胸腺素α1抗体的制备和鉴定

目的 :制备用于检测转胸腺素基因蓝藻表达产物的特异性抗体。方法 :用提纯的小肽 (2 8个氨基酸 )胸腺素α1与牛血清白蛋白偶联后作为抗原 ,采用皮下多点注射免疫的方法免疫大鼠。经过 3个月的免疫 ,获得抗Tα的多克隆抗体。结果 :用间接酶联免疫吸附 (ELISA)方法 ,测得抗体效价超过 40 96。蛋白印迹 (Westernblot)检测结果显示 ,该抗体能特异性地与胸腺素α1抗原产生明显免疫亲和反应。结论

口服转胸腺素α1基因聚球藻对小鼠T细胞亚群作用的研究

为探讨口服后转胸腺α1(Tα1)基因聚球藻对T细胞亚群的作用,将小鼠随机分为空白对照组、野生藻组、转化藻(小剂量、中剂量和大剂量)组和日达仙组,用灌服的方式,给予空白对照组20mL·kg^(-1)的生理盐水,野生藻组0.4g·kg^(-1)的野生聚球藻;转化藻小、中、大剂量组,分别0.2g·kg^(-1)、0.4g·kg^(-1)和0.6g·kg^(-1)的转Tα1基因聚球藻;日达仙组则肌注给予3.2mg·kg^(-1)的胸腺素α1(日达仙)。结果表明转Tα1基因藻口服后可显著提高CD3亚群水平,显著提高CD4亚群水平,明显提高CD4/CD8的比值。提示转Tα1基因聚球藻具有增强机体免疫功能的作用。

串联的人胸腺素α1基因在番茄中的高效表达

【目的】提高免疫活性多肽人胸腺素α1(Tα1)在番茄中的表达量。【方法】根据植物偏爱密码子对Tα1基因进行优化,并将其顺式串联成四联体,同时在单体基因间插入肠激酶剪切位点基因序列,以便表达的融合蛋白可以被肠激酶切割成单体。利用农杆菌介导法将单体Tα1基因和四联体Tα1基因分别转化进入番茄。【结果】两个基因转化番茄后分别得到卡那霉素抗性再生植株19株和10株,PCR和Southern杂交检测证明,部分番茄基因组中整合了外源基因。经过Western和ELISA分析,串联的Tα1基因已经在番茄果实中表达,表达量最高相当于20.2μg T α1·g-1果实鲜重,高于单体基因的表达量。【结论】基因串联的方式提高了Tα1基因在番茄中的表达量。

胸腺素α1的Fmoc固相合成法

本文用Fmoc固相方法合成了胸腺素α1。采用对碱敏感的Fmoc作为α -氨基的保护基 ,并确定与之配套的侧链保护策略。探索出了适宜的接肽方案 ,即前 9步接肽用对称酸酐法 ,后 1 8步用DCC -HOBt缩合法 ,从而保证了每步的高缩合率。试验结果表明各步的缩合率均在 96 2 %以上 ,多数达 99%以上。同时还对合成工艺条件进行了研究。合成粗品的纯度 (胸腺素α1的含量 )为 46 52 % (质量分数 ) ,胸腺素收率为 37 81 %

液相色谱法分离纯化固相合成的胸腺素α1

本文为以Fmoc(Nα-芴甲氧羰基 )固相合成法制备的胸腺素α1粗品提出了一条实验室规模的液相色谱法纯化路线 ,共分两步 :第一步采用DEAESepharoseFastFlow填料进行离子交换层析操作 ,分离除去粗品中的大部分杂质 ;第二步用制备型反相高效液相色谱 (用C1 8色谱柱 )进行最后的纯化。终产物纯度可达 95% ,生物活性符合实验指标。

