鱼藤酮激活AMPK-ULK1信号通路诱导大鼠胸主动脉内皮细胞自噬

目的探讨鱼藤酮对大鼠胸主动脉内皮细胞(RTAEC)自噬的影响及其初步机制。方法选用60只雄性SD大鼠,随机分为对照(Con)组、二甲基亚砜(DMSO)组和鱼藤酮组[1、2、4 mg·(kg·d)^(-1)],各组分别干预28 d。实验前后分别记录大鼠体质量、血压和心率;HE染色观察胸主动脉和心脏组织病理生理改变,透射电镜观察其超微结构及自噬小体发生。细胞实验分组:Con组、DMSO组和鱼藤酮组(20、100和500 nmol·L^(-1)),分别处理24 h,用活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)水平筛选鱼藤酮干预最佳浓度后,选取500 nmol·L^(-1)进行后续干预。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(CC)在鱼藤酮处理前2 h干预细胞;RT-qPCR和Western blot检测胸主动脉自噬相关因子及腺苷酸激活的蛋白激酶-UNC-51样激酶1(AMPK-ULK1)通路的改变。结果与DMSO组相比,鱼藤酮组体质量增长量减少(P均<0.01);鱼藤酮对大鼠的血压和心率没有影响(P均>0.05);HE结果显示,鱼藤酮组胸主动脉内皮细胞伴有缺损,且心脏组织纤维排列紊乱、断裂;透射电镜结果发现,鱼藤酮组胸主动脉和心脏组织伴有结构异常及自噬小体出现;随着RTAEC鱼藤酮干预浓度增大,ROS产生水平增加(P<0.01),而ATP的生成减少(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与DMSO组相比,LC3和P62的mRNA表达水平均上调(P均<0.01);信号通路相关因子AMPK和ULK1的mRNA表达水平均增加(P均<0.01);加入AMPK抑制剂CC,Western blot检测自噬相关蛋白,与500 nmol·L^(-1)组相比,LC3表达降低(P<0.01),P62表达上调(P<0.01);AMPK和p-AMPK表达减少(P均<0.01),AMPK的下游因子ULK1及p-ULK1表达均减少(P均<0.01)。结论鱼藤酮可促进RTAEC发生自噬,而其自噬机制可能是通过AMPK-ULK1信号通路介导。

胰高血糖素样肽-1对高糖诱导的兔胸主动脉内皮细胞凋亡与增殖的影响

目的探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对高糖下兔胸主动脉内皮细胞凋亡与增殖变化的影响。方法取兔胸主动脉,用酶消化法分离内皮细胞,传代后于不同实验条件下培养,用TUNEL法测定各组胸主动脉内皮细胞凋亡,用MTT法与BRDU法测定各组胸主动脉内皮细胞的活力与增殖。结果与对照组相比,高糖作用下兔胸主动脉凋亡明显增多,而内皮细胞的活力下降、增殖减少(P<0.01),而用GLP-1预处理后,高糖抑制胸主动脉内皮细胞增殖与活力以及促进凋亡的作用明显减弱(P<0.05,与高糖组相比)。GLP-1的作用可以为GLP-1的受体抑制剂(exendin 9-39)所抵消,与高糖组相比,exendin9-39组的胸主动脉内皮细胞凋亡与细胞活力、增殖无明显变化(P>0.05)。结论胰高血糖素样肽GLP-1对高糖损害血管内皮细胞具有保护作用,其机制可能与其通过GLP-1受体途径促其增殖与抑制凋亡有关。

机械刮取法体外培养牛胸主动脉内皮细胞

目的:探讨牛胸主动脉内皮细胞(CTAECs)的原代培养方法,提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率,为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法:无菌手术刀片在牛胸主动脉内膜刮取内皮细胞,"力度梯度标记法"探索刮取力度,细胞收集于含20%南美胎牛血清的培养基中培养,对培养细胞进行Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定。结果:机械刮取法体外培养可以获得大量CTAECs,在倒置显微镜下呈多角形或短梭形,细胞核清晰,呈卵圆形,单层细胞融合后呈铺路石子样排列。细胞生长状态良好,抗Ⅷ因子相关抗原染色呈阳性。结论:机械刮取法是获得CTAECs的一种可取方法,成功率高,可靠性大,可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

