少突胶质细胞祖细胞高效分离培养及EGFP基因转染

目的:建立高效分离少突胶质细胞祖细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的方法,并转染增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因。方法:采用2次接种培养和差速振荡分离,结合使用神经营养因子(bFGF、PDGF-AA),体外分离纯化和扩增培养OPCs,用抗A2B5、GFAP、CNPase免疫荧光抗体鉴定细胞类型。采用脂质体介导EGFP基因转染OPCs,筛选获得稳定表达EGFP的OPCs细胞。结果:分离培养的OPCs细胞呈A2B5阳性,纯度达到99%,具有增殖和双向分化的潜能(GFAP阳性的2型星形胶质细胞和CNPase阳性的少突胶质细胞),传代培养1个月仍具有增殖能力。EGFP基因转染后OPCs细胞能发出绿色荧光,并继续保持增殖分化特性。结论:二次接种培养和差速振荡分离法可获得高纯度OPCs细胞;EGFP基因转染可作为示踪OPCs迁移的有效方法。

介导诱导性少突胶质细胞祖细胞生成的重编程因子的研究进展

少突胶质细胞(oligodendrocytes, OLs)是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中主要的成髓鞘细胞,其功能障碍会引发一系列的神经性疾病,例如:多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)和脑白质营养不良。少突胶质细胞祖细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)的移植是治疗髓鞘相关疾病的一种潜在方法。在脑损伤后, OPCs可向OLs方向分化并对损伤部位的轴突进行髓鞘化,但是, OPCs在大脑中仅占5%~8%,这种髓鞘修复作用十分有限。通过体外重编程技术生成诱导性少突胶质细胞祖细胞(induced oligodendrocyte precursor cells, iOPCs)的策略可为髓鞘损伤疾病的治疗提供大量的细胞资源。但是该方法仍存在一系列亟待解决的问题,包括i OPCs生成效率较低、体外培养周期较长等。因此,该文从限定性转录因子、miRNA以及小分子物质等方面阐述了iOPCs的生成方法,并分析了iOPCs的现存问题和应用前景,旨在为其在疾病模型构建、药物开发和再生医学等方面的应用提供理论和技术参考。

新生大鼠大脑皮层少突胶质细胞／Ⅱ型星形胶质祖细胞原代培养及形态

目的:研究不同诱导条件对大鼠大脑皮层O2A祖细胞生长活性的影响。方法:采用两次恒温摇床振荡培养法,倒置显微镜结合免疫荧光染色法鉴定细胞种类并判断纯度,透射电镜观察细胞超微结构。结果:O2A祖细胞胞体呈圆形,常有单极或双极突起.形成克隆球,A285标记阳性,免疫荧光鉴定细胞纯度可达90%以上。O2A祖细胞具有双向分化的能力,在不同诱导条件下可分化为星形胶质细胞或少突胶质细胞。电镜观察O2A祖细胞呈圆形或椭圆形,核仁可见,胞质内细胞器少,核周见成束胞质丝。结论:选择合适的培养基对O2A祖细胞纯化培养及诱导分化极其重要。

少突胶质细胞祖细胞在神经退行性疾病发病机制中的作用研究进展

少突胶质细胞祖细胞(OPCs)分布于整个中枢神经系统,可增殖、迁移、分化为少突胶质细胞(OLs)。OLs的核心功能是产生髓磷脂,形成髓鞘包裹轴突,提高神经传导速率。近年来研究显示,在多发性硬化、阿尔茨海默病等神经退行性疾病的病灶处存在大量OPCs,其在中枢神经系统损伤修复过程中具有重要作用,髓鞘再生受阻的主要原因就是OPCs未能分化为成熟的OLs或者形成的OLs无法发挥正常功能。笔者现围绕OPCs的生理功能及其在多发性硬化、阿尔茨海默病等神经退行性疾病发病机制中的作用进行综述,以期为神经退行性疾病的研究和治疗提供新的思路及方向。

成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成迁移路至损伤部位(二)来自背外侧脑室下区的祖细胞形成迁移路经胼胝体至损伤部位

近年来很多实验证明各种脑损伤和中枢神经疾病都能促进神经干细胞或祖细胞向非嗅球区域迁移,本研究将成年大鼠一侧大脑皮层血管去除,用免疫组化方法标记前脑室下区正在分裂的细胞、神经元祖细胞和胶质细胞祖细胞。结果证明:损伤侧及对侧的背外侧脑室下区各类祖细胞明显增多并向胼胝体迁移,在胼胝体内它们分别形成迁移路至损伤部位;迁移路内的各种祖细胞具有典型的不成熟的迁移细胞特点,胞体细长,一般首尾各有一突起,其引导突皆朝向损伤区。本研究结果提示去皮层血管增殖的前脑室下区神经元祖细胞和胶质细胞祖细胞通过放射状迁移路至损伤部位可能参与修复机制。

成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成迁移路至损伤部位(一)祖细胞增殖迁移的部位在背外侧脑室下区

成年哺乳动物脑室下区(SVZ)富有神经干细胞、神经细胞祖细胞和胶质细胞祖细胞,它们能生成新的神经细胞、星状胶质细胞和少突胶质细胞。SVZ中的神经细胞祖细胞能形成切线形式的嘴侧迁移流(RMS)到嗅球,在嗅球分化成成熟的中间神经元。近年来证明成年动物实验性脑损伤和变性疾病都能引起SVZ细胞增生并能向非嗅球区迁移。本研究将成年大鼠一侧大脑皮层血管去除,15d和30d后取前脑作冠状及矢状连续切片,用BrdU和PCNA抗体显示前脑室下区正在分裂的细胞;用Tuj1抗体显示神经元祖细胞;用GFAP和vimentin抗体显示胶质细胞祖细胞。结果证明去除一侧皮层血管引起术侧及其对侧的背外侧脑室下区(dl-SVZ)的上述免疫反应阳性细胞明显增多,并向胼胝体迁移,在胼胝体内形成放射形式迁移路至损伤部位。本研究表明背外侧脑室下区的范围应包括背外侧角、外侧伸展和侧脑室上壁的SVZ,它们是切线形式和放射形式两种不同方向的迁移路祖细胞的共同源地。

p-PDGFRα在小鼠黑质纹状体损伤周边的经时表达和定位

目的探讨血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)在小鼠黑质纹状体损伤周边的经时表达和定位。方法取8周龄BALB/c小鼠,按文献制备小鼠黑质纹状体通路损伤模型,分别于术后第1、4、7、14 d取损伤脑组织(延及损伤部位前后2 mm)进行检测。应用免疫组织化学染色和Western blot检测p-PDGFRα蛋白的经时表达;采用免疫荧光双重染色检测p-PDGFRα的定位表达。结果免疫组化和Western blot检测均显示,损伤后4 d p-PDGFRα表达至高峰水平,免疫荧光双重染色结果显示其表达在星形胶质细胞,小胶质细胞,少突胶质细胞祖细胞和粒细胞上。结论脑损伤可以使PDGFRα活化并表达于损伤周围,活化的PDGFRα可能与星形胶质细胞,小胶质细胞,少突胶质细胞祖细胞和粒细胞的增殖有关。