大肠杆菌胸腺嘧啶合成酶thyA缺失突变菌株的构建

大肠杆菌K 1 2DY330菌株的染色体上整合有一种新型的同源重组系统———缺陷型λ原噬菌体同源重组系统。以DY330为出发菌 ,通过同源重组构建大肠杆菌thyA- 株DY330 TI,其基因组特点是 :thyA基因除保留N端的1～ 4 9氨基酸残基相对应的必需核苷酸序列外 ,将其余部分全部缺失 ;此外 ,还敲除了DY330 TI中与缺陷型λ原噬菌体同源重组功能相关的基因 ,从而尽可能避免了通过同源重组产生回复突变的可能性。通过大肠杆菌thyA基因对该突变株的转化实验 ,检测转化子的回复突变率 ,进一步证实该突变株的突变性状稳定 ,为构建以thyA为选择标志的大肠杆菌染色体

食管及贲门癌变患者亚甲基四氢叶酸还原酶、胸腺嘧啶合成酶基因多态性分析

目的：探讨血清叶酸代谢关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）与胸腺嘧啶合成酶（TS）基因多态性与食管及贲门癌易感性的关系。方法：选取安阳地区病理证实的275例食管鳞癌（SCC）及129例贲门腺癌（GCA）患者和315例年龄性别与其匹配的正常对照人群，采用PCR基础上的限制性片段多态检测法（PCR—RFLP）对其NTHFR和TS各基因型进行分析。结果：①对照组MTHFR677CC、CT及TT基因型的分布频率分别为24％、45％和31％；SCC组分别为19％、38％和43％；GCA组分别为19％、35％和46％。对照组TSER3R／3R（4R）、2R／3R及2R／2R基因型的分布频率分别为64％、34％和2％；SCC组分别为62％、35％和4％；在GCA组，分别为63％、30％以及7％。②与MTHFR677CC及MTHFR677CT两基因型相比，TT携带者患SCC的危险度升高1．62倍（OR=1．62，95％可信区间（CI）为1．15～2．30，P=0．006），而GCAOR=1．8l（95％CI为1．17—2．81，P=0．008）。③与其他基因型相比，纯合突变型（TSER2R／2R）患SCC的危险度升高2．44倍（OR=2．44，95％CI为0．89～6．73，P=0．084），患GCA的危险度升高3．94倍（OR=3．94，95％CI为1．29～12．0，P=0．016）。④相对于无基因突变者，仅有MTHFR677TT者患SCC的危险度升高1．60倍（95％CI为1．13—2．28），患GCA的危险度升高1．84倍（95％CI为1．17～2．88），仅有TSER2R／2R者患SCC的危险度升高1．89倍（95％CI为0．62—5．79），差异无统计学意义，但患GCA的危险度升高3．56倍（95％CI为1．03～12．3），双突变型组合（MTHFR677TT和TSER2R／2R）携带者在SCC组中占1．5％，在GCA组中占3．1％，在对照组中未检测到。结论：突变型MTHFR677TT及TSER2R／2R增加安阳地区人群SCC与GCA的易感性，当二者共同存在时，肿瘤的易感性更高。MTHFR与TS基因多态的存在可能是SCC与GCA地理分布一致性的遗传学基础之一。