2型糖尿病大鼠辛伐他汀灌胃治疗后胸主动脉壁细胞凋亡情况及细胞凋亡相关基因、活性氧簇表达观察

目的观察2型糖尿病(T2DM)大鼠辛伐他汀灌胃治疗后胸主动脉壁细胞凋亡情况及细胞凋亡相关基因、活性氧簇(ROS)表达情况。方法随机选取40只大鼠,予高脂饲料喂养,8周后采用尾静脉注射STZ(30mg/kg)诱导方法制备T2DM模型;将最终造模成功的34只大鼠按体质量、血糖分层随机分为辛伐他汀组、模型组各17只。另选取20只大鼠作为正常对照组,给予标准饲料喂养。根据人鼠等效剂量,辛伐他汀组每日以1. 05mg/(kg·d)辛伐他汀溶液灌胃1次,模型组和正常对照组每日以等量无菌饮用水灌胃1次,灌胃16周,后处死取大鼠胸主动脉。电镜下观察胸主动脉内皮细胞病理变化;实时荧光定量PCR方法检测胸主动脉内皮细胞细胞凋亡活化因子-1(Apaf-1)、细胞凋亡诱导因子(AIF)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2、Bax mRNA,酶联免疫吸附法检测ROS。结果电镜下可见,正常对照组内皮细胞细胞核清晰,形态完整,有条索样连接紧密、连续;模型组内皮细胞可见明显细胞核固缩、线粒体肿胀,及内皮细胞碎片;辛伐他汀组较模型组病理损伤较轻,内皮细胞相对连续,完整,有轻度肿胀。PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达升高,Bcl-2 mRNA表达降低(P均<0. 05);与模型组比较,辛伐他汀组模型组Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达降低,Bcl-2 mRNA表达升高(P均<0. 05)。结论 T2DM大鼠辛伐他汀灌胃治疗后,可明显减轻内皮细胞核固缩,线粒体肿胀,机制可能为下调Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达,上调Bcl-2 mRNA表达。

血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体和缬沙坦对大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖与迁移的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体(AT1-AA)和缬沙坦(Val)对大鼠胸主动脉平滑肌A7r5细胞增殖和迁移的影响。方法采用细胞增殖检测试剂盒-8(CCK-8),以不含药培养基为对照组,检测不同浓度(5、10、20 mg/L)AT1-AA作用不同时间(3、6、12、24 h)后的A7r5细胞存活率,以及不同浓度(0.1、1、10μmol/L)Val预处理不同时间(0.5、1、2、4 h)后经20 mg/L AT1-AA诱导12 h的A7r5细胞存活率;采用划痕试验法检测不同浓度(5、10、20 mg/L)AT1-AA作用不同时间(3、6、12、24 h)后的A7r5细胞迁移距离,以及不同浓度(0.1、1、10μmol/L)Val预处理不同时间(0.5、1、2、4 h)后经10 mg/L AT1-AA诱导24 h的A7r5细胞迁移距离。结果随着AT1-AA浓度升高,A7r5细胞存活率逐渐升高,随着作用时间延长,细胞存活率先升高后下降,20 mg/L AT1-AA作用12 h的细胞存活率最高(1.43±0.07);不同浓度Val预处理A7r5细胞0.5 h后20 mg/L AT1-AA作用12 h,10μmol/L Val组细胞存活率最低(0.88±0.02);预处理4 h后,0.1μmol/L Val组细胞存活率最低(0.82±0.21)。随着AT1-AA作用时间延长,A7r5细胞迁移距离逐渐增加;作用时间相同,随着AT1-AA浓度升高,细胞迁移距离先增加后减少;10 mg/L AT1-AA作用24 h时细胞迁移距离最远〔(255.14±9.51)μm〕;不同浓度Val预处理A7r5细胞后10 mg/L AT1-AA作用24 h,0.1μmol/L Val预处理2、4 h(μm:10.05±0.93、9.38±0.96)和10μmol/L Val预处理0.5、1 h(μm:14.57±3.01、16.35±1.20)后A7r5细胞迁移距离明显低于其他预处理组。结论AT1-AA能促进A7r5的增殖和迁移,而Val能抑制AT1-AA诱导的A7r5的增殖和迁移。

