表达量分别为82.68±2.65、225.88±5.59、158.89±6.22;与对照组相比,糖尿病组表达量明显增高(P<0.01);与糖尿病组相比,罗格列酮治疗组表达量明显降低(P<0.01)。对照组、糖尿病组、罗格列酮治疗组ICAM-1蛋白相对表达量分别为(5.91±0.13)%、(57.43±0.92)%、(55.56±1.23)%;与对照组相比,糖尿病组表达量明显增加(P<0.01);与糖尿病组相比,罗格列酮治疗组表达量明显减少(P<0.01)。对照组、糖尿病组、罗格列酮治疗组TNF-α蛋白相对表达量分别为(11.25±1.43)%、(67.36±1.79)%、(44.79±2.12)%;与对照组相比,糖尿病组表达明显增加(P<0.01);与糖尿病组相比,罗格列酮治疗组表达量明显减少(P<0.01)。对照组、糖尿病组、罗格列酮治疗组GFAP蛋白相对表达量分别为(17.79±0.74)%、(64.82±1.23)%、(46.15±2.05)%;与对照组相比,糖尿病组表达明显增加(P<0.01);与糖尿病组相比,罗格列酮治疗组表达量明显减少(P<0.01)。结论罗格列酮能降低糖尿病视网膜炎症反应,保护Müller细胞,对DR具有潜在的治疗作用。

CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的抑制作用

目的探讨CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的影响。方法雄性SD大鼠30只,随机分成对照组、糖尿病组、治疗组(CDK抑制剂SCH727965),每组各10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射55 mg·kg^-1链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法诱导糖尿病模型。模型诱导成功后,治疗组玻璃体内注射SCH727965 8μL(3 nmol·L^-1)。12周后,免疫荧光检测三组大鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,免疫组织化学检测视网膜色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)表达,Western blot检测GFAP、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PEDF蛋白相对表达量。结果与对照组GFAP (100.00±0.00)%、VEGF(100.00±0.00)%、PEDF(38.26±0.52)%、PCNA(9.34±0.47)%表达相比,糖尿病组GFAP(168.24±2.72)%、VEGF(156.79±1.75)%、PCNA(16.11±0.34)%表达均明显增加,PEDF(23.72±0.71)%表达明显降低(均为P<0.01);而与糖尿病组相比,治疗组GFAP(124.37±3.01)%、VEGF(118.36±1.98)%、PCNA(12.05±0.67)%表达均明显降低,PEDF(8.22±0.36)%表达明显增加(均为P<0.05)。结论 SCH727965可下调大鼠糖尿病状态下视网膜GFAP、VEGF、PCNA表达,上调PEDF表达,进而抑制Müller细胞增殖及新生血管形成。

神经胶质成熟因子-β诱导糖尿病大鼠视网膜Müller细胞炎症反应的机制研究

目的 研究神经胶质成熟因子-β(GMFB)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的作用及相关机制。方法SPF级雄性SD大鼠60只,采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55 mg/kg)制备糖尿病模型后分为STZ组、STZ+AAVGMFB组和STZ+AAV-GMFB+K252a组,每组15只。另取15只正常大鼠作为CON组。STZ+AAV-GMFB组和STZ+AAV-GMFB+K252a组大鼠于成模8周后玻璃体腔单次注射AAV-GMFB腺病毒载体5μL。STZ+AAV-GMFB+K252a组在注射腺病毒基础上给予腹腔注射25μg/(kg·d)的K252a。12周后,免疫荧光检测GMFB在Müller细胞中的表达,免疫组织化学染色检测视网膜胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,酶联免疫吸附试验检测视网膜炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6的表达,Western blot检测GMFB、脑源性神经营养因子(BDNF)及磷酸化酪氨酸激酶受体B(p-TrkB)蛋白相对表达水平。HE染色检测视网膜病理改变。结果 GMFB在Müller细胞中大量表达。与CON组比较,STZ组GMFB、GFAP表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加,BDNF、p-TrkB蛋白表达减少,视网膜神经节细胞(RGC)排列紊乱,数量减少;与STZ组比较,STZ+AAV-GMFB组GMFB、GFAP表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,BDNF、p-TrkB蛋白表达增加,RGC排列整齐,数量增加。TrkB抑制剂K252a能大部分逆转AAVGMFB的保护作用。结论 糖尿病大鼠视网膜GMFB表达增加,诱导了Müller细胞活化,加重了炎症反应,该作用与抑制BDNF/TrkB信号通路有关。