冠心病患者胸腺苷合成酶多态性的探讨

目的研究胸腺苷合成酶(TS)5’-非翻译区(UTR)28bp串联重复序列多态性、3-’UTR1494bp位6bp插入或缺失多态性与血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平及冠心病之间的关系。方法用多聚酶链式反应(PCR)方法检测122例冠心病患者(冠状动脉造影显示至少有一支血管狭窄≥50%)与56例对照组(冠状动脉造影未发现任何可辨认斑块或狭窄)的TS 5-’UTR 28bp串联重复序列多态性;用聚合酶链反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)分析3-’UTR1494bp位6bp插入或缺失多态性;用荧光衍生后高压液相色谱分离法检测血浆总Hcy水平。结果(1)冠心病组的血浆Hcy水平(12.99±4.76)μmol/L高于对照组(10.95±4.75)μmol/L(P=0.009)。(2)TS5-’UTR 28bp串联重复序列有三种基因型(3R/3R,3R/2R,2R/2R),这三种基因型频率在冠心病组和对照组之间的分布有差异(P=0.029);TS28各基因型个体的Hcy水平在冠心病组高于对照组(P=0.03)。3R/3R、3R/2R基因型个体的Hcy水平均高于2R/2R型个体(分别为P<0.001和P=0.011),但3R/3R基因型个体与3R/2R基因型个体的Hcy水平间的差异没有统计学意义(P=0.979)。(3)TS3-’UTR6bp插入或缺失多态性有三种基因型(+6bp/+6bp,+6bp/-6bp,-6bp/-6bp),这三种基因型频率在冠心病组和对照组之间的分布差异无显著性(P>0.05)。TS6各基因型个体的Hcy水平在冠心病组高于对照组(P=0.006)。冠心病组TS6 bp各基因型个体间Hcy水平的的差异均没有统计学意义(P均>0.05)。结论(1)高Hcy血症与冠心病有关系。(2)TS基因5-’UTR28bp串联重复序列多态性可能是冠心病发病中的一个遗传因素。3 R与冠心病组个体的Hcy水平有关系。

胃癌组织中胸腺嘧啶合成酶和双氢嘧啶脱氢酶的表达及临床意义

目的了解胸腺嘧啶合成酶(TS)和双氢嘧啶脱氢酶(DPD)mRNA在胃癌组织及癌旁非肿瘤组织中的表达情况以及与临床病理学特征的关系。方法采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定50例胃癌患者TS、DPD mRNA在胃癌及癌旁非肿瘤组织的表达。结果胃癌组织中TS mRNA水平明显高于非肿瘤组织中的水平(P=0.001),DPD mRNA水平略高于非肿瘤组织但无明显差异(P=0.107)。肿瘤和非肿瘤组织中TS mRNA水平(P=0.382)、DPD mRNA水平之间(P=0.227)以及肿瘤组织中TS和DPD mRNA水平(P=0.412)、非肿瘤组织TS和DPD mRNA水平之间(P=0.412)无显著相关性。对比临床病理学特征与TS mRNA水平,Ⅲb期与Ⅳ期的水平无明显的差异(P=0.106),但却高于Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲb期水平(P=0.045);在分化程度上未分化型中TS mRNA水平要高于已分化的细胞类型(P=0.017),而DPD mRNA与临床病理学特征无显著相关性。结论胃癌组织中TS mRNA的水平高于非肿瘤组织中的水平;TS mRNA水平与临床分期有关,Ⅲb期水平高于Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ期的水平,而与Ⅵ期水平无明显差异;同时TS mRNA水平与肿瘤细胞的组织学类型有关。

对虾白斑综合征病毒胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因的系统进化分析

目的为了对对虾白斑综合征病毒 (whitespotsyndromevirus,WSSV)中最为保守的胸腺嘧啶核苷酸合成酶 (WSV TS)基因 ,进行该病毒的系统发育学研究。方法通过GenBankTM 数据库和DNAMAN分析系统 ,对不同生物来源的胸腺嘧啶核苷酸合成酶进行同源性比较并构建了该基因的系统发育进化树。结果 :WSV TS的氨基酸序列与来自高等生物 ,特别是同哺乳动物有着很高的同源性 ,而与多种病毒的同源性较低。结论WSV ts基因是WSSV基因组中最为保守的基因 ,其进化树的构建对于理解WSSV的进化地位有重要的帮助。