替米沙坦和血管紧张素Ⅱ调节胸主动脉血管紧张素转化酶2的表达

目的探讨替米沙坦和血管紧张素Ⅱ对乳鼠胸主动脉平滑肌血管紧张素转化酶2表达的影响。方法应用蛋白免疫印迹法检测血管紧张素转化酶2蛋白的表达,以逆转录聚合酶链反应法检测血管紧张素转化酶2mRNA表达。结果在10-8～10-5mol/L浓度范围内,替米沙坦呈浓度依赖性上调血管紧张素转化酶2蛋白的表达,在0～24h时间内,10-6mol/L替米沙坦呈时间依赖性促进血管紧张素转化酶2的蛋白表达,并促进血管紧张素转化酶2mRNA的表达;在10-8～10-5mol/L浓度范围内,血管紧张素Ⅱ呈浓度依赖性下调血管紧张素转化酶2蛋白的表达;10-6mol/L替米沙坦能明显地拮抗10-6mol/L血管紧张素Ⅱ对血管紧张素转化酶2蛋白和mRNA表达的抑制作用。结论替米沙坦能促进胸主动脉平滑肌血管紧张素转化酶2蛋白和mRNA的表达,并能明显拮抗血管紧张素Ⅱ对血管紧张素转化酶2蛋白和mRNA表达的抑制作用。

热休克蛋白27在人胸主动脉夹层的表达研究

目的:探讨热休克蛋白(heats hock protein,HSP)27在胸主动脉夹层(thoracic aortic dissection,TAD)中的表达情况,并初步了解其在TAD中的可能作用。方法:组织化学染色检测TAD病理特征,免疫组织化学染色检测HSP27在动脉壁中的表达和定位,Western Blot验证其表达,并分析HSP27表达与TAD患者临床病理参数如直径、高血压和炎症反应等的关系。结果:Western blot和免疫组化染色均显示HSP27在两组标本中均有表达,TAD组表达较正常组减低。HSP27蛋白主要位于中膜和外膜小血管和炎性细胞的胞质。相邻切片α肌动蛋白表达分布与HSP27基本一致。HSP27表达与其直径、患者高血压、急慢性病程和年龄等参数无明显相关性,这可能与例数较少有关。结论:HSP27蛋白在TAD中表达减少,中膜平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)是其主要细胞来源;HSP27可能通过调节肌动蛋白和SMC的功能等机制在TAD发挥作用,需进一步研究证实。

番茄红素对牛胸主动脉平滑肌细胞增殖的作用及作用机制(英文)

目的:研究番茄红素对牛胸主动脉平滑肌细胞增殖的作用及作用机制。方法:采用组织块法体外培养牛胸主动脉平滑肌细胞,以含10%小牛血清的培养基制备牛胸主动脉平滑肌细胞增殖模型。细胞分为正常组、阴性对照组、模型组及1、0.1和0.01μmol·L-1三个不同浓度的番茄红素实验组。实验采用MTT法测定牛胸主动脉平滑肌细胞的增殖活性,采用流式细胞术测定细胞周期分布,并测定了细胞内的SOD活性和MDA含量。结果:番茄红素在三个实验浓度下都能显著抑制血管平滑肌细胞的增殖。一方面,番茄红素抑制了G1期细胞进入S期;另一方面,番茄红素在1和0.1μmol·L-1的浓度下,能明显增强细胞中的SOD活性,同时,在三个给药浓度下,细胞内的MDA含量都显著降低。这些作用都具有浓度依赖性,并且与模型组比较均有统计学差异。结论:番茄红素对牛胸主动脉平滑肌细胞的增殖有抑制作用,并且这种抑制作用可能与它能够抑制细胞进程和它的强抗氧化性能够抑制细胞中的脂质过氧化和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的形成有关。它有望成为防治动脉粥样硬化的一种新的药物。

丹红注射液对H_2O_2氧化导致牛胸主动脉内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究丹红注射液对H_2O_2氧化导致牛胸主动脉内皮细胞损伤的保护作用。方法:体外培养牛胸主动脉内皮细胞,建立H_2O_2氧化损伤模型,给予丹红注射液治疗后,动态观察细胞的生长状态、形态变化和死亡情况,检查细胞存活率,以MTT染色法测定活性细胞吸光度值。结果:牛胸主动脉内皮细胞被H_2O_2氧化损伤后,随损伤程度出现不同变化,细胞边缘变圆、皱缩、无光泽,甚至死亡;活性细胞吸光度值明显下降,丹红注射液治疗后,细胞形态逐渐恢复正常,存活率明显上升。结论:丹红注射液对H_2O_2氧化导致的牛胸主动脉内皮细胞损伤具有显著的保护作用。