脂多糖对小鼠视网膜Müller细胞和小胶质细胞共培养体系中炎症因子水平的影响及其机制

目的:观察脂多糖(LPS)诱导小鼠视网膜单独培养Müller细胞和Müller细胞与小胶质细胞共培养2种体系中的炎症反应,阐明Müller细胞与小胶质细胞的相互作用机制。方法:培养Müller细胞QMMuC-1和小胶质细胞BV2,免疫荧光染色方法观察2种细胞形态表现。实验分为单独培养对照组[QMMuC-1细胞单独培养,采用磷酸盐(PBS)缓冲液处理]、共培养对照组(QMMuC-1细胞和BV2细胞共培养,细胞比例1∶1,采用PBS缓冲液处理)、单独培养实验组(QMMuC-1细胞单独培养,采用10 mg·L^(-1)LPS处理)和共培养实验组(QMMuC-1细胞和BV2细胞共培养,采用10 mg·L^(-1)LPS处理)。采用免疫荧光染色法观察各组细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组QMMuC-1细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达水平。结果:QMMuC-1细胞中神经胶质细胞标志物谷氨酰胺合成酶(GS)和GFAP阳性,BV2细胞中小胶质细胞标志物离子钙接头蛋白分子1(Iba-1)阳性。与单独培养对照组比较,单独培养实验组QMMuC-1细胞中GFAP水平升高1.7倍(P=0.005);与共培养对照组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中GFAP水平升高2倍(P=0.003),细胞形态逐渐变成梭形;与单独培养实验组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中GFAP水平升高1.4倍(P=0.0006),大部分细胞呈梭形。与单独培养对照组比较,单独培养实验组QMMuC-1细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与共培养对照组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高(P<0.05);与单独培养实验组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中IL-1β和TNF-αmRNA表达水平升高(P<0.05)。结论:LPS可能通过诱导小胶质细胞激活后释放炎症因子作用于Müller细胞,并加剧了Müller细胞的炎症反应。

糖尿病视网膜Mǖller细胞病理改变的体内外研究

目的研究糖尿病视网膜M櫣ller细胞的病理改变。方法用链脲菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,3个月后观察视网膜M櫣ller细胞超微结构的变化。行免疫组织化学染色,在激光共聚焦显微镜下观察视网膜M櫣ller细胞GFAP、VEGF表达的改变;纯化培养出生5～7d(SD)乳鼠的M櫣ller细胞,在其中加入糖基化终末产物(AGEs)2500μg/mL,培养24h后,用MTT方法检测细胞活性。结果3个月后电镜观察发现糖尿病鼠视网膜M櫣ller细胞突起有损伤表现,微血管内皮细胞、周细胞未见病理改变;正常鼠视网膜VEGF染色阴性,视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色;糖尿病鼠除视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色外,其余各层也可见丝条状贯穿于内外界膜之间的GFAP染色,在上述部位有VEGF及GFAP的共表达。培养24h后,2500μg/mL质量浓度的AGEs对M櫣ller细胞活性有显著促进作用。结论反应性胶质化增生可能是糖尿病早期M櫣ller细胞的主要病理改变,它所引起的M櫣ller细胞结构和功能改变应在糖尿病视网膜病变(DR)的发生发展中起重要作用。AGEs可能是DR中视网膜M櫣ller细胞反应性胶质化增生的重要致病因素。

改进的酶消化法培养新生大鼠Müller细胞

目的通过改进的酶消化法,简化Muller细胞的培养和纯化过程。方法采用将眼球培养前处理和机械吹打、贴壁后反复胰蛋白酶消化的方法培养新生大鼠Muller细胞,进行免疫组织化学染色和光电镜观察。结果培养的Muller细胞光镜下胞体较大,胞浆丰富,电镜下细胞器丰富,可见糖原和直径为10nm的微丝,免疫组织化学示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶阳性,神经胶质纤维酸性蛋白阴性。结论改进的酶消化法是一种简单可行的Muller细胞培养方法。

艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞VEGF表达的调控作用

目的:研究艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞(RMCs)增殖的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将培养的RMCs分为正常对照组、甘露醇对照组、模型组、罗格列酮阳性对照组及艳山姜挥发油高(1μg/L)、中(0.5μg/L)、低(0.25μg/L)浓度组。给药48 h后,MTT法检测艳山姜挥发油对高糖诱导RMCs增殖的影响,苏木素-伊红染色(HE)进行形态学观察,划痕修复实验及transwell实验分别分析RMCs迁移能力和侵袭能力。免疫印迹法(Western blot)分析血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:高糖作用后,RMCs增殖率、迁移及侵袭能力显著升高(P<0.01);VEGF蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,给予艳山姜挥发油及罗格列酮预保护能显著抑制RMCs的异常增殖(P<0.05),RMCs形态和数量趋近正常对照组,RMCs迁移和侵袭能力显著降低,同时显著下调了VEGF蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:艳山姜挥发油对高糖诱导下RMCs的增殖及VEGF蛋白的表达具有调控作用。