TS在Ⅱ/Ⅲ期SiewertⅡ型食管胃结合部腺癌组织中的表达及与预后的关系

目的:分析Ⅱ、Ⅲ期SiewertⅡ型食管胃结合部腺癌组织中胸腺嘧啶合成酶(TS)的表达水平,进一步探讨其与以5-FU为基础的化疗疗效及预后的相关性。方法:收集36例术后接受5-FU为基础化疗的食管胃结合部腺癌患者,采用RT-PCR方法分析TS mRNA表达水平及与化疗疗效和预后的相关性。结果:肿瘤组织的TS mRNA表达水平(0.820±0.185)明显高于癌旁正常组织(0.468±0.129,P<0.001),在发生淋巴结转移患者中TS mRNA表达(0.960±0.995)明显高于未发生淋巴结转移的患者(0.732±0.172,P=0.001),组织学分化程度越差的患者TS mRNA表达水平越高(P=0.028),TS mRNA高表达的患者生存率均偏低(P<0.05)。结论:Ⅱ/Ⅲ期SiewertⅡ型食管胃结合部腺癌患者的TS mRNA水平升高提示患者预后不良。TS mRNA表达情况对临床上制定个体化的化疗方案具有一定的指导价值。

胸腺嘧啶合成酶调控乳腺癌细胞转移的作用及机制

胸腺嘧啶合成酶(thymidylate synthase,TYMS)是胸苷酸从头合成途径的关键酶,对于DNA合成和修复非常必要.TYMS在多种肿瘤中表达上调与患者的不良预后相关.许多研究证实,高表达TYMS促进了肿瘤生长和化疗抵抗,然而它对于乳腺肿瘤细胞转移的作用目前还存在争议.本研究探讨了TYMS调控乳腺癌细胞转移的作用及机制.通过对网上公开数据库的分析发现,高表达TYMS与患者较短的无转移生存相关.在体外细胞模型中,敲低TYMS的表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、转移及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程.RNA测序数据分析显示,HIF1α-CXCL12-ACKR3通路分子、PLK1和SMAD5在TYMS敲低的MCF-7细胞中表达下调,提示这些分子作为TYMS的下游效应分子介导了TYMS调控的细胞增殖、迁移和EMT.

TS和DPD mRNA对替吉奥治疗晚期胃癌的疗效预测

目的评价晚期胃癌患者外周血中的TS(胸腺合成酶)以及DPD(二氢嘧啶脱氢酶)mRNA的表达对替吉奥化疗疗效的预测作用。方法应用替吉奥治疗晚期胃癌患者34例,对患者外周血中的TS mRNA以及DPD mRNA的表达情况进行检测,并与化疗效果之间的关系进行评价。结果替吉奥治疗有效患者的TS mRNA值为(1.57±0.31),无效患者的TS mRNA值为(2.83±0.43),差异有统计学意义(P<0.05);替吉奥治疗有效患者的DPD mRNA值为(1.15±0.37),无效患者的DPD mRNA值为(0.98±0.22),差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血中TS mRNA低表达的患者对口服替吉奥化疗的敏感性高,疗效较好,但口服替吉奥化疗的疗效与外周血中DPD mRNA的表达情况无显著相关。

一种新型疟疾核酸疫苗生产工艺的初步研究

疟疾是危害人类健康和生命的主要寄生虫病之一,寻找合适的疫苗一直是该病控制的重要方向。在疟疾核酸疫苗方面作了系列尝试,取得较好研究结果,并最终构建了以胸腺嘧啶合成酶基因为筛选标记的、具有大肠杆菌平衡致死特征的新一代疟疾核酸疫苗pThyAAWTE。对影响工程菌高密度发酵的几个因素进行了分析,所优化程序可使工程菌发酵密度达OD60 0 60以上;此外,还对质粒初步纯化过程中的几个重要参数进行了分析,初步结果表明,悬浮液体积(ml) :菌体湿重(g)在2 :1以上,对质粒的得率没有明显影响;碱裂解时间在一定范围内不影响质粒的质量;合适的悬浮液体积/裂解液/中和液比能明显提高质粒产量;用优化程序所提取的质粒其产量与试剂盒提取的量相当。为pThyAAWTE的大规模纯化打下了基础。