H3K9me3参与调节高糖诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖

目的:研究H3K9me3在高糖诱导大鼠胸主动脉平滑肌A7r5细胞增殖中的作用,并初步探讨其可能的作用机制。方法:应用MTT法检测高糖刺激下不同浓度的H3K9甲基转移酶SUV39H1特异性抑制剂Chaetocin(0、10、25、50、75、100 nmol/L)和50nmol/L H3K9甲基转移酶SUV39H1特异性抑制剂Chaetocin在不同时间点(24、48、72 h和5 d)对细胞增殖的影响。应用Western bolt法观察50 nmol/L H3K9甲基转移酶SUV39H1特异性抑制剂Chaetocin在高糖浓度下干预A7r5细胞72 h后,对H3K9me3和p53表达的影响。结果:Chaetocin可显著抑制高糖诱导下A7r5细胞的增殖,且抑制作用呈浓度和时间依赖性。与正常糖相比,Chaetocin可显著下调A7r5细胞在高糖诱导下表达增多的H3K9me3,同时显著上调在高糖诱导下表达减少的p53(P<0.05)。结论:高糖可通过H3K9me3下调p53的表达促进大鼠胸主动脉平滑肌A7r5细胞的增殖,H3K9甲基转移酶SUV39H1特异性抑制剂Chaetocin可抑制上述过程,为减少糖尿病大血管并发症提供了治疗的新思路。

胸主动脉旁嗜铬细胞瘤切除术麻醉1例

患者,女,52岁,因阵发性头痛、胸闷8年,加重3个月人院。患者于8年前出现阵发性头痛、胸闷、面色和双手苍白,伴心慌、出汗、唇色发紫,一般于劳累和激动后发病。1年前因1次乏力、胸闷测血压为96/60mm:Hg(1 kPa=7.5 mm Hg)。近3个月头痛、胸闷症状发作较频繁,可达每天3～4次,伴手抖、双手发麻。发作时血压最高240/160 mm Hg,有时夜间侧卧位睡眠时以及特殊姿势如弯腰后也出现上述症状。入院查体:血压120/70 mm Hg(双上肢),身高155 cm,体重53kg。24 h血压监测:收缩压、舒张压夜间下降分别为7.8％、

泰山赤灵芝多糖缓解大鼠动脉粥样硬化的分子机制研究

目的:研究泰山赤灵芝多糖处理动脉粥样硬化大鼠前后血脂的变化和胸主动脉细胞差异表达的基因,了解泰山赤灵芝多糖治疗动脉粥样硬化的分子机制。方法:全自动生化分析仪测定泰山赤灵芝多糖处理动脉粥样硬化大鼠前后血清TG、TC、HDL-C含量的变化;通过差异显示逆转录PCR(DDRT-PCR)技术研究泰山赤灵芝多糖处理动脉粥样硬化大鼠前后胸主动脉细胞的基因表达差异,并用反向Northern证实差异显示基因片段。结果:泰山赤灵芝多糖处理动脉粥样硬化大鼠后,TG、TC含量均明显下降,而HDL-C和HDL-C/TC百分比明显升高;胸主动脉细胞出现一些表达上调和下调的基因片段。上调基因有细胞色素B561、ERP72、nitric oxide synthase 2和Gpx1;下调基因有胸腺素β4、FGFRI原癌基因伴随蛋白、FK506结合蛋白、ICAM-1、c-myc和TNF-α。结论:泰山赤灵芝多糖可减轻动脉粥样硬化风险,降低血脂。

ATG5介导内皮细胞外泌体调控平滑肌细胞增殖

目的探究ATG5介导人脐静脉内皮细胞外泌体对小鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法利用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注消化法获得原代人脐静脉内皮细胞;利用组织块贴壁法分离原代小鼠胸主动脉平滑肌细胞;利用超速离心法提取内皮细胞外泌体;利用共聚焦高内涵成像分析仪示踪平滑肌细胞摄取内皮细胞外泌体;利用siRNA干扰内皮细胞ATG5蛋白表达;利用高内涵DPC成像模式分析平滑肌细胞增殖能力。结果成功得到活性好、纯度高的人脐静脉内皮细胞和小鼠胸主动脉平滑肌细胞。超速离心法获得的内皮细胞外泌体经免疫印迹鉴定,呈Hsp70、TSG101、CD9和CD63阳性。高内涵示踪结果显示平滑肌细胞在共培养30 min后开始摄取内皮细胞外泌体,共培养4 h后,平滑肌细胞摄取的外泌体明显增多。高内涵监测结果显示,与对照组比较,ATG5干扰组内皮细胞分泌的外泌体在浓度为200μg/ml时能够明显抑制平滑肌细胞的增殖。结论ATG5可通过介导内皮细胞外泌体调控平滑肌细胞增殖。