人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达

利用基因工程表达的方法 ,在大肠杆菌中通过与GST蛋白融合的方式高效表达了胸腺素α1前体基因 ,随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式 ,得到了胸腺素前体肽段 31肽和N 端未经乙酰化修饰的 2 8肽。融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的 35 %～ 40 % ,样品肽的产量也达到了约 2 0 0mg L(肽 发酵液 )的产量。经质谱测定 ,分子量分别为 336 6和 30 6 6。BalB C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明 ,所构建的GST Tα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用 ,其中N 端未经乙酰化的 2 8肽产物与 31肽产物活性相近 。

重组胸腺素α1的表达、纯化和生物学活性

为获得重组人胸腺素α1(recombinantthymosinα1,Tα1) ,采用融合表达方式表达Tα1基因 ,重组融合表达载体Tα1 pGEX 4XT 1转化大肠杆菌DE3(lys)构建工程菌 .对工程菌进行补料分批培养并诱导表达 ,得到目的蛋白的可溶性表达 .亲和层析纯化融合蛋白GST Tα1,经凝血酶裂解融合蛋白 ,亲和层析除去GST ,SourceQ离子交换 ,得到Tα1单体 ,得率为 30mg L发酵液 .生物学活性分析显示 ,重组Tα1能显著促进小鼠脾细胞增殖 (P <0 0 1) 。

胸腺素α1对粤黄鸡免疫功能的调节及机理研究

实验研究了不同剂量的胸腺素α1(Tα1)对粤黄雏鸡免疫器官指数、组织学结构、外周血和脾脏中T淋巴细胞增殖转化情况以及脾脏抗体形成细胞的影响。结果表明,低剂量(0.015mg/kg体重)Tα1可显著提高鸡免疫器官指数,可使胸腺髓质小体数和淋巴细胞数增加,皮质增宽;脾脏胸腺依赖区和法氏囊依赖区细胞增加,高剂量(0.06mg/kg体重)Tα1则引起法氏囊髓质细胞变性和坏死。结果提示,一定剂量的胸腺素α1可提高鸡的免疫功能。

重组胸腺素α1的纯化及活性

将胸腺素α1基因 4串体克隆于 pThioHisA融合表达载体 (pThioHisA Tα1④ ) ,转化大肠杆菌TOP10。在IPTG诱导下 ,融合蛋白得到了高效表达。SDS PAGE分析确定诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的 40 % ,且表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。把用离子交换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解 ,经简单的离子交换层析可纯化出胸腺素α1单体 ,HPLC鉴定胸腺素α1的纯度达 98%。利用3 H TdR进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和胸腺素α1单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下 ,刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 ,与化学合成的胸腺素α1相比具有相似的生物活性。

抗胸腺素α1(Tα1)多克隆抗体的纯化及转基因藻中Tα1的检测

采用不同浓度的硫酸铵分级盐析纯化抗Tα1多克隆抗体,然后用不同量的牛血清白蛋白(BSA)与兔抗Tα1抗体进行中和,以去除血清中的抗BSA抗体,并利用纯化后的抗Tα1多克隆抗体检测转基因藻中Tα1.结果表明:采用25%(NH4)2SO4进行分离纯化,并将BSA加入到血清中进行中和,37℃处理30min,BSA的量与血清的比例以1μL血清+15μgBSA可达到中和血清中的抗BSA抗体的目的.获得的抗Tα1抗体效价与未进行分离前基本相同,并且阴性本底低.采用ELISA方法检测野生藻和转基因藻中的Tα1,转基因藻的Tα1OD450值比野生藻的高2.1倍以上,提示Tα1在转基因藻中成功表达.实验证明,此方法能有效纯化抗胸腺素α1多克隆抗体,获得特异性强的抗胸腺素Tα1抗体,并且效价不受影响.