5-FU相关代谢酶表达与胃癌化疗敏感性的关系

目的:比较新辅助介入化疗前后胃癌组织内胸腺嘧啶合成酶(thymidylate synthase,TS),二氢嘧啶脱氢酶(dihydropy-midine dehydrogenase,DPD),胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP),亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)等5-FU相关代谢酶表达,探讨其与化疗疗效的相关性。方法:对49例进展期胃癌患者随机分为新辅助化疗手术组(39例)和直接手术组(10例),对胃镜活检及手术后组织标本行实时定量PCR检测其中TS、DPD、TP和MTHFR的表达。结果:新辅助化疗组分为:化疗有效组(27)例和无效组(12例),有效率69.2%;化疗前有效组4种基因的表达水平与无效组相比均低,其中DPD差异较明显(P<0.05);化疗后有效组TS、TP、DPD表达较无效组低50.3%、51.3%和31.2%(P<0.05);有效组TS和TP较化疗前分别下降38.6%和48.7%(P<0.05),而无效组则前后变化不明显(P>0.05)。结论:介入化疗前肿瘤内DPD表达或者介入后TS、TP、DPD表达以及介入前后TS和TP表达变化程度与化疗敏感性相关。

OPRT,DPYD,TS的mRNA水平与胃癌对氟尿嘧啶敏感性的相关性研究

目的:探讨胃癌细胞中乳清酸磷酸核糖转移酶(orotate phosphoribosyltransferase,OPRT)、二氢嘧啶脱氢酶(dihydropy-rimidine dehydrogenase,DPYD)、胸腺嘧啶合成酶(thymidylate synthase,TS)的表达水平对氟尿嘧啶药物敏感性的预测价值。方法:采用ATP生物荧光法检测47例胃癌原代细胞对氟尿嘧啶的体外药物敏感性,RT-PCR法检测胃癌细胞内OPRT、DPYD、TS的mRNA表达水平,并分析胃癌细胞对氟尿嘧啶体外敏感性与这3种酶表达的关系。结果:OPRT的mRNA表达水平为0.74±0.36,DPYD的mRNA表达水平为0.85±0.35,TS的mRNA表达水平为0.57±0.28。药敏指数与OPRTmRNA表达水平呈正相关(rs=0.744,P=0.001);与TSmRNA表达水平呈负相关(rs=-0.375,P=0.009);与DPYDmRNA表达水平呈负相关(rs=-0.159,P=0.287),但无统计学显著性。结论:胃癌细胞中OPRT和TSmRNA的表达水平对氟尿嘧啶药物的治疗敏感性可能具有较好的预测价值。

人胃癌细胞5-氟尿嘧啶耐药机制的研究

目的：探讨人胃腺癌SGC7901／R耐药细胞株产生耐药的机制。方法：以人胃腺癌5-FU耐药细胞株SGC7901／R和其亲本细胞SGC7901为对象，MMT法进行体外药敏实验，：RT-PCR法检测胸腺嘧啶合成酶(TS)，胸腺嘧啶激酶(TK)，乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)，多药耐药相关蛋白(MRP)，多药耐药基因(mdr-1)的转录情况，流式细胞仪测定肿瘤细胞内药物蓄积浓度。结果：SGC7901／R耐药细胞对5-FU耐药性能确切，并对顺铂(DDP)，柔红霉素(DNR)存在不同程度的交叉耐药。TS，mdr-1在耐药细胞SGC7901／R中表达显著增强，TK表达减少，OPRT在两种细胞中表达无显著差别。MRP在两种细胞都没有表达。耐药细胞SGC7901／R内DNR药物蓄积浓度降低。结论：人胃腺癌5-FU耐药细胞株SGC7901／R耐药机制与嘧啶合成途径中重要的酶TS和TK表达的改变相关，5-FU耐药细胞株具有多药耐药(MDR)的特性，这与mdr-1基因翻译的P-糖蛋白的泵功能增强有关。