大蒜提取物对血管平滑肌细胞增殖的影响

大蒜具有广泛的食用和药用价值,其中的多种化学成分已被证实具有心血管保护作用。但其机制并未完全阐述清楚。本研究用CCK8法检测大蒜提取物对血管紧张素II诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增值的影响。结果发现,大蒜提取物可显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增值。表明大蒜提取物具备通过抑制血管重构而降血压的潜力。

黄芪注射液对体外血管新生的影响

背景:血管新生受生长因子的影响,黄芪可与血管内皮生长因子具有协同促血管新生的功效,但机制尚不明确。目的:通过与单一血管内皮生长因子干预比较,观察中药黄芪对体外血管新生的作用机制。方法:将黄芪注射液及血管内皮生长因子作用于SD大鼠胸主动脉内皮细胞,应用细胞增殖、细胞迁移、小管形成实验观察黄芪注射液对体外血管新生的促进作用,用Western blot实验检测血管内皮生长因子的表达。结果与结论:黄芪能明显促进大鼠胸主动脉内皮细胞的增殖(P<0.01),迁移的细胞数增加(P<0.01),胸主动脉内皮细胞的小管形成数增加(P<0.01),并明显促进内皮细胞血管内皮生长因子的表达(P<0.01)。说明黄芪能明显促进内皮细胞增殖、细胞迁移、小管形成,具有显著的促进体外血管新生作用,其机制可能是通过增加血管内皮生长因子的表达而实现的。

线粒体生物合成的改变对高糖诱导的活性氧类生成的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)对血管内皮细胞内线粒体生物合成的影响,明确线粒体的生物合成对葡萄糖诱导的活性氧类(ROS)生成的影响。方法将原代培养的人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)及小牛主动脉内皮细胞(BAECs)分成四大组,并分别将四组细胞模拟人体正常糖及高糖环境,浓度为5、30 mmol/L进行培养,测量细胞内ROS浓度。结果对BAECs和HUVECs分别进行协方差分析结果显示,在两种细胞中,不同组别之间差异均有统计学意义(P<0.01),不同糖水平对ROS浓度有影响(P<0.05);对BAECs单独进行分析发现,PGC-1α抑制表达组的ROS浓度在正常糖水平下显著低于对照组及空质粒组(P<0.01),高糖水平下也低于对照组及空质粒组(P<0.05);PGC-1α过度表达组的ROS浓度正常糖水平显著高于对照组(P<0.01),与空质粒组相比差异无统计学意义(P>0.05);对HUVECs分析发现,PGC-1α抑制表达组ROS浓度在正常糖水平和高糖水平下均低于空病毒Ad组和对照组(P<0.01);PGC-1αsiRNA转染组的ROS浓度正常糖水平显著高于对照组(P<0.01),与空质粒组差异无统计学意义(P>0.05)。结论高糖组较正常糖组血管内皮细胞产生更多ROS,过度表达PGC-1α后,细胞内ROS浓度显著降低;反之,ROS浓度显著升高。

丹酚酸B激活自噬改善高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的机制研究

目的:探讨丹酚酸B(Salvianolic acid B,SAB)改善高磷诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化的作用及机制。方法:采用大鼠血管平滑肌细胞(A7r5)钙化体外模型,用细胞增殖与活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测SAB对细胞活力的影响;2.6μmol·g^(-1)高磷诱导VSMCs钙化,加入丹参多酚酸类化合物丹酚酸B、丹酚酸C(Salvianolic acid C,SAC)、迷迭香酸(Rosmarinic acid,RA)及细胞自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA,5 nmol·g^(-1)),采用邻甲酚酞络合铜法及茜素红S染色检测细胞钙化程度;Western blot检测VSMCs钙化指标Runx2、OPN,自噬相关蛋白Beclin-1和LC3II/LC3I以及平滑肌收缩表型蛋白Calponin、SM22α的表达。结果:(1)钙离子浓度定量实验及茜素红染色实验显示SAB显著减轻高磷诱导的VSMCs钙化;(2)SAB浓度小于100 nmol·g^(-1)以下时对VSMCs生存活力无明显影响,选择3,10,30 nmol·g^(-1)剂量进行后续实验;Western blot显示SAB明显降低VSMCs成骨样分化的分子标志物Runx2、OPN蛋白表达(P<0.05),上调自噬标志物Beclin-1、LC3-I/II及VSMCs收缩表型标志物Calponin、SM22蛋白表达(P<0.05)。(3)SAB减轻高磷诱导VSMCs钙化的作用被自噬抑制剂3-MA阻断。结论:SAB可通过激活自噬抑制VSMCs钙化及向成骨样表型转化。