胸腺素α1治疗慢性丙型肝炎的临床荟萃分析

目的研究分析胸腺素α1(thymosin alpha-1,Tα1)对慢性丙型肝炎的治疗作用。方法通过MEDLINE、PUBMED、Blackwell等电子数据库搜寻有关胸腺素α1治疗慢性丙型肝炎的相关资料,加以统计学上的比较、分析、观察及评价其对慢性丙型肝炎的临床治疗效果。结果我们对7个样本共计202例研究胸腺素α1治疗慢性丙型肝炎的随机对照实验进行临床荟萃分析,发现胸腺素α1治疗组的疗效(50%)几乎是对照组(12%)的四倍,在统计学上差别显著。结论胸腺素α1单用或联合其它药物治疗慢性丙型肝炎能取得较好的临床治疗效果,与干扰素和利巴韦林治疗相比较,不仅能有效地减少HCV复制,不良反应少,而且诱导了一个持续的递增的血清ALT复常和HCV RNA的清除。

胸腺素α1间接ELISA测定方法的建立及其在转基因蓝藻中的应用

利用胸腺素α1(Tα1)_小牛血清白蛋白融合蛋白免疫新西兰兔获得的抗体 ,建立了Tα1间接酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,以定量检测转Tα1基因聚球藻7942外源基因表达产物胸腺素α1 ,实验结果表明该方法灵敏度高、专一性强、重复性好 ,可用于转基因微藻Tα1表达量的定量检测 ,同时表明Tα1基因能在聚球藻7942中稳定表达。

胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测

目的:获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法:人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b(+)中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果:Tα1②Mr约为6.3×103,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论:成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.

胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素α1(Thymosin alpha1,TM-α1)与复合α干扰素(IFNα-con)融合蛋白。选择大肠杆菌偏爱的密码子,将合成的TM-α1与IFNα-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)、在宿主菌BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-α1-IFN-con)。表达量占总蛋白的20%以上。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子筛层析后,产品纯度达到96%以上。采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明,融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b和IFNα2a。对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素α1相同。已有研究证实,该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用,其体外抗HBV活性比联合应用TM-α1和干扰素α强,且细胞毒性明显低于联合应用TM-α1和干扰素α。以上结果表明,通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-α1-IFN-con),既具有良好的干扰素α抗病毒作用,也具有胸腺素α1促淋巴细胞增殖作用。

胸腺素α1对急性肝衰竭大鼠血浆TNF-α与IL-10的影响

目的探讨胸腺素α1(Tα1)对急性肝衰竭大鼠血浆TNF-α与IL-10的影响。方法构建急性肝衰竭大鼠模型后分组,干预组大鼠注射Tα1,检测不同时间点大鼠血浆ALT、AST、TBIL含量及血浆TNF-α、IL-10水平,获取的肝组织标本进行HE染色。结果(1)模型组及干预组ALT、AST、TBIL随时间均呈上升趋势,同一时间点,干预组ALT、AST、TBIL明显低于模型组(P<0.05)。(2)模型组及干预组肝组织均出现明显肝组织结构紊乱,肝细胞明显坏死,炎性细胞浸润等急性肝衰竭表现,且两组均随着时间不断加重。同一时间点,干预组肝细胞坏死程度较模型组轻,浸润的炎性细胞也较模型组少。(3)模型组及干预组TNF-α、IL-10均明显高于对照组(P<0.05)。模型组及干预组TNF-α、IL-10随时间均呈上升趋势。同一时间点,干预组TNF-α明显低于模型组;干预组IL-10明显高于模型组。结论 Tα1对急性肝衰竭大鼠具有保护作用,可明显改善肝细胞炎症及坏死,其机制可能与下调炎性细胞因子TNF-α水平,上调抗炎性细胞因子IL-10水平有关。

胸腺素α1治疗慢性重型乙型肝炎患者疗效观察

目的 观察胸腺素α1对慢性重型乙型肝炎患者的存活率及肝功能的影响。方法 3 0例慢性重型乙型肝炎患者分为Tα1治疗组 ( 16例 )和对照组 ( 14例 ) ,观察患者治疗前、治疗中及随访时每周的肝功能及凝血酶原活动度。结果 治疗组存活率为5 6.2 5 % ( 9/16) ,对照组存活率为 2 1.43 % ( 3 /14 ) ,二者有显著性差异 ( χ2 =4.117,P <0 .0 5 )。治疗组治疗前和治疗结束随访第 2周时ALT下降有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;PTA升高亦有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;而AST、ALB、A/G、TCHO差异无显著性 (P >0 .0 5 )。动态检测TBil,在治疗第 1周时治疗组较对照组下降有显著性差异 (P =0 .0 4)。结论 Tαl能显著提高慢性重型乙型肝炎患者存活率 。