转染双耐药基因小鼠骨髓细胞对放化疗的作用

[目的]探讨人突变的胸腺嘧啶合成酶(mTS)及双突变的二氢叶酸还原酶(dmDHFR)基因转染给正常小鼠骨髓细胞后,体内和体外是否对小鼠骨髓细胞具有耐受大剂量放疗与化疗的作用。[方法]将mTS及dmDHFR基因通过反转录病毒转染给小鼠骨髓细胞。再将转染后的骨髓细胞输给经致死剂量照射(9Gy)的小鼠,4周后给小鼠大剂量腹腔注射5鄄氟尿嘧啶(5鄄Fu,50mg/kg.d,共5天)和氨甲喋呤(MTX),观察小鼠骨髓造血集落CFU鄄S、白细胞、血小板和存活率。[结果]在骨髓移植后第5周,对照组7只小鼠全部死亡,含单药耐药基因TS组有5只存活,含双耐药基因组6只存活。骨髓移植后第8周,再给小鼠腹腔注射大剂量5鄄Fu(75mg/kg.d,共3天)和MTX(单次300mg/kg),结果单耐药基因组动物全部死亡,双耐药基因组6只动物全部存活,随着时间推移,存活动物的骨髓功能逐渐恢复,白细胞、血小板逐渐升高。骨髓细胞中有耐药克隆(CFU鄄GM)形成,骨髓细胞和CFU鄄S中有相应耐药基因表达。[结论]含有双耐药基因的骨髓细胞对致死剂量照射加5鄄Fu和MTX处理的小鼠有明显的保护作用。

TS、Ki-67及P53在结直肠癌原发灶及转移淋巴结中的表达及与5-FU化疗敏感性的关系

目的探讨结直肠癌原发灶及转移淋巴结中胸腺嘧啶核苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)、Ki-67和p53表达差异性,并探究其对预测5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)敏感性的价值。方法选取有淋巴结转移的结直肠腺癌患者33例,采用免疫组织化学方法检测结直肠癌淋巴结转移灶及原发灶中TS、Ki-67和P53的表达情况。结果TS高表达、p53和Ki-67在转移淋巴结的表达率显著高于原发灶;较好预后的即对5-FU化疗敏感的病例共7例,其中在转移淋巴结及原发癌中TS均为低表达率,p53、Ki-67为阴性表达。结论转移淋巴结中的p53、TS、Ki-67的表达情况同原发灶相比有异质性变化,转移淋巴结TS表达情况可以预测结直肠癌患者对5-FU化疗敏感性,p53的表达情况或许可预测结直肠癌患者对5-FU的化疗敏感性,Ki-67表达与5-FU化疗敏感性的关系仍需要进一步研究。

赛维健杯有奖征文启事

赛维健（注射用雷替曲塞）系喹唑啉叶酸盐类似物,通过抑制胸腺嘧啶合成酶（TS）起抗癌作用,属于细胞毒药物。该药代谢后产生的多聚谷氨酸类化合物比雷替曲塞具有更强的TS抑制作用,抑制肿瘤细胞DNA的合成。1996年,雷替曲塞首先在英国上市,此后在欧洲、非洲、亚洲的28个国家陆续上市。

赛维健杯有奖征文启事

赛维健（注射用雷替曲塞）系喹唑啉叶酸盐类似物,通过抑制胸腺嘧啶合成酶（TS）起抗癌作用,属于细胞毒药物。该药代谢后产生的多聚谷氨酸类化合物比雷替曲塞具有更强的TS抑制作用,抑制肿瘤细胞DNA的合成。1996年,雷替曲塞首先在英国上市,此后在欧洲、非洲、亚洲的28个国家陆续上市。