胸腺素α1对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤作用的实验研究

目的探讨胸腺素α1(Tα1)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺损伤的保护作用及可能机制。方法雄性SD大鼠24只随机均分为3组:对照组(A组)、重症急性胰腺炎组(B组)、Tα1干预组(C组)。经逆行胆胰管注射5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)复制重症急性胰腺炎SD大鼠动物模型,C组在复制模型前30 min经腹皮下注射Tα1 6 mg/kg,复制模型后12 h处死大鼠。分别测定各组大鼠血清淀粉酶的含量,计算肺湿干比(W/D),Western blot法检测各组肺组织细胞间黏附分子(ICAM-1)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达;观察大鼠胰腺和肺组织病理学改变。结果 B、C组大鼠与A组比较,血清淀粉酶、肺组织ICAM-1及TNF-α的蛋白表达、W/D差异均有统计学意义(P<0.05),B、C组高于A组;C组与B组比较,血清淀粉酶、肺组织ICAM-1及TNF-α的蛋白表达、W/D差异有统计学意义(P<0.05),C组较B组降低,病理损伤较B组轻;A组无明显病理改变。结论 Tα1能够减轻SAP大鼠肺水肿严重程度,降低肺组织ICAM-1及TNF-α的蛋白表达水平,减轻肺损伤,对大鼠肺损伤具有一定的保护作用。

胸腺素α1-胸腺五肽在大肠杆菌中的表达及表达条件优化

目的探讨胸腺素α1-胸腺五肽(Tα1-TP5)在大肠杆菌中的表达及表达条件优化。方法将化学合成的Tα1-TP5基因与原核表达载体pGEX-4T-1融合并转化至E.coliBL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间等条件对融合蛋白表达量的影响。融合蛋白经GST琼脂糖珠亲和色谱纯化及重组肠激酶切割后,电喷雾质谱鉴定Tα1-TP5。结果选用TB培养基,在菌体对数生长中后期加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG,37℃诱导5 h,GST融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的35.8%,且主要以可溶形式表达。Tα1-TP5的分子质量与理论值相似。结论 Tα1-TP5成功在E.coli中表达,并确定了最佳表达条件。

胸腺素α1的基因合成、表达及活性测定

目的 合成胸腺素α1(Tα1)基因并在原核细胞中表达。方法 用半酶半化学合成并克隆Tα1基因 ,将该基因插入表达质粒pGEX 4T 1并在大肠杆菌进行表达 ,对表达的融合蛋白GST Tα1利用亲和层析法纯化 ,再经Thrombin酶切后 ,获得重组Tα1进行生物学活性检测。结果 经测序证实合成的Tα1序列与设计的一致。构建的重组表达载体pGEX 4T 1 Tα1在大肠杆菌中得到高效表达。E玫瑰花结形成试验证明重组Tα1具有生物学活性。结论 合成的Tα1基因在大肠杆菌中表达出具有生物活性的蛋白。

利用植物生物反应器表达胸腺素α1的研究

胸腺素α1是胸腺肽中活性最高的组分,可以提高人体免疫力,通过组织提取或人工合成存在安全隐患和价格昂贵等问题.拟用植物生物反应器,转基因模式植物烟草表达胸腺素α1.通过已构建的植物双元载体p35S-2300-twin T-DNAs::Ta4::noster用农杆菌介导法转化烟草,在卡那霉素筛选压为50 mg/L时获得抗性烟草165株,经PCR和Southern blot分析证实,获得了17株独立转基因苗,阳性率10.30%,外源基因拷贝数为1-7个.还对利用含"twin T-DNA"植物双元表达载体转化烟草T0代的Tα4和nptII分别整合现象以及植物生物反应器生产胸腺素的前景进行了讨论.